柳 卓,譚小寧,翦慧穎,曾普華,

(1.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410219;2.湖南省中醫(yī)研究院,長(zhǎng)沙 410006;3.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,長(zhǎng)沙 410006)

世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer, ARC)發(fā)布了2021年全球最新癌癥數(shù)據(jù),全世界被確診為肝癌的人超過(guò)90萬(wàn),肝癌死亡的人超過(guò)83萬(wàn),死亡人數(shù)接近發(fā)病人數(shù)。2021年中國(guó)有超過(guò)41萬(wàn)人新患肝癌,超過(guò)39萬(wàn)人死于肝癌[1]。肝癌的致病原因目前主要認(rèn)為是乙型和丙型肝炎病毒、非酒精脂肪性肝病、長(zhǎng)期酗酒、進(jìn)食黃曲霉毒素等導(dǎo)致[2]。目前肝癌治療方法有手術(shù)療法、放化療、肝移植、介入及藥物治療等。但肝癌的治療和預(yù)后相對(duì)較差,副作用較多且費(fèi)用也較高。因此,找到治療效果確切且毒副作用較小的輔助藥物為研究熱點(diǎn)[3]。

中醫(yī)藥對(duì)肝癌的治療是我國(guó)肝癌患者重要的治療手段之一,許多中藥提取物都顯示出對(duì)肝癌有抑制作用,從中藥成分或植物來(lái)源中找到的一些天然化合物既能保護(hù)正常細(xì)胞不受影響,又能對(duì)癌細(xì)胞有殺傷力,但目前中藥成分藥理機(jī)制仍然不明確。槲皮素是廣泛存在于中藥中的天然黃酮類化合物,被認(rèn)為是一種有效的癌癥治療劑和抗氧化劑,同時(shí)也是腫瘤治療劑和自噬介質(zhì),已經(jīng)被證明能通過(guò)多種途徑治療肝癌、肺癌等不同惡性腫瘤[4]。近年來(lái),有體外試驗(yàn)已表明槲皮素對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期有阻滯作用,并具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、抗血管生成、化療增敏作用、調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝、增強(qiáng)抗炎作用,并呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性[5]。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明槲皮素能逆轉(zhuǎn)癌前病變[6]。目前,針對(duì)槲皮素治療肝癌的研究雖在不斷深入,但仍無(wú)針對(duì)其有效的具體分子機(jī)制研究。因此,本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué),對(duì)槲皮素治療肝癌的分子靶點(diǎn)及通路進(jìn)行預(yù)測(cè)及分子對(duì)接進(jìn)行驗(yàn)證,為槲皮素對(duì)肝癌研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 HepG2細(xì)胞為湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。Hep3B細(xì)胞購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司(貨號(hào)CL-0102)。HuH-7細(xì)胞購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司(貨號(hào)CL-0120)。

1.1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司(貨號(hào)PM15210);電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)發(fā)光液購(gòu)自白鯊生物科技有限公司(貨號(hào)BL520B);醛糖還原酶(aldoketo reductase family 1 member B1,AKR1B1)一抗購(gòu)自安諾倫(北京)生物科技有限公司(貨號(hào)GTX113381);胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司(批號(hào) A316081);槲皮素購(gòu)自南京景竹生物科技有限公司(貨號(hào)117395)。

1.1.3 儀器 SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái),蘇州安泰公司);TG16-WS型高速離心機(jī),湖南賽特湘儀公司;OPERETTA型高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng),美國(guó)PerkinElmer公司;EIX808U型酶標(biāo)儀,美國(guó)BioTek公司;Min-PROTEAN Tetra電泳儀,美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 收集和處理槲皮素靶點(diǎn) 使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集槲皮素的成分信息。并從Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找的槲皮素3D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)中預(yù)測(cè)分子靶點(diǎn)。將化合物預(yù)測(cè)產(chǎn)生的靶點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)性的篩選剔除,結(jié)合臨床試驗(yàn)文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充槲皮素的靶點(diǎn),并將其錄入U(xiǎn)niPtot(https://www.uniprot.org/)剔除非人源的靶點(diǎn)。

1.2.2 肝癌疾病相關(guān)靶點(diǎn)及槲皮素與肝癌相關(guān)靶點(diǎn)收集 通過(guò)GeneCards(https://www. genecards. org/)、OMIM(https://omim.org/)和TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)搜索肝癌相關(guān)靶點(diǎn),篩選并刪除重復(fù)的靶點(diǎn),并利用Ri386 4.0.5軟件找出1.2.1收集的槲皮素作用于肝癌的作用靶點(diǎn)。

