惠建萍 張耀之 劉海濤 王軍 李龍梅* 沈舒文

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712046;2.濟(jì)源市第二人民醫(yī)院,河南 濟(jì)源 454650;3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712000)

胃癌(gastric carcinoma,GC)是全球最常見的四種惡性腫瘤之一,每年全世界約有99萬人被診斷為GC,其中約73.8萬人死亡,晚期胃癌的中位存活率不到12個月,至今仍成為威脅人類健康的一大問題[1]。在我國,胃癌患者5年生存率為49.48%,其高發(fā)病率、低生存率、預(yù)后較差,嚴(yán)重威脅人類身心健康、生命安全[2]。胃癌的發(fā)生,常經(jīng)歷多年的胃癌前病變(gastric precancerous lesions,PLGC),胃癌前病變是胃癌的“黃金轉(zhuǎn)折點”,早期防治胃癌,關(guān)鍵是如何正確應(yīng)對胃癌前病變以及胃癌前狀態(tài)[3]。胃癌前病變(PLGC)是指胃部易發(fā)生癌變的病理組織學(xué)改變,包括腸上皮化生(Intestinal Metaplasia,IM)和異型增生(Dysplasia,Dys)或上皮內(nèi)瘤變(intraepithelial neoplasia,IN)。關(guān)于胃癌的形成,已被廣泛接受的是Correa模式:正常胃黏膜-慢性淺表性胃炎-慢性萎縮性胃炎-腸上皮化生-異型增生-胃癌。輕、中度Dys及腸化可進(jìn)展為重度異型增生或重度腸化甚至癌變,也可逆轉(zhuǎn),一項研究顯示上皮內(nèi)瘤變消退占60.7%、病變穩(wěn)定占33.7%、病變進(jìn)展占5.6%,具有有一定的癌變潛能[4-6]。到目前為止,胃癌的確切病因及發(fā)病機(jī)制還不完全清楚,因此實施一級預(yù)防幾無可能。因此慢性萎縮性胃炎腸上皮化生和異型增生是阻擊胃癌發(fā)生的重要戰(zhàn)場,所以如何阻斷PLGC是胃癌二級預(yù)防的重要手段之一。及早識別和控制胃癌前病變向胃癌發(fā)展是防治胃癌的重要途徑。在我國中醫(yī)藥治療PLGC可在很大程度上逆轉(zhuǎn)IM和Dys,在防治PLGC方面已初步彰顯其顯著的優(yōu)越性和廣闊的發(fā)展前景。本實驗旨在對PLGC大鼠組織MAD2與HSP27的表達(dá)進(jìn)行研究,揭示金果胃康膠囊治療PLGC的作用機(jī)理。

A.空白組;B.模型組;C.金果胃康高劑量組;D.金果胃康中劑量組;E.金果胃康低劑量組;F.維酶素組

A.空白組;B.模型組;C.金果胃康高劑量組;D.金果胃康中劑量組;E.金果胃康低劑量組;F.維酶素組

1 儀器與材料

1.1儀器 TB-718EL生物組織自動脫水機(jī)(湖北泰維公司);R136輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國Leica公司);電熱式恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE);DMshare圖像采集顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2試藥 金果胃康膠囊由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心制成,含半枝蓮、枸橘、朱砂七、太子參等藥,每粒相當(dāng)于原生藥2.5 g。維酶素片由新鄉(xiāng)恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司提供,批號:20160412。甲基硝基亞硝基胍(MNNG)由東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn),批號:NH8JH-QD。兔抗大鼠多克隆HSP27抗體(批號:bs-0730R),兔抗大鼠多克隆MAD2抗體(批號:bs-5731R),北京博奧森生物技術(shù)有限公司;兔IgG—免疫組化試劑盒(SABC即用型)(批號:SA1022),DAB顯色試劑盒(批號:AR1022),檸檬酸鹽沖液,PBS磷酸鹽緩沖液,湖北省武漢市博士德生物技術(shù)公司;蘇木素染液(批號:G1140),伊紅染液(批號:G1100),北京索萊寶科技有限公司;

