陳麗川，段 波，喻 昭，馬志毅，孟倩文

（武漢市中醫(yī)醫(yī)院 風濕病科針灸科，武漢 430050）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）作為一種常見的炎癥性關節(jié)炎，主要表現(xiàn)為關節(jié)疼痛和僵硬，伴隨終生的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)高達1%［1］，其診斷標準包括至少一個關節(jié)有明確的腫脹［2］。 RA的主要特征是炎癥途徑導致的關節(jié)滑膜細胞增殖，形成的血管翳可能導致軟骨的破壞和骨質(zhì)的侵蝕，促炎因子大量產(chǎn)生更加促進了這一過程的發(fā)生［3］。在RA 患者治療中，兩種或兩種以上的抗風濕藥物聯(lián)合治療比單藥治療更有效，但是兩種以上的生物制劑的使用會帶來很大的不良反應風險。

穴位埋線（acupoint catgut embedding，ACE）是現(xiàn)代針灸的一種，是指用無菌鑷子將腸線（1.0 ～1.5 cm）放入一次性無菌針的針尖，腸線與針尖內(nèi)緣平行，針頭隨針用鈍針，將消毒過的針頭插入消毒過的穴位，將針刺針推入片刻，取出無菌針，將腸線留在穴位［4－5］。 穴位埋線結(jié)合了針灸和穴位的優(yōu)點，對穴位和機體產(chǎn)生全面持久的作用，此方法價格低廉，療效持久，臨床上被廣泛應用。 研究證明，在與炎癥反應有關的急性呼吸窘迫綜合征研究中，通過穴位埋線治療降低了白細胞介素－6（interleukin 6，IL-6）水平，抑制了促炎細胞因子的產(chǎn)生［6］。 Lu等［7］總結(jié)發(fā)現(xiàn)，在治療以腸道炎癥為主的潰瘍性結(jié)腸炎疾病中，通過穴位埋線治療效果更持久，愈合所需時間更短。 目前也有很多研究通過穴位埋線能夠有效治療RA，但是對其機制研究尚不明確。

此外，程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）信號缺失或被阻斷可以導致一系列自身免疫性疾病，而腫瘤壞死因子受體超家族成員4（tumor necrosis factor receptor superfamily member 4，OX40）信號敲除或被阻斷則對自身免疫性疾病有治療作用。 PD-1 和OX40 共刺激信號失衡可促進RA 疾病的進展［8］。 因此，本研究通過建立RA 模型大鼠，對大鼠穴位埋線和給藥治療，從炎癥因子、滑膜形態(tài)以及流式檢測PD-1／OX40 及分化決定族抗原4（CD4）／T 細胞特異性表面糖蛋白（CD28）細胞含量方面，進一步探討穴位埋線在RA 中可能作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD 大鼠，SPF 級，雌性，8 周齡，體重150 ～180 g，共25 只，來源于三峽大學［SCXK（鄂）2022－0012］，在武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司無特定病原體（specific pathogen free，SPF）條件下飼養(yǎng)［SYXK（鄂）2018－0104］。 所有動物實驗均由華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司倫理委員會審批（HLK-20200110-001）。 實驗過程嚴格按照3R 原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

來氟米特（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，L129518）；戊巴比妥鈉和完全弗氏佐劑（美國sigma 公司，P3761、F5881）；IL-6 和白細胞介素－8（interleukin 8，IL-8）ELISA 試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司，RA20607）；二甲苯（北京沃凱生物科技有限公司，40091060）；蘇木素和伊紅（北京碧云天生物科技有限公司，C0107 和C0109）；大鼠全血單個核細胞分離液KIT（上海微科生物技術(shù)有限公司，LDS1080）；所有抗體PD1（PAB47902）、OX40（PAB47968）、 GAPDH （PAB36269） 和Goat anti-Rabbit IgG（SAB43714）均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。 可吸收縫合線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療，66V1228A）；埋線針（高冠醫(yī)械，20162271059）；酶標儀（芬蘭雷勃，MK3）；電泳儀（Bio-Rad，mini protean 3 cell）；全自動化學發(fā)光分析儀（上海天能，Tanon-5200）；流式細胞儀（艾森，NovoCyte）；倒置熒光顯微鏡（Leica 公司，MIL LED）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