1.2.3 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控靶點(diǎn)分析 將槲皮素作用肝癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)信息輸入String11.0(https://www.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network, PPI),并將信息輸入Cytoscape 3.6.2進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,得出平均最短路徑、聚類系數(shù)、度值等。

1.2.4 槲皮素調(diào)控肝癌相關(guān)通路分析 采用Ri386 4.0.5軟件、Cytoscape 3.6.2軟件的app GlueGO插件及DAVID 6.8,對(duì)槲皮素對(duì)肝癌作用關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO和KEGG進(jìn)行分析,選取閾值P小于0.05的靶點(diǎn),并根據(jù)P值從小到大篩選。從基因靶點(diǎn)的分子功能(molecular function,MF)、參與生物過(guò)程(biological process,BP)和細(xì)胞成分(cell components,CC)三個(gè)方面進(jìn)行分析,利用R語(yǔ)言下載“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”數(shù)據(jù)包進(jìn)行交叉靶點(diǎn)KEGG路徑富集分析綜合預(yù)測(cè)槲皮素與肝癌關(guān)鍵調(diào)控通路。

1.2.5 分子對(duì)接結(jié)果分析

1.2.5.1 分子對(duì)接結(jié)果 將找出的所有槲皮素對(duì)肝癌的作用靶點(diǎn)共76個(gè),去除掉非人源性基因和不能結(jié)合的基因,剩余70個(gè),在PDB(https://www1.rcsb.org/)分別搜索70個(gè)靶點(diǎn)蛋白保存為PDB格式。將70個(gè)藥物-疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)分別與配體槲皮素(MOL2格式)用iGEMDOCK分子對(duì)接軟件進(jìn)行分子對(duì)接,參數(shù)均采用默認(rèn)參數(shù)。

1.2.5.2 系統(tǒng)分子對(duì)接結(jié)果 將槲皮素治療肝癌的70個(gè)作用靶點(diǎn)的PDB ID輸入Systemsdock數(shù)據(jù)庫(kù),找出活性位點(diǎn),用ChemBio3D 軟件保存槲皮素mol2 3D 結(jié)構(gòu),輸入應(yīng)用AutoDockVina開(kāi)始對(duì)接整理結(jié)果并分析得到系統(tǒng)分子對(duì)接結(jié)果。

1.2.6 槲皮素對(duì)人肝癌細(xì)胞的作用驗(yàn)證

1.2.6.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2和Huh-7在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),Hep3B細(xì)胞在含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。并放在37 ℃、5%CO2和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2.6.2 分組和給藥 取1×106對(duì)數(shù)長(zhǎng)期HepG2、Huh-7、Hep3B,分別設(shè)對(duì)照組、陽(yáng)性組(順鉑20 μg/mL)和槲皮素組100 μmol/L,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。各組均接受藥物干預(yù)24 h。

1.2.6.3 CCK8檢測(cè)槲皮素的抑制作用 首先取50、100、150、200、250 μmol/L五個(gè)濃度梯度對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行24 h的干預(yù),按照CCK8試劑盒方法檢測(cè)其光密度(optical density,OD)值。

取20、50、100 μmol/L三個(gè)不同濃度梯度槲皮素分別干預(yù)HepG2、Huh-7、Hep3B培養(yǎng)24 h后,棄掉上清,每孔加入CCK8,37 ℃培養(yǎng)2 h,于450 nm波長(zhǎng)處,用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光值(OD值)。

1.2.6.4 測(cè)定各組細(xì)胞腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β 對(duì)數(shù)成長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞,以5×102個(gè)接種于6孔板,各組藥物干預(yù)24 h后,采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

1.2.6.5 Western blot檢測(cè) 取HepG2細(xì)胞,各組藥物處理24 h后,提取蛋白,取含有100 μg總蛋白的細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行電泳,5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉1 h,加入稀釋一抗AKR1B1(1:1 000)4 ℃孵育過(guò)夜,清洗后二抗搖床孵育2 h,清洗后用凝膠成像[7]。

