侯衛(wèi) 汪宗清 王仕奇 官鑫 馮亞瓊 李思澤 湯小虎,2

(1.云南中醫(yī)藥大學,云南 昆明 650500;2.云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,云南 昆明 650032)

白塞病(behcet’s disease,BD)是屬于自身免疫性疾病,以血管炎為主要病理表現(xiàn),以口腔、陰部反復潰瘍及葡萄膜炎為臨床特征。同時,可出現(xiàn)心血管、消化、中樞系統(tǒng)的損害[1]。BD病理機制尚處于研究探索中,近年來研究發(fā)現(xiàn)遺傳、感染、免疫等因素發(fā)揮重要的作用[2]。當前治療主要為對癥治療,常選用非甾體抗炎藥、免疫抑制藥、生物制劑等,但不能完全控制血管炎癥及延緩疾病進展[3],缺乏針對病因治療有效根治方法。中醫(yī)學對本病的認識始于《金匱要略》,稱為“狐惑病”,“狀如傷寒,默默欲眠,目不得閉,臥起不安,蝕于喉為惑,蝕于陰為狐”[4]。病機的認識源于隋《諸病源候論》:“夫狐惑二病者……此皆由濕毒氣所為也?！惫沤襻t(yī)家大都認為其病機以毒邪為主,兼雜濕、熱、虛、瘀等,較多選用甘草瀉心湯、五味消毒飲、龍膽瀉肝湯等辨證加減,且臨床療效頗佳[5]。

本研究運用中國知網(wǎng)、維普數(shù)據(jù)庫檢索關于中醫(yī)藥治療白塞病的相關醫(yī)案、文獻,以期挖掘中醫(yī)藥治療BD的用藥規(guī)律及對核心藥對的作用機制進行分析,將數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡藥理學結合運用,為白塞病的防治提供參考。

1 資料與方法

1.1醫(yī)案來源 本研究數(shù)據(jù)來源于中國知網(wǎng)、維普全文數(shù)據(jù)庫。具體檢索詞為:“白塞病”“狐惑病”“中醫(yī)”“中藥”等,時間范圍為2010年1月—2021年1月。

1.2納入標準 ①中醫(yī)診斷“狐惑病”,西醫(yī)診斷“白塞病”,醫(yī)案記錄完整;②病例采用中醫(yī)藥治療,中醫(yī)辨證或治法明確,方劑名稱、中藥名稱、用藥劑量明確完整;③臨床療效可靠者。符合以上3條者,即可納入本研究。

1.3排除標準 ①醫(yī)案記錄不完整;②動物實驗;③處方藥物、劑量不明確;④文章內(nèi)容、病例重復者(僅納入時間早者)。有上述任意一項者,不納入研究。

1.4中藥規(guī)范 為避免處方中以別名、采集、炮制、地區(qū)差異等不同,造成藥物分析偏差,參照《中藥學》[6]、《中華人民共和國藥典》[7]對藥物名稱統(tǒng)一規(guī)范化,例牡丹皮、丹皮統(tǒng)一為牡丹皮,生甘草、炙甘草統(tǒng)一規(guī)范為甘草等。

1.5數(shù)據(jù)分析與處理 將篩選符合納入標準的處方輸入古今醫(yī)案云平臺(V 1.5.7)中醫(yī)案采集模塊,該軟件的算法經(jīng)實踐證實具有科學性、可靠性。錄入過程由兩位研究者共同完成,對數(shù)據(jù)進行查對,以保證數(shù)據(jù)結果準確可靠。

1.6作用機制分析 將上述得到的核心藥對輸入中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索化學成分及作用靶點,篩選條件:口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18;GeneCards數(shù)據(jù)庫以“Behcet’s disease”為檢索詞,獲得BD的作用靶點,取BD和藥對的交集靶點并輸入STRING數(shù)據(jù)庫,構建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡,并據(jù)Degree值篩選出核心靶點,利用Cytoscape 3.6.0軟件構建核心藥對-活性成分-靶點-BD網(wǎng)絡及篩選核心化合物,運用R軟件對共同靶點進行KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1藥物頻次統(tǒng)計 經(jīng)過篩選得到64首處方,涉及221味中藥,其中使用頻次以甘草54次、黃連33次、地黃31次、牡丹皮26次、當歸25次排名較前,其中又以甘草的使用頻次最高,占比為84.38%。其中使用頻次前20的藥物見表1。

2.2藥物功效統(tǒng)計 中藥的藥物功效進行統(tǒng)計,結果以清熱解毒、清熱涼血、清熱燥濕類排名較前。排名前5的見表2。

表2 中藥功效統(tǒng)計(排名前5)

2.3藥物藥性藥味統(tǒng)計 對納入的221味中藥進行四氣統(tǒng)計,結果顯示寒性藥使用最多,藥用頻次292次,頻率為31.91%,其次為平、微寒、溫,具體結果見圖1;五味統(tǒng)計以甘味藥使用最多,藥用頻次455次,頻率49.73%,其次為苦、辛、淡,具體見圖2。

