白 瑩,劉俊岑,王佳佳,賈富霞,王文娟

(首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,北京 100069)

化療是中晚期惡性腫瘤患者常用的治療手段,骨髓抑制是化療藥最常見(jiàn)的不良反應(yīng),主要表現(xiàn)為骨髓造血能力下降,外周血細(xì)胞或其產(chǎn)物數(shù)量低于正常參考值[1]。骨髓抑制分為急性骨髓抑制和潛在骨髓損傷兩種類(lèi)型[2]。急性骨髓抑制在接受化療后很快發(fā)生,主要是快速增殖的造血祖細(xì)胞凋亡所致,臨床上表現(xiàn)為成熟造血細(xì)胞的數(shù)量明顯降低,應(yīng)用造血生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)骨髓造血恢復(fù); 潛在骨髓損傷發(fā)生于急性骨髓抑制之后,主要是由于化療藥物誘導(dǎo)造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)發(fā)生衰老,損傷其自我更新能力,進(jìn)一步導(dǎo)致HSCs儲(chǔ)備減少,最終惡化為發(fā)育不良和骨髓增生異常綜合征。由于其遲發(fā)性,在臨床上容易被忽視,故臨床預(yù)后很差。目前治療急性骨髓抑制的方法有升白細(xì)胞藥、造血因子、成分輸血等[3],而對(duì)潛在骨髓損傷則缺乏有效防治措施。

骨髓抑制屬于中醫(yī)“虛勞”“血虛”等范疇[4]。中醫(yī)認(rèn)為化療藥屬藥毒之邪,進(jìn)入人體后可損傷正氣,耗傷精血,因此氣血虧虛是骨髓抑制的基本病機(jī)。臨床治療骨髓抑制均以補(bǔ)氣養(yǎng)血為基本治法,常采用當(dāng)歸補(bǔ)血湯(Danggui Buxue Decoction,DBD)加味[5]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),DBD對(duì)化療后骨髓造血細(xì)胞增殖和凋亡有較好的調(diào)節(jié)作用[6]。骨髓造血細(xì)胞增殖和凋亡與化療后骨髓造血細(xì)胞衰老密切相關(guān),本研究計(jì)劃在前期結(jié)果基礎(chǔ)上,觀察DBD對(duì)化療后骨髓造血細(xì)胞衰老及相關(guān)Wnt/β-catenin通路[7-11]的影響,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)6～8周齡雄性BALB/c小鼠60只,體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0011]。動(dòng)物飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)于寬敞通風(fēng)的清潔級(jí)動(dòng)物房,溫度20～25 ℃,濕度40%～70%,噪聲<60分貝,照明時(shí)間L/D =12 h/12 h,所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前先適應(yīng)性飼養(yǎng)一周自由飲食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫理編號(hào):AEEI-2018-054]。

1.2 藥品與試劑

DBD:當(dāng)歸6 g、黃芪30 g,采用中藥配方顆粒劑購(gòu)自北京康仁堂藥業(yè)有限公司,批號(hào):當(dāng)歸21003261,生黃芪21005751,規(guī)格:每袋7 g;環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)購(gòu)自江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司,批號(hào):18020825,規(guī)格:0.2 g/支,10支/盒;重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor, rhG-CSF)購(gòu)自廈門(mén)特寶生物工程股份有限公司,批號(hào):202105B06,規(guī)格:75 μg/瓶;小鼠β-半乳糖苷酶(SA-β-galactosidase, SA-β-Gal)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購(gòu)自北京美辰聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司,貨號(hào):MC17266;無(wú)水乙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):100092183;p53 (1C12)一抗,GSK-3β (D5C5Z)一抗,β-Catenin (D10A8)一抗購(gòu)自美國(guó)CST公司,貨號(hào):2524,12456,8480;p21 Cip1一抗,購(gòu)自上海愛(ài)必信生物科技有限公司,貨號(hào):abs131808;放射免疫沉淀法緩沖液,radioimmunoprecipitation assay buffer,RIPA)裂解液、蛋白磷酸酶抑制劑混合物購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司,批號(hào):202107258620,202106182221;總RNA提取試劑盒,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司,貨號(hào):DP419,KR116-02;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)試劑盒購(gòu)自北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):R0202。