1.2.6.6 高內(nèi)涵(high content screening, HCS)檢測(cè)AKR1B1蛋白表達(dá)量 取黑色96孔板接種細(xì)胞,4組加入相應(yīng)藥物,干預(yù)24 h。4%多聚甲醛固定30 min,棄液,磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution,PBS)清洗5 min,重復(fù)3次。Trition-100處理15 min,提前冷藏PBS洗3次。5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封閉30 min。分別加入(1∶100)兔抗小鼠AKR1B1一抗稀釋液避光4 ℃過(guò)夜孵育,冷PBS洗3次,加入(1∶200)FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗稀釋液避光37 ℃ 30 min孵育,加入DAPI染核,避光室溫20 min孵育,每孔加入50 μL PBS,于高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)上進(jìn)行熒光檢測(cè)并拍照[8]。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)及靶點(diǎn)信息

根據(jù)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)PharmMapper得到槲皮素已報(bào)道的靶點(diǎn)共325個(gè),通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)刪選不重復(fù)的靶點(diǎn)共299個(gè),包括HSP82、syd、Nup214、ALB、PKLR等,度值最高的為ALB,其次為PKLR。槲皮素的化學(xué)2D和3D結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1,其結(jié)構(gòu)以色酮為基本結(jié)構(gòu)并包含五個(gè)酚羥基,分子排列緊密引力較大,不易溶解限制了其在動(dòng)物體內(nèi)的生物利用度。

圖1 槲皮素的結(jié)構(gòu)

2.2 肝癌相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)構(gòu)建及比對(duì)分析

在GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)共刪選出了24395個(gè)疾病基因,將三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)去重后共得到17359個(gè)疾病基因,GeneCards選擇分?jǐn)?shù)>40的數(shù)據(jù),共篩選出214個(gè)靶點(diǎn)。對(duì)槲皮素靶點(diǎn)與肝癌的相關(guān)發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)后得到共76個(gè)作用靶點(diǎn)基因,除去重復(fù)的基因后得到70個(gè)靶點(diǎn)基因,利用Cytoscape 3.6.2繪制槲皮素對(duì)肝癌作用靶點(diǎn)的互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,見(jiàn)圖2,將槲皮素治療肝癌的潛在70個(gè)作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)通過(guò)Ri386 4.0.5得出韋恩圖,疾病靶點(diǎn)比較表現(xiàn)出潛在的70個(gè)作用靶點(diǎn)均在肝癌的靶點(diǎn)內(nèi),見(jiàn)圖3。將70個(gè)作用靶點(diǎn)輸入到String數(shù)據(jù)庫(kù)去除掉無(wú)相互作用的靶點(diǎn)后導(dǎo)出PPI圖。得到槲皮素對(duì)肝癌的作用靶點(diǎn)共有72個(gè)節(jié)點(diǎn),平均聚類系數(shù)為0.598,共有538個(gè)邊數(shù),平均度數(shù)為14.2,見(jiàn)圖4。根據(jù)R語(yǔ)言matrix算法分析在string中槲皮素與肝癌靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)得出較相關(guān)的基因有IL-6、CASP3、EGFR、VEGFA、MYS、CCND1、ERBB2、FOS、AR、PPARG、RELA、CASP8、HIF1A、NOS3、ICAM1、PTGS1等,其中IL-6、CASP3、EGFR、VEGFA等靶點(diǎn)數(shù)較多,見(jiàn)圖 5,槲皮素對(duì)肝癌作用靶點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)分析見(jiàn)表1,包括了最短路徑、介數(shù)、中心接近度、聚類系數(shù)、度數(shù)等。

表1 槲皮素治療肝癌靶點(diǎn)拓?fù)浞治?度值前30個(gè)靶點(diǎn))

圖2 槲皮素治療肝癌作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

圖3 槲皮素治療肝癌作用靶點(diǎn)的韋恩圖

圖4 槲皮素治療肝癌靶點(diǎn)PPI圖

圖5 槲皮素治療肝癌影響相關(guān)基因統(tǒng)計(jì)

2.3 槲皮素治療肝癌靶點(diǎn)的GO和KEGG分析

經(jīng)R語(yǔ)言及David數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析,見(jiàn)圖6、表2,并將前10位的CC、MF、BP篩選出來(lái),包括GO分組編號(hào)及P值。GO分析共得到33個(gè)CC,P值靠前的有胞漿、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞質(zhì)、膜筏、核質(zhì)等;63個(gè)MF,P值靠前的有酶結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性等;353個(gè)BP,P值靠前的有RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、對(duì)雌二醇的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)等。