1.3實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠85只,體重180～220 g,室溫為22 ℃～25 ℃,相對溫度45%～60%。動物合格證編號:SCXK(陜)2021-003,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。

2 方法

2.1實驗動物分組及PLGC模型復(fù)制 參照文獻(xiàn)[7-10],形成具體造模方案:大鼠購回適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,85只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)取分2組:空白對照組10只和造模組75只。除空白對照組每天自由飲水外,造模組予以:①170 μg·mL MNNG自由飲用,同時下午灌胃170 μg·mL MNNG溶液,每只灌液10 mL·kg-1。②造模期間采取饑餓無常(每進(jìn)食2 d,再禁食1 d,進(jìn)食日自由食用,禁食日停MNNG,自由飲用0.1%氨水,并在禁食當(dāng)天下午50%乙醇按每只10 mL·kg-1灌胃。灌胃前后禁食禁水1 h。每周用鉗子夾住大鼠尾部1次,使之保持激怒、爭奪狀態(tài),持續(xù)10 min,持續(xù)12 w;上述各組均以混合飼料喂養(yǎng)12 w。并于造模結(jié)束前隨機(jī)抽取造模組大鼠5只進(jìn)行胃黏膜病理形態(tài)學(xué)檢查,其中4只在光鏡下出現(xiàn)腸上皮化生和異型增生為造模成功。

造模結(jié)束后,將造模組剩余70只再次按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組,每組14只大鼠,分別為模型對照組、金果胃康膠囊大、中、小劑量組,維酶素組。加上空白對照組10只大鼠。

2.2動物給藥方法 除空白對照組10只大鼠每天自由飲水外,模型組給予2 mL生理鹽水,其余4組根據(jù)《人和動物間按體表面積折算的等效計量比值表》得出大鼠給藥的等效劑量(等效劑量=成人1 d劑量×0.018×5),給予相應(yīng)的藥物灌胃治療。維酶素組給予維酶素混懸液2 mL灌胃(含維酶素0.034 g),金果胃康大中小劑量組每日灌胃2 mL(各含生藥3.334 g、1.667 g、0.834 g),每天上午灌胃1次,連續(xù)12 w。

2.3標(biāo)本收集及處理 處死大鼠前將禁食禁水24 h后,腹部注射10%水合氯醛(約3 mL·kg-1),剖腹取胃,沿胃大彎剪開,蒸餾水清洗后,然后剪取胃體部一塊組織,將其置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后,組織常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,HE染色光鏡下觀察胃黏膜病理變化及免疫組化染色。

2.4HSP27、MAD2免疫組化染色步驟 免疫組織化學(xué)采用常規(guī)SABC法,操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。用已知陽性切片(由試劑公司提供)做陽性對照,用PBS液代替一抗作陰性對照。

2.5結(jié)果判定

2.5.1病理診斷評定標(biāo)準(zhǔn)及病理分級標(biāo)準(zhǔn) 參照2006年上海全國第二屆慢性胃炎共識會議通過的《中國慢性胃炎共識意見》進(jìn)行診斷及分類。

2.5.2免疫組織化學(xué) 光學(xué)顯微鏡下以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色或棕黑色顆粒為陽性細(xì)胞。每張切片任意選擇5個100倍視野,采用Image-Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行分析處理,測量每個視野光度值,計算平均光密度。

2.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包建立數(shù)據(jù)庫,計量資料將采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各組間的差異比較采用單因素方差分析,取雙側(cè)P<0.05為顯著性檢驗水準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1一般情況觀察 SD大鼠共85只,分空白組10只和造模組75只,造模結(jié)束后抽取造模組5只老鼠驗證造模是否成功,剩余80只大鼠;藥物干預(yù)期間模型組、維酶素組各死亡2只,金果胃康高、低劑量組各死亡1只,故最后剩余74只大鼠進(jìn)行實驗結(jié)果分析。