1.3 儀器

血常規(guī)生化儀,型號(hào)K4500,日本希森美康公司;低溫冷凍離心機(jī),型號(hào)3K15,美國(guó)Sigma公司;酶標(biāo)檢測(cè)儀,型號(hào)ST-360,上?？迫A生物工程股份有限公司;脫水機(jī),型號(hào)Donatello,意大利DIAPATH公司;包埋機(jī),型號(hào)JB-L5,武漢俊杰電子有限公司;病理切片機(jī),型號(hào)RM2016,上海徠卡儀器有限公司;電泳儀、電泳槽、電轉(zhuǎn)儀,型號(hào)分別為164-5050、165-6001和170-3930,美國(guó)Bio-Rad公司;RT-qPCR儀,型號(hào)CFX96,美國(guó)Bio-Rad公司;凝膠、化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng),型號(hào)LAS3000,日本Fujifilm公司。

2 方法

2.1 分組、造模和干預(yù)

將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組,模型對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照組,DBD高、中、低劑量組,每組10只。本次DBD組共連續(xù)給藥10 d,先預(yù)防給藥5 d,空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組灌胃蒸餾水,DBD高、中、低劑量組分別按24 g/kg、12 g/kg、6 g/kg灌胃相應(yīng)中藥(低劑量相當(dāng)于臨床等效劑量)。第6天除空白對(duì)照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液外,其余組按100 mg/kg腹腔注射CTX,每日1次,連續(xù)造模3 d。造模期間開(kāi)始干預(yù)用藥,陽(yáng)性對(duì)照組按30 μg/kg皮下注射rhG-CSF,其他組按照預(yù)防給藥期間的給藥方案每日給藥1次,連續(xù)5 d。第11天取材。

2.2 血常規(guī)檢測(cè)

小鼠眼眶取EDTA-K2抗凝血50 μL,全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)外周血常規(guī)。

2.3 器官指數(shù)計(jì)算

頸椎脫臼處死小鼠,取肝、脾、胸腺,稱(chēng)重。計(jì)算器官指數(shù)(器官指數(shù)=器官重量/小鼠體質(zhì)量)。

2.4 ELISA檢測(cè)骨髓造血細(xì)胞SA-β-Gal含量

取小鼠雙側(cè)股骨,反復(fù)沖洗骨髓腔,收集骨髓造血細(xì)胞。取部分骨髓造血細(xì)胞,提取總蛋白,定量后,采用SA-β-Gal ELISA試劑盒檢測(cè),標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中加入辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL,封板膜封閉后37 ℃恒溫箱中孵育60 min。洗板后,每孔加入底物A,B,37 ℃避光孵育15 min后,15 min之內(nèi),于450 nm處測(cè)定OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣本SA-β-Gal含量。

2.5 髂骨造血組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosinstaining, HE)染色

取小鼠右側(cè)髂骨,10%中性福爾馬林固定,進(jìn)行骨組織脫鈣、石蠟包埋,采用切片機(jī)切片(最大面切開(kāi)),HE染色,光鏡下拍片。

2.6 Western blot檢測(cè)骨髓造血細(xì)胞p21、p53、GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)

取骨髓造血細(xì)胞,加入RIPA提取蛋白,定量煮沸,蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,加入含5%脫脂奶粉的TBST 溶液封閉2 h,分別加入p21、p53、GSK-3β、β-catenin抗體(1:1 000)和內(nèi)參β-actin 抗體(1:2 000),4 ℃孵育過(guò)夜;含吐溫的Tris-HCl緩沖鹽溶液(Tris Buffered Saline with tween, TBST)洗滌3次,10 min/次。加入HRP標(biāo)記的二抗(1:5 000)室溫孵育1 h,洗膜,ECL顯影。采用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度值分析,以β-actin為內(nèi)參計(jì)算p21、p53、GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)。

2.7 RT-qPCR檢測(cè)骨髓造血細(xì)胞p21、p53、GSK-3β、β-catenin及c-myc mRNA表達(dá)

取骨髓造血細(xì)胞,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA,合成cDNA,進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系20 μL,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性10 s、60 ℃退火延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。以β-actin為內(nèi)參,采用2-△△Ct法分析p21、p53、GSK-3β、β-catenin及c-myc mRNA相對(duì)表達(dá)。