圖6 槲皮素治療肝癌靶點(diǎn)GO圖

將槲皮素治療肝癌的靶點(diǎn)用David數(shù)據(jù)庫(kù)及R語(yǔ)言進(jìn)行KEGG信號(hào)分析,共包含72條通路,根據(jù)P值篩選出前7條,見(jiàn)圖7,將通路名稱、相關(guān)基因及P值匯總到表3,氣泡圖顯示氣泡越大基因個(gè)數(shù)越多,氣泡越藍(lán),P值越小,顯著性越高。主要包括癌癥相關(guān)途徑、乙型肝炎、癌癥中的蛋白多糖、凋亡、低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,HIF)-1信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、p53信號(hào)通路等,在肝癌發(fā)病機(jī)制中均有報(bào)道,可見(jiàn)GO和KEGG方法是可行的,結(jié)果顯示對(duì)槲皮素對(duì)通過(guò)這些通路對(duì)肝癌起效[9-11]。

表3 槲皮素治療肝癌靶點(diǎn)KEGG分析

圖7 槲皮素治療肝癌靶點(diǎn)的KEGG氣泡圖

2.4 槲皮素-肝癌作用靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果分析

2.4.1 分子對(duì)接結(jié)果 將肝癌的70個(gè)潛在靶點(diǎn)分別與槲皮素進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)合能量越低時(shí)配體與受體結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定,選出結(jié)合能力最強(qiáng)的前5個(gè)分子,其中分子對(duì)接結(jié)合能力較強(qiáng)的有AKR1B1、NQO1、NOS3、CYP3A4、RASSF1,結(jié)合能力最強(qiáng)的為AKR1B1、其次是NQO1,見(jiàn)表4。

表4 槲皮素治療肝癌分子對(duì)接結(jié)果

2.4.2 系統(tǒng)分子對(duì)接結(jié)果 槲皮素對(duì)肝癌對(duì)接結(jié)果表示槲皮素與MYC、STAT3、EGFR、MAPK1、CASP3、VEGFA等21個(gè)靶點(diǎn)的系統(tǒng)對(duì)接分值大于5,表明槲皮素與肝癌的作用靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性,將靶點(diǎn)名稱、PDB編號(hào)、系統(tǒng)對(duì)接得分、分子對(duì)接得分總結(jié)見(jiàn)表5。綜合結(jié)合能力最好的是AKR1B1、NQO1、NOS3、CYP3A4、RASSF1。由此可見(jiàn)基因AKR1B1可能在槲皮素治療肝癌中有重要的作用。

表5 槲皮素治療肝癌的分子對(duì)接分?jǐn)?shù)

2.5 槲皮素對(duì)人肝癌細(xì)胞的作用

2.5.1 不同濃度槲皮素對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制率 槲皮素對(duì)HepG2細(xì)胞CCK8結(jié)果表示,其對(duì)肝癌細(xì)胞有抑制作用,并隨著其濃度的增加,增值抑制作用逐漸增強(qiáng),細(xì)胞數(shù)變少。IC50=98.54 μmol/L,見(jiàn)圖8。

注:半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)

與對(duì)照組比較,不同濃度槲皮素組和順鉑組干預(yù)HepG2、Huh-7、Hep3B細(xì)胞后,增殖下降,并且濃度越高,抑制能力越強(qiáng),并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表6。

表6 不同濃度槲皮素分別干預(yù)三種肝癌細(xì)胞24h后增殖影響

2.5.2 槲皮素干預(yù)HepG2細(xì)胞后TNF-α、IL-6、IL-1β濃度 與對(duì)照組比較,槲皮素和順鉑組TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)顯著降低(P<0.05),可見(jiàn),槲皮素能降低腫瘤細(xì)胞的炎癥因子的表達(dá)量,驗(yàn)證了槲皮素治療肝癌與炎癥因子有關(guān),見(jiàn)表7。

表7 各組細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β濃度

2.5.3 槲皮素干預(yù)HepG2細(xì)胞后AKR1B1表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)槲皮素組和陽(yáng)性藥物組中AKR1B1的表達(dá)明顯低于對(duì)照組,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。槲皮素的表達(dá)低于陽(yáng)性藥物組,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖9、表8。

表8 Western blot檢測(cè)槲皮素干預(yù)HepG2細(xì)胞后AKR1B1的蛋白表達(dá)

注:醛糖還原酶(AKR1B1)A.對(duì)照組;B.槲皮素;C.順鉑組。

2.5.4 HCS檢測(cè)HepG2細(xì)胞的AKR1B1實(shí)驗(yàn)結(jié)果 HCS實(shí)驗(yàn)(圖10、表9)發(fā)現(xiàn)槲皮素組和陽(yáng)性藥物組中AKR1B1的表達(dá)明顯低于對(duì)照組,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。槲皮素的表達(dá)低于陽(yáng)性藥物組,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見(jiàn),槲皮素對(duì)肝癌的作用可能與AKR1B1有關(guān)。