實驗過程中,空白組大鼠被毛純凈濃密,光澤度好,雙目靈活,反應(yīng)敏捷喜動,進(jìn)食正常,體重逐漸增加,大便有形呈顆粒狀。其余各組大鼠均有不同程度病態(tài)表現(xiàn):毛色逐漸變黃變暗,無光澤,精神萎靡,雙眼無神,反應(yīng)遲緩,扎堆不喜活動,食量逐漸減少,大便不成形,形體逐漸消瘦,背上弓,個別大鼠因營養(yǎng)缺乏,機(jī)能衰竭而死亡。經(jīng)治療后,大鼠的一般狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)。各治療組比正常對照組略差,但明顯優(yōu)于模型組。各治療組較維酶素組狀態(tài)好,以金果胃康中劑量組大鼠狀態(tài)恢復(fù)最好。

3.2各組病理組織學(xué)觀察 光鏡下觀察空白組胃黏膜結(jié)構(gòu)正常,層次清楚、完整,腺體排列緊密、規(guī)則,未見炎細(xì)胞浸潤;模型組胃黏膜呈不同程度的萎縮,黏膜層變薄、充血、水腫,嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤,腺體排列紊亂,部分腺體囊性擴(kuò)張,上皮細(xì)胞增生,并可見黏膜部分區(qū)域出現(xiàn)上皮化生及異型增生,細(xì)胞核大、深染;其他用藥組胃黏膜層變薄,未見充血及水腫,萎縮、腸上皮化生、異型增生程度均有明顯減輕和緩解,其中金果胃康中劑量組效果最好,其次依次是金果胃康大劑量組、維酶素組、金果胃康小劑量組(圖1)。

3.3免疫組化結(jié)果 染色結(jié)果:各組免疫組化染色結(jié)果陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕黃色或褐色。

3.3.1HSP27實驗結(jié)果 空白組大鼠胃黏膜可見染色最輕,細(xì)胞染色數(shù)目最少,金果胃康中劑量組與其余各組相比大鼠胃黏膜可見染色較輕,染色數(shù)目較少,模型組染色最重,模型組細(xì)胞染色數(shù)目最多(見圖2)。

與空白組比較,模型組大鼠胃黏膜HSP27表達(dá)水平顯著上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,金果胃康膠囊高、中、低劑量組與維酶素組大鼠HSP27表達(dá)水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與金果胃康膠囊中劑量組比較,金果胃康膠囊高、低劑量組與維酶素組大鼠HSP27表達(dá)水平較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);低劑量組與維酶素組相比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠胃黏膜HSP27檢測結(jié)果

3.3.2MAD2實驗結(jié)果 空白組大鼠胃黏膜可見染色最輕,細(xì)胞染色數(shù)目最少,金果胃康中劑量組與其余各組相比大鼠胃黏膜可見染色較輕,染色數(shù)目較少,模型組染色最重,模型組細(xì)胞染色數(shù)目最多(見圖3)。

與空白組比較,模型組大鼠胃黏膜MAD2表達(dá)水平顯著上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,金果胃康膠囊高、中、低劑量組與維酶素組大鼠MAD2表達(dá)水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與金果胃康膠囊中劑量組比較,金果胃康膠囊高、低劑量組與維酶素組大鼠MAD2表達(dá)水平較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);低劑量組與維酶素組相比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠胃黏膜MAD2檢測結(jié)果