表1 引物序列

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 DBD對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

如圖1所示,造模后與空白對(duì)照組相比較,模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注:與空白對(duì)照組相比較▲▲P<0.01;Blank.空白對(duì)照組;Model.模型對(duì)照組;Positive.陽(yáng)性對(duì)照組;DBD L.DBD低劑量組;DBD M.DBD中劑量組;DBD H.DBD高劑量組

3.2 DBD對(duì)外周血參數(shù)的影響

如圖2所示,與空白對(duì)照組相比較,模型對(duì)照組白細(xì)胞(white blood cell,WBC)數(shù)、中性粒細(xì)胞(neutrophil,NETU)數(shù)、淋巴細(xì)胞(lymphocyte,LYMPH)數(shù)均顯著降低(P<0.05)。與模型對(duì)照組相比較,DBD高劑量組WBC數(shù)顯著升高(P<0.05)。外周血紅細(xì)胞(red blood cell,RBC)數(shù)、血小板(platelet,PLT)數(shù)、血紅蛋白(haemoglobin,HGB)濃度各組均無(wú)明顯差異(P>0.05)。

注:與空白對(duì)照組相比較▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型對(duì)照組相比較★P<0.05;與陽(yáng)性對(duì)照組相比較#P<0.05,##P<0.01;白細(xì)胞 (WBC);中性粒細(xì)胞 (NETU);淋巴細(xì)胞 (LYMPH);紅細(xì)胞 (RBC);血小板 (PLT);血紅蛋白 (HGB) ;Blank.空白對(duì)照組;Model.模型對(duì)照組;Positive.陽(yáng)性對(duì)照組;DBD L.DBD低劑量組;DBD M.DBD中劑量組;DBD H.DBD高劑量組

3.3 DBD對(duì)脾、肝、胸腺器官指數(shù)的影響

如圖3所示,與空白對(duì)照組相比較,模型對(duì)照組脾、胸腺器官指數(shù)均顯著降低(P<0.01),肝器官指數(shù)顯著升高(P<0.01)。與模型對(duì)照組相比較,DBD各劑量組脾器官指數(shù)均顯著升高(P<0.05),肝器官指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。

3.4 DBD對(duì)骨髓造血細(xì)胞SA-β-Gal含量的影響

如圖4所示,與空白對(duì)照組相比較,模型對(duì)照組SA-β-Gal含量顯著升高(P<0.01)。與模型對(duì)照組相比較,DBD中、高劑量組SA-β-Gal含量均顯著降低(P<0.05)。

注:與空白對(duì)照組相比較▲▲P<0.01;與模型對(duì)照組相比較★P<0.05,★★P<0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組相相比較##P<0.01;SA-β-半乳糖苷酶SA-β-galactosidase(SA-β-Gal);Blank.空白對(duì)照組;Model.模型對(duì)照組;Positive.陽(yáng)性對(duì)照組;DBD L.DBD低劑量組;DBD M.DBD中劑量組;DBD H.DBD高劑量組

3.5 DBD對(duì)髂骨造血組織的影響

如圖5所示,空白對(duì)照組骨髓造血細(xì)胞數(shù)量多,造血組織結(jié)構(gòu)緊密,無(wú)核血細(xì)胞幾乎不可見(jiàn);模型對(duì)照組骨髓造血細(xì)胞數(shù)明顯減少,造血組織間隙較大,無(wú)核血細(xì)胞數(shù)目增多;與模型對(duì)照組相比較,DBD各劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組骨髓造血細(xì)胞數(shù)目均明顯增多,造血組織間隙明顯減小,無(wú)核血細(xì)胞數(shù)目減小。

注:與空白對(duì)照組比較▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型對(duì)照組比較★P<0.05,★★P<0.01;黑色箭頭是指髂骨中空腔部分,綠色箭頭是指骨髓中骨髓造血細(xì)胞,紅色箭頭是指無(wú)核血細(xì)胞

3.6 DBD對(duì)骨髓造血細(xì)胞p21、p53、GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示,與空白對(duì)照組相比較,模型對(duì)照組β-catenin、p53、p21蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)。與模型對(duì)照組相比較,DBD高劑量組β-catenin、p53、p21蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05);DBD中劑量組β-catenin表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。GSK-3β表達(dá)各組無(wú)明顯變化(P>0.05)。