表9 高內(nèi)涵(HCS)細(xì)胞成像分析系統(tǒng)檢測(cè)醛糖還原酶(AKR1B1)在HepG2中的蛋白表達(dá)

注:醛糖還原酶(AKR1B1)A.對(duì)照組;B.槲皮素;C.順鉑組

3 討論

肝癌是全世界第五大最常見(jiàn)癌癥和第三大癌癥死亡原因?，F(xiàn)在肝癌的治療主要是以手術(shù)為主,但術(shù)后的高復(fù)發(fā)率始終影響著患者的生活和生存發(fā)展。中藥存在作用靶點(diǎn)多、成分較多的特點(diǎn),現(xiàn)代研究表明,中藥抗肝癌具有明顯的作用[12-13]。槲寄生總堿能通過(guò)造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載引起肝癌細(xì)胞凋亡[14]。槲皮素廣泛分布于被子植物的中藥中,已有體內(nèi)體外及臨床研究均表明其具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制生長(zhǎng)的作用,但其機(jī)制仍然不完全明確[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明,槲皮素能增加E-cadherin蛋白的表達(dá)使得抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (transforming growth factor,TGF) -β1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT得到抑制[15]。Ren[5]研究表明槲皮素納米粒通過(guò)滅活凋亡相關(guān)的caspase通路,抑制炎癥因子而具有抗腫瘤作用。但仍不能系統(tǒng)揭示槲皮素治療肝癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)機(jī)制。由于槲皮素不穩(wěn)定并且溶解性差,限制了臨床使用,現(xiàn)在有研究將槲皮素和納米顆粒結(jié)合可以通過(guò)多靶點(diǎn)作用有效地抑制肝癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和集落形成從而提高其療效并減少副作用[5]。

本研究通過(guò)化合物數(shù)據(jù)庫(kù)找出槲皮素對(duì)肝癌相關(guān)靶點(diǎn)76個(gè),篩選出70個(gè)。GO分析表明槲皮素抗肝癌細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)相關(guān)信號(hào)及凋亡作用的靶點(diǎn)有原癌基因(MYC)、醌氧化還原酶(quinone oxidoreductase,NQO)1等。KEGG分析表明槲皮素治療肝癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要是通過(guò)癌癥相關(guān)通路、乙型肝炎、癌癥中的蛋白多糖、凋亡、HIF-1信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等。因此,槲皮素可通過(guò)以上幾種方式來(lái)發(fā)揮治療肝癌的作用。KEGG分析發(fā)現(xiàn)除了癌癥相關(guān)通路外,炎癥細(xì)胞因子也有很大的相關(guān)性。

從分子對(duì)接的結(jié)果中分析,共有21個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)系統(tǒng)對(duì)接分值大于5,其與MYC、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 (signal transducer and activator of transcription,STAT)3、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor recptor,EGFR)、MAPK1、人胱天蛋白酶3(caspase 3,CASP3)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)結(jié)合活性較好。而結(jié)合能力最好的是AKR1B1、NQO1、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)3、細(xì)胞色素P450(cytochrom P450,CYP)3A4酶、Ras關(guān)聯(lián)域家族(ras association domain family,RASSF)1?？梢?jiàn)AKR1B1基因可能在槲皮素治療肝癌中起重要作用。在體外研究表明,槲皮素組和陽(yáng)性藥物組AKR1B1的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組。槲皮素的表達(dá)低于陽(yáng)性藥物組,炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)降低?？梢?jiàn),槲皮素可能與AKR1B1結(jié)合后有抗癌作用,其機(jī)制可能與炎癥有關(guān)。

綜上,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù),輔助實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,探討槲皮素在治療肝癌的過(guò)程中的分子機(jī)制及其潛在靶點(diǎn),更深入地研究了有效成分—靶點(diǎn)—疾病的相互作用,為肝癌的中醫(yī)藥治療提供了新藥研制方向及機(jī)制研究思路。但由于數(shù)據(jù)庫(kù)資料的不全面,使得本研究具有一定的局限性。因此接下來(lái)將對(duì)槲皮素治療肝癌的基礎(chǔ)機(jī)制進(jìn)行更深入的驗(yàn)證和探討。