圖1 藥物四氣統(tǒng)計

圖2 藥物五味統(tǒng)計

圖3 藥物歸經(jīng)頻次統(tǒng)計

2.4藥物歸經(jīng)統(tǒng)計 對納入的中藥歸經(jīng)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。如果中藥具有數(shù)個歸經(jīng),全部計算在內(nèi)。在221味中藥里,共出現(xiàn)1641次歸經(jīng)。結果為肝經(jīng)(465次,28.34%),腎經(jīng)(349次,21.27%),脾經(jīng)(317次,19.32%)排名較前。

2.3聚類分析 據(jù)中藥處方的數(shù)量、中藥數(shù)量、藥物組合頻次,以0.25為支持度(藥對的兩位中藥同時出現(xiàn)占所有藥物的比例),以0.65為置信度(藥對同時出現(xiàn)的頻率)。選擇古今醫(yī)案云平臺的“關聯(lián)分析”,結果顯示藥物組合14對,涉及中藥10味,將藥物組合按照貢獻度、支持度從高到低排序(見表3)。并據(jù)支持度、提升度結果得到一核心藥對:黃連-甘草。

2.4基于網(wǎng)絡藥理學探析“黃連-甘草”治療BD的作用機制

2.4.1黃連-甘草活性成分-作用靶點網(wǎng)絡構建 通過篩選條件,運用TCMSP數(shù)據(jù)庫中共獲得黃連-甘草共89個活性成分和202個潛在靶點,GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得BD疾病靶點599個,映射得到53個共同靶點。通過與黃連-甘草的活性成分匹配后,共有55個具有治療BD作用的活性成分。將55個活性成分及53個共有靶點導入Cytoscape軟件,構建“黃連與甘草-活性成分-作用靶點-BD”網(wǎng)絡,見圖4。

圖4 黃連與甘草-活性成分-作用靶點網(wǎng)絡

2.4.2黃連-甘草治療白塞病靶點蛋白互作分析 將得到的53個共同靶點基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫構建PPI網(wǎng)絡,并利用R軟件選取degree排名前20的靶點繪制條形圖,見圖5,圖中條形柱的長度代表degree的大小,由圖可見白介素6(Interleukin-6,IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子A(Vascular Endothelial Growth Factor A,VEGFA)、CC類趨化因子配體2(CCL2)、CXC趨化因子配體8(CXCL8)、細胞間黏附分子1(ICAM1)等基因排名較前,在整個網(wǎng)絡中起著較為重要的作用,可能是黃連-甘草治療BD的關鍵靶點。

圖5 PPI中的核心基因(前20)

2.4.3靶點基因功能富集分析 通過KEGG分析結果顯示共有106條KEGG代謝通路參與其中,篩選出富集基因數(shù)較多的前20條通路,主要涉及脂質(zhì)與動脈粥樣硬化(Lipid and atherosclerosis)、AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切力與動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)等,主要涉及炎癥反應、血管細胞凋亡與免疫調(diào)節(jié)等多個環(huán)節(jié)。圖6。

圖6 黃連-甘草活性成分KEGG通路富集分析氣泡圖(前20)

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn),中醫(yī)藥在白塞病的治療效果頗佳,但對其具體機制研究尚有欠佳,因此需要對中醫(yī)治療白塞病具體機制進行探討。本研究通過對中國知網(wǎng)及維普數(shù)據(jù)庫中近10年涉及中醫(yī)藥治療白塞病文獻進行數(shù)據(jù)挖掘,并對高頻中藥進行關聯(lián)規(guī)則分析,臨床應用于治療白塞病的高頻中藥有甘草、黃連、地黃、牡丹皮、當歸等,主要功效體現(xiàn)為清熱、解毒、涼血、燥濕等方面。研究證實清熱解毒藥具有抗炎、抗菌、免疫抑制等作用,其主要通過核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等信號通路發(fā)揮抗炎作用,適用于類風濕關節(jié)炎、炎性腸病等疾病[8];清熱涼血藥研究發(fā)現(xiàn),地黃對免疫系統(tǒng)、血糖和血脂、抗胃潰瘍等作用[9];清熱燥濕藥具有抗氧化、抑制免疫、抗炎等藥理作用[10]。清熱解毒、清熱涼血、清熱燥濕等中藥對BD的防治主要體現(xiàn)為抗炎、免疫抑制、抗菌等,與BD當前研究證實的血管炎癥、免疫反應等病理因素相符。

通過藥性統(tǒng)計結果統(tǒng)計,寒性藥物有清熱解毒、涼血瀉火利尿等作用,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)此類藥物具有抗炎、止痛、抗菌等藥理作用[11];五味中甘味藥出現(xiàn)次數(shù)最多,藥用頻次455次,頻率49.73%,其次為苦、辛、淡?！案省睘橹兴幬逦吨?具有補益、緩急、調(diào)和之效,現(xiàn)代藥理表明,具有調(diào)整機能,補充機體不足,增強免疫力、抗菌等作用[12]。由此可見,寒性、甘味藥物治療白塞病主要為抗炎、抗菌等發(fā)揮治療作用。