注:與空白對(duì)照組比較▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型對(duì)照組比較★P<0.05,★★P<0.01;Blank.空白對(duì)照組;Model.模型對(duì)照組;Positive.陽(yáng)性對(duì)照組;DBD L.DBD低劑量組;DBD M.DBD中劑量組;DBD H.DBD高劑量組A.分子蛋白表達(dá)圖;B.蛋白表達(dá)水平比較圖

3.7 DBD對(duì)骨髓造血細(xì)胞p21、p53、GSK-3β、β-catenin、c-myc mRNA表達(dá)的影響

如圖7所示,與空白對(duì)照組相比較,模型對(duì)照組p21、p53、β-catenin、c-myc mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)。與模型對(duì)照組相比較,DBD高劑量組p21、p53、β-catenin mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05),GSK-3β mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01);DBD低劑量組β-catenin mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01),GSK-3β mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。

注:與空白對(duì)照組比較▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型對(duì)照組比較★P<0.05,★★P<0.01;Blank.空白對(duì)照組;Model.模型對(duì)照組;Positive.陽(yáng)性對(duì)照組;DBD L.DBD低劑量組;DBD M.DBD中劑量組;DBD H.DBD高劑量組

4 討論

從中醫(yī)病因角度來(lái)看,化療藥物屬于外來(lái)的“毒邪”,因此惡性腫瘤患者在接受化療治療時(shí),外來(lái)的“毒邪”就會(huì)侵入機(jī)體。從中醫(yī)角度認(rèn)為腫瘤患者正氣不足,因此毒邪侵入后,機(jī)體功能就會(huì)受到“毒邪”干擾而發(fā)生紊亂,最終嚴(yán)重影響人體氣血化生,引起臟腑功能失調(diào)。在化療藥誘發(fā)的眾多不良反應(yīng)中,以骨髓抑制為主要表現(xiàn)的血液毒性最為常見(jiàn)。骨髓抑制患者臨床常見(jiàn)面色蒼白、頭目眩暈、神疲倦怠、乏力氣短、心慌失眠等癥狀,中醫(yī)病機(jī)主要為氣血兩虛,臨床常采用DBD作為治療基礎(chǔ)方[12]。DBD出自李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》,方中黃芪與當(dāng)歸比為5:1,現(xiàn)代藥理研究證明按照這一比例配制出的方劑藥效最佳[13]。

依據(jù)骨髓抑制的病因病機(jī),治療上應(yīng)首先從補(bǔ)氣血入手,同時(shí)還應(yīng)調(diào)治與氣血生成密切相關(guān)的臟腑,養(yǎng)先天而助后天,扶正氣而生精血,以使氣血化生有源。中醫(yī)認(rèn)為“氣生血”,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為各類(lèi)血細(xì)胞由造血細(xì)胞分化增殖而來(lái),中醫(yī)基礎(chǔ)理論中提到的“氣”可以認(rèn)為對(duì)于造血細(xì)胞具有保護(hù)作用。造血細(xì)胞衰老是骨髓抑制的主要機(jī)制[4, 14]。造血干細(xì)胞是機(jī)體造血系統(tǒng)中所有血細(xì)胞的來(lái)源,具有自我更新、多向分化及長(zhǎng)期造血重建功能[15]。有研究表明急性白血病化療后復(fù)發(fā)小鼠體內(nèi)造血干細(xì)胞的正常造血重建功能受損,而這種損傷可能是因過(guò)度增殖誘發(fā)的細(xì)胞衰老所致[16]。造血干細(xì)胞衰老的機(jī)制目前仍不明確?，F(xiàn)有研究表明其機(jī)制包括 DNA 損傷、端?？s短、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高、表觀遺傳修飾、細(xì)胞極性改變、代謝及造血微環(huán)境等幾方面[7, 17]。本研究顯示,環(huán)磷酰胺注射后小鼠外周血WBC、NETU、LYMPH顯著下降,脾、胸腺器官指數(shù)顯著降低,髂骨骨髓中造血細(xì)胞數(shù)明顯減少,造血組織間隙較大,說(shuō)明化療藥可損傷骨髓造血組織,進(jìn)而降低機(jī)體免疫功能。此外,SA-β-Gal作為細(xì)胞衰老標(biāo)志性的酶類(lèi)物質(zhì),化療藥還明顯增加了小鼠骨髓造血細(xì)胞中SA-β-Gal含量,p53/p21途徑是一條經(jīng)典的衰老相關(guān)途徑,上調(diào)p53和p21基因及蛋白的表達(dá),提示化療藥可引起骨髓造血細(xì)胞衰老,并影響與細(xì)胞衰老相關(guān)的p53/ p21途徑。采用DBD防治后,小鼠外周血WBC顯著上升,脾器官指數(shù)顯著升高,骨髓中造血細(xì)胞數(shù)明顯增加,空腔明顯減少,說(shuō)明DBD可保護(hù)骨髓造血組織,提高機(jī)體免疫功能。此外,DBD組骨髓造血細(xì)胞中衰老相關(guān)的SA-β- Gal含量顯著降低且與衰老相關(guān)p53和p21基因和蛋白的表達(dá)降低,此二個(gè)指標(biāo)提示DBD對(duì)于防治骨髓造血細(xì)胞的衰老發(fā)揮了作用。

