張占棟,馬 瑞,李瑞芳,李三強(qiáng),都婉紅

(1.河南推拿職業(yè)學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471023;2.河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471023)

原發(fā)性肝癌是臨床常見的惡性腫瘤,其死亡率較高,其中75%～85%為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[1]。由于癥狀不明顯,絕大多數(shù)HCC患者初次就診時(shí)已處于中晚期,患者預(yù)后較差[2-3]。HCC的高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高死亡率和目前治療方案的局限性[2,4],使其成為人類面臨的重大公共衛(wèi)生問題之一。深入研究HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)尋找更有效的治療方法具有重要意義。

HCC是一種富含血管的腫瘤[5],血管生成在其進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。在肝癌細(xì)胞株和肝細(xì)胞癌患者的組織中,普遍檢測(cè)到血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)的高度表達(dá)[6]。VEGF是促血管生成作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子[7],抑制VEGF的生成間接地抑制了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。已有報(bào)道表明,抑癌基因Kruppel樣因子(Kruppel-like factor,KLF)4和人金屬肽酶含血小板反應(yīng)蛋白(human A disintegrin and metalloprotease,ADAMTS) 1在多種消化道腫瘤中呈低表達(dá)狀態(tài),并與血管生成密切相關(guān)[8-11],然而它們?cè)贖CC中的表達(dá)變化尚未得到闡明。

川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是中藥川芎的有效單體,具有抗氧化、改善微循環(huán)、活血化瘀、抗血小板凝集、抗血栓形成以及抗纖維化等作用,臨床上廣泛用于預(yù)防和治療血管性疾病。研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪還具有抗腫瘤活性,能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡,對(duì)消化道腫瘤、骨肉瘤、肺癌、卵巢癌等均表現(xiàn)出一定的治療潛力[12-15]。然而,其對(duì)HCC的研究尚未見報(bào)告。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在研究川芎嗪對(duì)H22肝癌小鼠的抑瘤作用及對(duì)腫瘤血管生成的影響,進(jìn)一步探究其是否通過調(diào)控KLF4/VEGF/ADAMTS1信號(hào)通路來抑制腫瘤血管生成的機(jī)制,為臨床HCC的治療提供新的思路。本研究由河科大一附院倫理委員會(huì)審核,編號(hào):2020-04-B036。

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

40只健康雄性BALB/c小鼠,體質(zhì)量20～22 g,河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)2017-0 001。H22肝癌瘤種由河南省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院惠贈(zèng),以腹腔代傳形式在小鼠體內(nèi)傳代,瘤種每7 d代傳1次。

1.2 主要藥品與試劑

注射用鹽酸川芎嗪,規(guī)格:40 mg,批號(hào):201605051,國(guó)藥準(zhǔn)字:H20031302,平光制藥股份有限公司生產(chǎn);鹽酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride,DOX),規(guī)格:10 mg,批號(hào):1704E2,國(guó)藥準(zhǔn)字:H44024359,浙江海正輝瑞制藥有限公司生產(chǎn);二喹啉甲酸(biquinolinecarboxylic acid,BCA)蛋白測(cè)定試劑盒(上海碧云天公司,貨號(hào):P0010);兔多抗GAPDH(杭州賢至生物有限公司,貨號(hào):AB-P-R 001);兔多抗KLF4(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):11880-1-AP);兔多抗VEGF、兔多抗ADAMTS1(武漢博士德生物工程有限公司,貨號(hào):BA0407、BA3575-2);CD34(Abcam公司,貨號(hào):Ab81289);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,ALT)、門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxalacetic transaminase,AST)ELISA測(cè)試盒(南京建成公司,貨號(hào):C009-2-1、C010-2-1)。

1.3 主要儀器

石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司,型號(hào):RM2016);Thermo酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司,型號(hào):mμlISKANMK3);普通光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本OLYMPUS,型號(hào):BX43);垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠,型號(hào):DYCZ-24DN、DYCZ-40)。