4 討論

中醫(yī)學(xué)將PLGC歸為“胃痞”“胃脘痛”等病證范疇。一般以CAG常出現(xiàn)的胃脘脹滿、疼痛、燒心、嘈雜、口苦、納差等癥狀為主要表現(xiàn),又因人、因病理階段而異而臨床表現(xiàn)不同。沈舒文[11]認(rèn)為PLGC病變過程中具有因邪致虛,因虛致邪的轉(zhuǎn)化特點,其邪實是導(dǎo)致其虛,乃至損傷胃黏膜致腸上皮化生的直接病理因素,邪實的病理特征是濕熱久藴為毒,因毒致瘀,毒瘀交阻。毒瘀交阻是發(fā)生PLGC的病機(jī)關(guān)鍵,故治療本病,不論病程中正邪如何變化,始終抓住毒與瘀這個根本性病理治療,扶正兼治毒瘀,祛邪更需圍繞毒瘀,予以解毒化瘀。

金果胃康膠囊是國家級名中醫(yī)建設(shè)項目沈舒文教授以解毒化瘀,行氣散結(jié)為治療原則的胃癌前病變經(jīng)驗方。本方由半枝蓮、朱砂七、枸橘、太子參四味藥組成。君藥半枝蓮具清熱解毒,活血化瘀作用,針對主要病機(jī),清解滋胃毒邪,消散胃絡(luò)凝瘀。半枝蓮抗腫瘤已經(jīng)成為現(xiàn)代研究的主要方向[12],半枝蓮抗腫瘤的主要成分為黃酮類以及多糖類,黃酮類主要作用可以改善腫瘤生長的微環(huán)境,抑制腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。張鋒等[13]通過研究證實TF-SB可抑制胃癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并提高其放療敏感性。半枝蓮多糖具有多種藥理活性,可作為一種免疫調(diào)節(jié)劑激活免疫系統(tǒng),具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、延緩衰老和抑制腫瘤等功效[14]。抗腫瘤作用主要通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖,抑制腫瘤細(xì)胞血管的生成與轉(zhuǎn)移,調(diào)節(jié)免疫以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡等多種途徑共同實現(xiàn)[15]。

臣藥朱砂七,為治療胃癌的太白七藥之一,其功效之一清熱解毒,增強(qiáng)君藥的解毒作用;其二活血涼血,散瘀止痛,助君藥消散胃絡(luò)凝瘀,且增強(qiáng)本方的止胃痛作用?，F(xiàn)代藥理研究朱砂七可影響腫瘤細(xì)胞的糖代謝,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤的作用,防止腫瘤發(fā)展[16]。佐藥枸橘是具有抗癌作用的理氣草藥,具有行氣散結(jié)功效,《全國中草藥匯編》記載本品具有“健胃消食,行氣止痛”作用,現(xiàn)代藥理研究枸橘具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,研究表明,枸橘主要成分枸橘苷激活外源性凋亡通路抑制腫瘤細(xì)胞增長,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[17-18]。又因PLGC的發(fā)生,多以氣陰兩虛為發(fā)病基礎(chǔ),即毒瘀交阻多發(fā)生在氣陰兩虛的基礎(chǔ)上,故佐以太子參益氣養(yǎng)陰,補(bǔ)益脾胃,現(xiàn)代藥理研究表明太子參主要成分太子參環(huán)肽具有抗疲勞、增強(qiáng)免疫、抗菌、抗氧化、抗病毒等作用,可抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展[19]。四味藥物合用,共奏解毒化瘀,行氣散結(jié)之功,針對毒瘀交阻,胃氣郁結(jié),毒瘀并治,行氣散結(jié),可消除因毒瘀交阻滯胃礙氣的癥狀,恢復(fù)胃主和降的功能。在前期臨床試驗中發(fā)現(xiàn)在金果胃康膠囊基礎(chǔ)上確立組方用藥的治療組有效率82.42%,對照組有效率68.97%,治療組療效優(yōu)于對照組,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)[11]。