將動物按照隨機數(shù)字表（由SPSS17.0 程序生成）隨機分為5 組，每組5 只。 對照（control）組：造模后第10 天開始予以等劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)42 d。 模型（model）組：造模后第10 天開始予以等劑量 生 理 鹽 水 灌 胃， 連 續(xù) 42 d。 來 氟 米 特（Leflunomide）組：造模后第10 天開始予以大鼠灌胃來氟米特量為10 mg／（kg·d），灌胃劑量1 mL／100 g，連續(xù)42 d。 穴位埋線（acupoint catgut embedding，ACE）組：按照上述造模過程，造模后第10 天進行穴位埋線，處理42 d，埋線3 次。 穴位埋線＋來氟米特（ACE＋Leflunomide）組：造模后第10 天開始予以大鼠灌胃來氟米特量為10 mg／（kg·d），灌胃劑量1 mL／100 g，連續(xù)42 d，并進行上述穴位埋線操作。

將各組大鼠右后足趾皮下注射完全弗氏佐劑（complete Freund’s adjuvant，CFA）0.1 mL 致炎。 其中對照組按照造模過程注射等量PBS。

1.3.3 穴位埋線

實驗前動物禁食不禁飲12 h。 以3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠。 背部、右后腿剃毛后消毒備用。 參照文獻進行穴位埋線［9］，定位雙側(cè)“足三里”“腎腧”?！澳I腧”位于第二腰椎下兩旁，左右各一穴，“足三里”位于膝關節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm 處。將大鼠俯臥位固定，將9 號針頭（含0.8 cm 長無菌羊腸線），刺入已消毒的雙側(cè)“足三里”和“腎腧”，將腸線完全置入穴內(nèi)。 操作完成后使用碘伏消毒創(chuàng)面。

1.3.4 取材

用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取抗凝新鮮全血用于細胞流式檢測；血清用于ELISA 檢測；滑膜組織用于病理HE 染色。

1.3.5 關節(jié)炎指數(shù)

參照前期方法［9］，每7 d 對大鼠進行關節(jié)炎評分。 其標準見表1。

劉芒也是頑固的排外派，認為大量的外來人口讓人看著就很討厭，把他們原來的家園搞的亂七八糟，所以他制定了一個規(guī)矩，只要是當?shù)厝藨{借一口當?shù)卦捜ツ抢锍燥埦涂梢源蛭逭?，劉芒的老婆卻是個包容派，她認為本來就沒有什么永遠的家園，那都只是人類遷徙過程里的落腳處，只是落腳的時間長短不一而已，她為了讓外地人更好的融入這里，開了一個收費培訓班，專門培訓外地人說當?shù)卦?。他們這樣一個組合真是非常奇怪，實在是無法計算他們的家庭總收入到底會多一點呢還是少一點。

表1 關節(jié)炎評分標準Table 1 Arthritis scoring standard

1.3.6 炎癥因子檢測

采用ELISA 試劑盒測定大鼠血清中的IL-6 和IL-8 水平，其測定步驟嚴格按照按照試劑盒說明書進行，通過標準品的稀釋，加樣，加酶及溫育，洗滌，顯色，最終加入終止液，在450 nm 波長依序測量各孔的吸光度，計算IL-6 和IL-8 的濃度。

1.3.7 滑膜組織病理檢測

將樣本經(jīng)過脫鈣、浸蠟及包埋、切片（3 μm）、烤片后進行HE 染色，并采集樣本相關部位。 根據(jù)炎癥滑膜中的三大類細胞群（定居細胞群、遷移細胞群和內(nèi)膜細胞群）對HE 染色進行定量評分［10］。 評分范圍依次為0 分（正常）、1 分（輕度）、2 分（中度）、3 分（重度）。 將3 種炎癥特征的參數(shù)進行匯總，總分0～1 分表示正常，炎癥級別為0；總分2 ～3分為輕度滑膜炎，炎癥級別為1；總分4～6 為中度滑膜炎，炎癥級別為2；總分7 ～9 分為重度滑膜炎，炎癥級別為3。

1.3.8 流式檢測

分離大鼠外周血單個核細胞進行流式檢測。取各組樣本，1×106個細胞，100 μL PBS 重懸后，每管加入2 μL OX40-APC、CD4-PerCP-eFluor 710 和CD28-PE 抗體，4℃避光孵育30 min；加入2 mL PBS洗滌1 次，4℃400 r／min，離心5 min，棄上清液；加入1 mL 4%多聚甲醛室溫固定30 min；用1 mL PBS洗2 次，每次3 min，棄去PBS；加入200 μL 用PBS 1 ∶200 稀釋后的抗體PD-1，室溫孵育1 h，用1 mLPBS 洗2 次，每次5 min，棄去PBS；加二抗稀釋液：加入200 μL 用PBS 1 ∶200 稀釋后的二抗，37℃，孵育1 h；用1 mL PBS 洗2 次，每次5 min，棄去PBS；400 μL 的PBS 重懸細胞，4℃避光保存，上機檢測，使用NovoCyte 分析軟件分析實驗結(jié)果。