通過藥物歸經(jīng)分析得到肝經(jīng)、腎經(jīng)、脾經(jīng)最為常見,肝經(jīng)占比28.34%最多。中醫(yī)理論有肝開竅于目,肝經(jīng)循行“環(huán)繞口唇、外陰”,與白塞病臨床典型發(fā)病于眼睛、口腔、外陰部位相符合;肝主藏血及疏泄,濕熱邪毒外感膠著于肝,疏泄不暢,氣機瘀阻脈道,久為肝郁化火,“熱盛則內(nèi)腐,肉腐則為膿”發(fā)為“瘡瘍”,可見白塞病與肝經(jīng)循行及生理特性相關。歸經(jīng)即指藥物所歸屬的作用部位,是藥物作用效果定位的理論概念,對于疾病的診治有者指向作用[13]?，F(xiàn)代藥理研究證實歸肝經(jīng)藥物的主要體現(xiàn)在抗?jié)儭⒁种蒲“寰奂?、抗炎等方面[14],相關研究證實其經(jīng)醋制后,提升免疫力、抗炎鎮(zhèn)痛等效果明顯提升[15]。歸腎經(jīng)藥物組合具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫促進等藥理作用[16],可能與BD的治療相關。而相關研究證實歸脾經(jīng)藥物主要體現(xiàn)為補中益氣、溫中化濕、理氣等功效[17],其中常用的白術、干姜、黃連等藥理研究表明其都具有不同程度的免疫調(diào)節(jié)功能[18]。

根據(jù)關聯(lián)規(guī)則分析得到黃連-甘草為支持度、置信度最高,可能為中醫(yī)藥治療白塞病常用藥對。黃連-甘草作為常見的配伍藥物,臨床常用于多種疾病的治療,及存在于多首方劑。甘草的現(xiàn)代研究起源于抗?jié)冏饔?還有抗病毒、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及免疫等多種功效,對BD的療效確切[19]。黃連主要以小檗堿(黃連素)、阿魏酸、黃連堿等化學成分,具有抗?jié)?、抗炎、解熱、抗腫瘤等功效[20-21],對BD的治療可起到清熱、燥濕、解毒等作用。黃連-甘草藥對廣泛出現(xiàn)于龍膽瀉肝湯、甘草瀉心湯的臨床中證實對BD的治療行之有效的方劑中,也證實了藥對白塞病的治療具有前期基礎,為網(wǎng)絡藥理學的研究奠定了臨床基礎。

通過網(wǎng)絡藥理學方法對黃連-甘草對白塞病的作用機制進行探討,得到核心靶點IL-6、VEGFA、CCL2、CXCL8、ICAM1、IL-10、IL-1β、MMP9、PTGS2、STAT3、VCAM1等排名較前,IL-6、IL-10、IL-1β、PTGS2等主要涉及機體炎癥反應,STAT3、CCL2等與機體免疫應答相關,VEGFA、VCAM1、CASP3等與血管內(nèi)皮保護作用相關;研究表明,BD患者IL-6、IL-10、IL-2高于健康組,且IL-6、IL-10水平與血沉呈正相關[22]。有研究發(fā)現(xiàn)BD患者體內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子的水平明顯高于正常人,可能與VEGF與VEGFR受體結合加速血管內(nèi)皮細胞分裂增殖相關,也意味著BD中血管生成病變與內(nèi)皮損傷相關[23]。CXCL8與其受體結合后,促使平滑肌細胞的增殖及遷移,增加MMP9因子的表達量,促進平滑肌細胞的遷移[24]。

KEGG通路富集得到黃連-甘草主要影響血管內(nèi)皮的凋零、炎癥反應等發(fā)揮BD的治療作用。AGEs與RAGE結合形成氧化應激,進而使核轉錄因子NF-kβ激活,促使炎癥因子如NO、TNF-α、1L-1β等分泌增加,導致連續(xù)的細胞損傷和功能紊亂[25]。TNF過度表達在BD的發(fā)病機制主要體現(xiàn)在活化中性粒細胞及T淋巴細胞,引起血管內(nèi)皮損傷[26]。

本文采用數(shù)據(jù)挖掘及網(wǎng)絡藥理學的研究方法,總結臨床醫(yī)家的用藥選方經(jīng)驗,從而選取核心藥對;進而研究核心藥對治療白塞病的可能作用機制。同時應指出,單純依靠文獻數(shù)據(jù)挖掘醫(yī)案記錄、藥物名稱未統(tǒng)一等需進一步完善。初步探討黃連-甘草治療白塞病的作用機制,而中醫(yī)遣方用藥則需據(jù)患者臨床癥狀為基礎,需靈活加減;網(wǎng)絡藥理學研究方法存在一定局限,還應進一步實驗驗證及臨床研究,從而為臨床白塞病的防治提供參考。