近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白在胃癌中過度表達(dá),參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、分化及預(yù)后等方面。熱休克蛋白(heat shock protein,HSP),又稱應(yīng)激蛋白,是指生物細(xì)胞在生理應(yīng)激或病理狀態(tài)以及各種環(huán)境因素的刺激下使基因被激活,細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)合成的,且高效表達(dá)的一組進(jìn)化上高度保守的胞質(zhì)蛋白質(zhì)。通過促進(jìn)新合成蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確折疊和變性蛋白質(zhì)的重折疊來參與蛋白質(zhì)質(zhì)量控制[20]。HSP27(heat shock protein 27,HSP27)是小分子HSP亞家族中重要的一員,參與了細(xì)胞的增殖、分化以及細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié),與腫瘤關(guān)系密切,目前研究證實,HSP27與胃癌的發(fā)生關(guān)系密切,在胃癌的表達(dá)、形成、增殖、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及腫瘤免疫中具有非常重要的作用。研究顯示HSP27在胃癌中的表達(dá)率為85%,而在慢性非萎縮性胃炎和慢性萎縮性胃炎中的表達(dá)率分別為5%和35%[21]。HSP27的高水平也與胃癌和結(jié)直腸癌的進(jìn)展期、不良生存率和預(yù)后有關(guān)。研究表明高水平的血清HSP27可能是評估胃癌的有用標(biāo)記物[22]。

現(xiàn)代細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究表明,染色體不穩(wěn)定性(Chromosomal Instability,CIN)是所有癌前細(xì)胞和癌細(xì)胞的本質(zhì)特征,是腫瘤發(fā)生發(fā)展和異質(zhì)性的發(fā)動機(jī)。CIN是指癌細(xì)胞較之于正常細(xì)胞出現(xiàn)的染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常。絕大多數(shù)腫瘤表現(xiàn)為CIN,細(xì)胞周期檢查點紊亂、染色體分離、DNA損傷反應(yīng)及端粒功能的缺陷或喪失等多種細(xì)胞功能障礙都可導(dǎo)致發(fā)生CIN[23]。染色體正確分離過程中有一個由檢查點蛋白(Checkpoint Protein,CP)組成的監(jiān)控體系,能準(zhǔn)確地識別紡錘體微管與染色體動粒的連接,從而保證染色體的正常分離。有絲分裂阻滯缺陷蛋白2(Mitotic Arrest Deficient 2,MAD2)是的關(guān)鍵成分之一,可以通過磷酸化和去磷酸化來調(diào)節(jié)其蛋白的活性起到調(diào)節(jié)紡錘體微管與染色體動粒的連接的作用。MAD2功能改變,可引起紡錘體檢查點控制失常,導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性增加,染色體缺失的概率升高[24]。其機(jī)制可能是:MAD2的異常使紡錘體組裝檢查點的功能出現(xiàn)缺損,不能阻滯動粒-微管結(jié)合異常的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂,而導(dǎo)致染色體多極化,引起非整倍體細(xì)胞的形成,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,這些異常改變進(jìn)而又有可能成為腫瘤診斷標(biāo)記和治療靶點。王玉[25]發(fā)現(xiàn)MAD2L1在胃癌發(fā)病機(jī)制中扮演著高表達(dá)的癌基因的角色。

由此可見,HSP27、MAD2在胃癌前病變中呈高表達(dá),而在正常組織細(xì)胞中不表達(dá)或很少表達(dá)。本研究結(jié)果表明,在PLGC中,HSP27、MAD2表達(dá)較高,經(jīng)金果胃康膠囊治療后,兩種蛋白的陽性表達(dá)率顯著降低,其中金果胃康膠囊中劑量效果最顯著。兩種蛋白表達(dá)降低,表示金果胃康膠囊可能抑制HSP27的表達(dá)和通過控制MAD2穩(wěn)定染色體的不穩(wěn)定性,從而促進(jìn)PLGC細(xì)胞的凋亡,使細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常,逆轉(zhuǎn)胃黏膜損傷的各項病理生化指標(biāo),保護(hù)、修復(fù)胃黏膜損傷,阻斷PLGC向胃癌的轉(zhuǎn)變。