1.3.9 Western blot

取各組樣本，采用蛋白抽提試劑盒提取不同組別細胞總蛋白。 采用BCA 法測定蛋白濃度。 采用SDS-PAGE 電泳分離總蛋白，每道孔上樣50 μg 總蛋白質(zhì)。 電泳2 h 后，采用濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，4℃孵育一抗PD1（1 ∶1000）、OX40（1 ∶1000）過夜，次晨采用TBST 漂洗膜，加入HRP 標記的二抗Goat anti-Rabbit IgG（1 ∶20 000），37℃孵育1 h，ECL 顯影，保存圖像，采用Quantity One 側(cè)光密度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用平均數(shù)±標準差（±s）表示。 多組間比較使用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD 檢驗。 以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 模型鑒定

對照組大鼠的足均正常（圖1），跖骨和足骨形態(tài)規(guī)則，而模型組大鼠右后足出現(xiàn)明顯紅腫，炎癥嚴重，跖骨和足骨出現(xiàn)多處紅斑，足趾明顯腫脹，大鼠行走受限。 此模型構(gòu)建成功。

圖1 大鼠模型的鑒定Figure 1 Identification of rat model

2.2 關節(jié)炎指數(shù)

在大鼠免疫后每7 d 進行1 次關節(jié)炎評分，結(jié)果如圖2 所示，在第7 天除對照組外，各組大鼠踝關節(jié)至跖骨處或掌關節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹，在第14天時除對照組外，各組大鼠炎癥加重，炎癥因子評分均在3 分以上，在14 d 以后模型組評分沒有明顯的變化，但是來氟米特組、穴位埋線組和穴位埋線＋來氟米特組炎癥因子評分開始下降。 在第49 天時，與對照組比較，模型組炎癥因子評分顯著升高；與模型組比較，來氟米特組、穴位埋線組和穴位埋線＋來氟米特組炎癥因子評分明顯下降，且穴位埋線＋來氟米特組最低。

注：與對照組相比， ＃＃P＜0.01；與模型組相比， **P＜0.01。圖2 各組關節(jié)炎指數(shù)Note.Compared with control group， ＃＃P ＜0.01.Compared with model group， **P＜0.01.Figure 2 Arthritis index of each group

2.3 血清中炎癥因子水平

模型組與對照組比較（圖3），大鼠血清中IL-6、IL-8 含量均顯著升高（P＜0.01）。 與模型組比較，來氟米特組、穴位埋線組和穴位埋線＋來氟米特組大鼠血清中IL-6、IL-8 的含量均顯著下降（P＜0.01）。

注：與對照組相比， ＃＃P＜0.01；與模型組相比， **P＜0.01。圖3 各組大鼠血清中IL-6、IL-8 的含量Note.Compared with control group， ＃＃P＜0.01.Compared with model group， **P＜0.01.Figure 3 Contents of IL-6 and IL-8 in serum of rats in each group

2.4 組織病理形態(tài)觀察

對大鼠滑膜組織進行HE 染色（圖4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠的關節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)正常，模型組大鼠滑膜組織遭到破壞，有大量的炎癥細胞浸潤，血管擴張，纖維細胞增生，在進行來氟米特和穴位埋線處理后大鼠滑膜組織中炎癥細胞浸潤明顯降低，血管增生被抑制，且在來氟米特和穴位埋線共同作用時效果最明顯。 此外，與對照比較，模型組評分顯著升高（P＜0.01）。 與模型組比較，來氟米特組、穴位埋線組和穴位埋線＋來氟米特組評分顯著降低（P＜0.01）。

注：與對照組相比， ＃＃P＜0.01；與模型組相比， **P＜0.01。圖4 大鼠滑膜組織HE 染色Note.Compared with control group， ＃＃P＜0.01.Compared with model group， **P＜0.01.Figure 4 HE staining of rat synovium

2.5 流式檢測

流式檢測的大鼠血中PD-1／OX40 及CD4／CD28 細胞含量（圖5），與對照組比較，模型組中大鼠的PD-1 和CD4／CD28 細胞含量顯著增加（P＜0.01），OX40 顯著降低（P＜0.01）。 與模型組比較，穴位埋線組和穴位埋線＋來氟米特組的PD-1 和CD4／CD28 細胞含量顯著降低（P＜0.01），OX40 顯著增加（P＜0.05）。 如圖6 所示，通過Western blot檢測相關通路的變化，與對照組比較，模型組PD-1的蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.01），OX40 的蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.01）。 與模型組比較，來氟米特組、穴位埋線組和穴位埋線＋來氟米特組PD-1 的蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.01），OX40 的蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.01）。