2 方法

2.1 造模與分組

40只健康雄性BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,將無菌抽取的H22小鼠腹腔積液調(diào)整腫瘤細(xì)胞密度至1×107/mL,在每只小鼠腋部皮下注射0.2 mL腫瘤細(xì)胞建立H22肝癌小鼠模型。24 h后隨機(jī)分為模型組、低、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組,每組各10只小鼠。

2.2 給藥

給藥體積為0.1 mL/10 g,給藥途徑均為腹腔注射。模型組小鼠腹腔注射同等劑量0.9%氯化鈉溶液,低、高劑量組小鼠腹腔注射TMP,劑量分別為25 mg/kg、50 mg/kg,每日1次,陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腹腔注射DOX 2 mg/kg,隔日1次。所有藥物從接種第2天開始給藥,持續(xù)10 d。

2.3 ELISA法測(cè)定H22小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的含量

最后1次給藥24 h后取材,眼球采血,取上清液檢測(cè)ALT、AST含量。

2.4 檢測(cè)腫瘤抑瘤率

采血完成后,采用脫臼法處死小鼠,解剖剝離各組小鼠的腋下瘤,稱其質(zhì)量,計(jì)算腫瘤抑瘤率。計(jì)算公式為:抑瘤率=(1-用藥組平均瘤質(zhì)量/模型組平均瘤質(zhì)量)×100%。

2.5 HE染色檢測(cè)肝臟組織的病理形態(tài)學(xué)改變

取腋下瘤組織在4%甲醛中固定24 h,流水沖洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,制成5 μm的組織切片,進(jìn)行HE常規(guī)染色。

2.6 免疫組化觀察腫瘤組織微血管生成

采用免疫組化SP法檢測(cè)H22肝癌小鼠腫瘤組織的微血管生成。腫瘤組織切片脫蠟水化,滅活內(nèi)源性過氧化物酶,抗原修復(fù),血清封閉,37 ℃一抗(CD34稀釋200倍)孵化1 h,含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBST)洗3次,二抗孵育1 h,二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色,復(fù)染、流水藍(lán)化,封片,鏡檢拍照。

2.7 Western blot檢測(cè)腋下瘤組織中KLF4、VEGF和ADAMTS1蛋白表達(dá)

提取腫瘤組織總蛋白,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)定量,取蛋白60 μg經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electro phoresis,SDS-PAGE)電泳后,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,一抗(GAPDH稀釋1 000倍、VEGF稀釋200倍、KLF4稀釋1 000倍、ADAMTS1稀釋500倍,4 ℃孵育過夜,含吐溫-20的Tris鹽緩沖液(tris buffered saline with tween-20,TBST)洗3次,加入HRP標(biāo)記的二抗37 ℃孵育1 h,ECL發(fā)光法顯色[16]。使用BandScan分析膠片灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 TMP對(duì)H22肝癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響

H22肝癌細(xì)胞接種后第4～5天起可觸及接種時(shí)的腫瘤塊。用藥后低、高劑量組小鼠瘤重與模型組比較顯著降低(P<0.01)。低、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的抑瘤率分別為:31.60%、53.53%、53.27%,見表1。

表1 川芎嗪(TMP)對(duì)H22肝癌小鼠腫瘤質(zhì)量及腫瘤抑制率的影響

3.2 TMP對(duì)H22肝癌小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的影響

圖1結(jié)果顯示:與模型組比較,低、高劑量組小鼠血清ALT、AST水平顯著下降(P<0.01),陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清ALT、AST水平顯著上升(P<0.01)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較,低、高劑量組小鼠血清ALT、AST水平均下降,其中低劑量組小鼠血清ALT、AST水平下降更明顯(P<0.01)。該結(jié)果表明,TMP對(duì)H22肝癌小鼠血清ALT、AST的升高有明顯抑制作用,能改善H22肝癌小鼠肝功能。

注:與模型組比較**P<0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組比較##P<0.01;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT),門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST);A.模型組;B.低劑量組;C.高劑量組;D.陽(yáng)性對(duì)照組