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)造血微環(huán)境而引起造血干細(xì)胞衰老,并參與干細(xì)胞增殖、凋亡等生命過(guò)程[8]。β-catenin為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的核心蛋白[18],GSK-3β蛋白可通過(guò)促進(jìn)β-catenin N端的Ser/Thr磷酸化而使β-catenin降解[19],從而調(diào)節(jié)β-catenin的細(xì)胞內(nèi)含量。根據(jù)相關(guān)研究表明:DBD中共有兩味中藥,其中當(dāng)歸中的當(dāng)歸多糖影響Wnt信號(hào)通路上中下游并且當(dāng)歸多糖可以通過(guò)Wnt信號(hào)通路來(lái)延緩衰老模型大鼠造血干細(xì)胞的衰老情況[20-21],另一項(xiàng)研究中提出當(dāng)歸多糖可以下調(diào)Wnt通路中β-catenin、Wnt 4a、GSK-3β、MMP-13和ADAMTS4的表達(dá)[22];黃芪中的黃芪多糖能夠通過(guò)上調(diào)β-catenin基因、下調(diào)Axin-1基因的表達(dá)影響Wnt通路[23];黃芪甲苷能夠上調(diào)腦缺血再灌注損傷模型中 Wnt 家族重要蛋白 Wnt3a 及下游β-catenin的表達(dá),同時(shí)通過(guò)提高BNDF和TCF-4蛋白水平影響HepG-2細(xì)胞的增殖和凋亡[24-25];黃芪總黃酮下調(diào)強(qiáng)直性脊柱炎模型中Wnt1和β-catenin蛋白的表達(dá)[26];黃芪總皂苷通過(guò)上調(diào)Wnt通路上游蛋白 Wnt3/3a和樞紐蛋白 β- catenin ,上調(diào)下游促分化靶向蛋白 Ngn1的表達(dá)影響Wnt通路[27]。研究DBD對(duì)于β-catenin蛋白的影響是研究Wnt通路的關(guān)鍵,本次研究中β- catenin蛋白模型對(duì)照組表達(dá)明顯上升說(shuō)明此模型中Wnt通路被激活,DBD高劑量組的β- catenin基因和蛋白表達(dá)下調(diào)以及GSK-3βmRNA表達(dá)上調(diào)都提示該劑量的DBD對(duì)于此通路起到了抑制作用。

綜上所述,本次研究說(shuō)明DBD對(duì)于防治化療后骨髓造血細(xì)胞的衰老有明顯的作用,為探究DBD防治化療后骨髓造血細(xì)胞衰老的機(jī)制提供了研究結(jié)果和思路,其中DBD高劑量組的藥效結(jié)果最好。提示臨床上對(duì)于需要放化療的患者可以提前服用并適當(dāng)增加DBD的劑量以保護(hù)骨髓造血細(xì)胞,對(duì)于放化療后引起的骨髓抑制貧血的副作用進(jìn)行預(yù)防。