注：與對照組相比， ＃＃P＜0.01；與模型組相比， *P＜0.05，**P＜0.01。圖5 流式檢測PD-1／OX40 及CD4／CD28 細胞含量Note.Compared with control group， ＃＃P＜0.01.Compared with model group， *P＜0.05，**P＜0.01.Figure 5 Flow cytometry detection of PD-1／OX40 and CD4／CD28 cell

注：與對照組相比， ＃＃P＜0.01；與模型組相比， **P＜0.01。圖6 通過Western blot 檢測PD-1 和OX40 的蛋白表達Note.Compared with control group， ＃＃P＜0.01.Compared with model group， **P＜0.01.Figure 6 Detection of protein expression of PD-1 and OX40 by Western blot

3 討論

RA 是一種慢性的炎癥性關節(jié)疾病，可導致不可逆的關節(jié)損傷和嚴重殘疾，在過去的幾年里，在RA 治療方面已經(jīng)取得了很大的進展，但其治療機制尚不明確［11］。 而且，仍有一部分的患者對這些治療并沒有得到有效的反應。 基于目前對穴位埋線的研究發(fā)現(xiàn)，穴位埋線不僅能夠有效治療多種疾病，而且還彌補了傳統(tǒng)針灸治療周期長和刺激時間短的缺點［12－14］。 李小蘭等［15］研究發(fā)現(xiàn)，通過穴位埋線聯(lián)合西藥治療類風濕關節(jié)炎，結(jié)果實現(xiàn)其治療效果顯著改善。 本研究中，通過對大鼠的關節(jié)炎評分發(fā)現(xiàn)，穴位埋線和來氟米特治療后，大鼠的關節(jié)炎指數(shù)明顯降低。 在RA 發(fā)病機制中，活化的T 細胞產(chǎn)生炎性細胞因子刺激巨噬細胞和單核細胞。本研究中，在RA 治療中通過穴位埋線能夠顯著降低大鼠血清中IL-6、IL-8 的含量，緩解了大鼠關節(jié)炎癥，通過HE 染色觀察滑膜組織發(fā)現(xiàn)，在穴位埋線后大鼠滑膜關節(jié)的損傷明顯的得到緩解。

程序性死亡受體1（PD-1），是一種重要的免疫抑制分子，負責T 細胞的激活增殖和細胞毒性的分泌［16］。 在慢性感染期間，PD-1 由于失去甲基化啟動子而在耗盡的CD8 細胞中表達［17］。 在一項研究中表明，與健康者比較，三名HL 患者腫瘤浸潤性T細胞中的PD-1 水平顯著升高［18］。 PD-1 能夠向下調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)對人體細胞的反應，以及通過抑制T細胞炎癥活動來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。 OX40 是一種有效的共刺激受體，能夠增強T 淋巴細胞表面的T 細胞受體信號，是能被特異性識別的信號［19］，其主要由T 細胞表達，并在CD4＋T 細胞上的表達較高［20］，能夠增強T 細胞對效應分子和細胞因子的增殖和表達，對促炎細胞因子的產(chǎn)生有明顯的抑制作用。

之前有研究證明，PD-1 的缺失或阻斷可導致自身免疫性疾?。?1］，而OX40 信號對自身免疫性疾病具有治療作用［22］。 Ma 等［23］發(fā)現(xiàn)，具有高水平的OX40 和低水平的PD-1 會使晚期胰腺導管腺癌患者具有更長的生存時間。 本研究中，在穴位埋線和給予來氟米特后OX40 的含量顯著增加，CD4＋CD28＋和PD-1 細胞含量顯著下降；而RA 模型組中OX40＋的含量最低，CD4＋CD28＋和PD-1 細胞含量較高。 我們推測這是在RA 病理中可能存在PD-1 和OX40 共刺激信號的不平衡，使CD4＋T 細胞異常激活，從而導致自身免疫。 共刺激分子PD-1 和OX40分別屬于免疫球蛋白家族和TNF 家族，均在CD4＋T細胞的激活直接具有重要的作用，其異常信號與多種自身免疫性疾病有關［9］。

綜上所述，本研究采用CFA 誘導構(gòu)建RA 模型，通過實驗進行穴位埋線和來氟米特治療后，能夠明顯降低RA 的炎癥程度，其作用機制可能與調(diào)控PD-1／OX40 信號通路有關。