3.3 TMP對(duì)H22肝癌小鼠腫瘤組織病理學(xué)的影響

圖2結(jié)果顯示:模型組(A)小鼠的腫瘤組織呈典型的柱狀、腺管樣癌巢結(jié)構(gòu),肝癌細(xì)胞排列成索狀、團(tuán)塊狀,同時(shí)伴有炎細(xì)胞的浸潤(rùn)。低、高劑量組(B、C)和陽(yáng)性對(duì)照組(D)小鼠的癌巢數(shù)量明顯減少,出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞壞死和胞核溶解現(xiàn)象,部分細(xì)胞呈空泡狀改變。

A.模型組;B.低劑量組;C.高劑量組;D.陽(yáng)性對(duì)照組

3.4 TMP對(duì)H22肝癌小鼠腫瘤血管生成的影響

通過免疫組化檢測(cè)小鼠腫瘤組織CD34的表達(dá),觀察其微血管生成,圖3結(jié)果顯示,模型組(A)小鼠腫瘤組織的CD34陽(yáng)性表達(dá)率高,可見大量微血管生成,與模型組比較,低、高劑量組(B、C)和陽(yáng)性對(duì)照組(D)小鼠腫瘤組織的微血管生成有一定程度減少。該結(jié)果表明,TMP可抑制H22肝癌小鼠腫瘤組織的微血管生成。

A.模型組;B.低劑量組;C.高劑量組;D.陽(yáng)性對(duì)照組

3.5 TMP對(duì)H22肝癌小鼠腫瘤組織血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4結(jié)果顯示,與模型組(1)比較,低、高劑量組(2、3)小鼠腫瘤組織血管生成相關(guān)蛋白KLF4蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.01),VEGF的表達(dá)顯著降低(P<0.01),ADAMTS1的表達(dá)顯著升高(P<0.01),抑制血管生成作用明顯。

4 討論

TMP具有抗氧化、抗纖維化、改善心血管患者血液流變等功效。研究報(bào)道TMP在消化系統(tǒng)腫瘤的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、逆轉(zhuǎn)耐藥及調(diào)節(jié)免疫等方面均有一定的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)低、高劑量組小鼠的瘤體大小和腫瘤質(zhì)量顯著低于模型組,表明TMP對(duì)H22肝癌小鼠的腫瘤生長(zhǎng)有一定的抑制作用,同時(shí)TMP有降低H22肝癌小鼠血清AST和ALT的水平,改善H22肝癌小鼠肝功能的作用,并可抑制低、高劑量組小鼠腫瘤組織微血管的生成。

KLF4為腫瘤發(fā)展過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,能抑制腫瘤發(fā)生,它已經(jīng)被證明作為腫瘤抑制基因抑制腫瘤細(xì)胞增殖[18]。ADAMTS1能抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成[19],其主要功能是通過TSPl型基序結(jié)合到血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的受體結(jié)合區(qū),阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體的磷酸化,而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體的磷酸化是血管生成和內(nèi)皮增殖的主要途徑,因此ADAMTS1高表達(dá)將不利血管內(nèi)皮增殖。ADAMTS1表達(dá)越高,腫瘤血管生成越少,ADAMTS1與腫瘤血管生成呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中TMP可以增加血管生成相關(guān)蛋白KLF4和ADAMTS1在腫瘤組織中的表達(dá),該作用隨藥物濃度的增加而增加,同時(shí)TMP顯著抑制了VEGF在H22肝癌小鼠腫瘤組織中的表達(dá),并且隨著藥物濃度的增加,其抑制作用也逐漸增強(qiáng),從而抑制小鼠腫瘤血管生成,進(jìn)而抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng),這有可能是其抗腫瘤的作用機(jī)制之一。

綜上所述,TMP具有抗腫瘤作用,能夠抑制H22肝癌小鼠實(shí)體瘤的生長(zhǎng),其作用機(jī)制可能與其上調(diào)KLF4表達(dá),進(jìn)而下調(diào)VEGF表達(dá)并且上調(diào)ADAMTS1表達(dá)以減少血管生成,但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步討論。該研究為TMP用于肝癌治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。