黃子彥,張亞光,陳豪特,王權(quán)勝△

(1.廣西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,南寧 530001;2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,南寧 530023;3.廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學分子生物重點實驗室,南寧 530023;4.杭州市中醫(yī)院,杭州 310007)

少弱精子癥是導致男性不育的重要原因之一,中醫(yī)藥治療少弱精子癥存在優(yōu)勢[1-2],而續(xù)斷種子方對于少弱精子癥存在治療效果,其在臨床研究與基礎(chǔ)研究方面有著一定前期基礎(chǔ)[3-5]。2021年第6版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢測與處理實驗室手冊》精子總數(shù)與前向運動精子兩項較第5版數(shù)值略有降低[6],提示人類精子質(zhì)量存在逐步下降的可能性。精子的發(fā)生發(fā)育過程具有程序化的特征,即“精原細胞-精母細胞-精子細胞-精子”的生長發(fā)育與減數(shù)分裂的鏈式過程,在此過程中精子產(chǎn)生于睪丸,成熟于附睪[7],附睪尾部和精液中精子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能的完整性存在差異,這一過程中的各個時間空間節(jié)點異常都有可能影響精子的數(shù)量與活動力[8],如精索靜脈曲張、男性生殖系感染、糖尿病與慢性肝炎等全身性疾病、抗精子抗體、單核苷酸多態(tài)性、基因變異等[9-10],而在附睪部分主要與附睪分泌蛋白、附睪內(nèi)細胞因子等附睪微環(huán)境因素有關(guān)。酪氨酸蛋白激酶2/信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3,JAK2/STAT3)信號通路廣泛參與細胞應(yīng)激、增殖、分化和凋亡等多種生物效應(yīng),與精子形態(tài)功能關(guān)系密切[11]。本研究通過建立實驗性大鼠少弱精子癥模型,嘗試從JAK2/STAT3通路基于附睪管局部顯微、超微結(jié)構(gòu)研究續(xù)斷種子方對少弱精子癥模型大鼠附睪微環(huán)境的作用,續(xù)斷種子方干預少弱精子癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

48只雄性SD大鼠,6～8周齡,體質(zhì)量200～220 g(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,SCXK(湘)2019-0014)。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學分子生物重點實驗室動物房,溫度19～25 ℃,濕度55%～65%,每日光照10～12 h,自由進食飲水,3 d更換一次籠中玉米芯墊料。

1.2 主要試劑與儀器

JAK2抗體、STAT3抗體購自美國CST公司,貨號分別為3230、9139;WLJY-9000型精子質(zhì)量檢測系統(tǒng),北京偉力新世紀科技發(fā)展有限公司;Finesse E型半自動輪轉(zhuǎn)切片機,美國Thermo Fisher公司;EG1150H+C型石蠟包埋機,德國Leica公司;BX43型倒置相差顯微鏡,日本Olympus公司;JY-ZY3型半干式轉(zhuǎn)移電泳槽,濟南君意生物科技有限公司;5200 Multi型全自動化學發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng),上海天能科技有限公司;XH-C型渦旋混合器,江蘇榮華實驗器材有限公司;Epoch型酶標儀,美國BioTek公司;DYCZ-25E型電泳儀,北京六一生物科技有限公司;5430 R型臺式冷凍離心機,德國Eppendrof公司;Tecnai G220型透射電子顯微鏡,美國FEI公司。

1.3 制備藥物

續(xù)斷種子方顆粒劑(主要藥物組成:菟絲子10 g、杜仲10 g、續(xù)斷10 g、骨碎補10 g、女貞子10 g、枸杞子10 g、黨參10 g、白術(shù)10 g、山藥10 g),劑型采用天江藥業(yè)免煎顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司,藥品許可證號:1203002);左卡尼汀口服溶液(東北制藥總廠,國藥準字H19990372,規(guī)格:10 mL);注射用環(huán)磷酰胺(德國Baxter公司,進口藥品注冊證號:H20160467,規(guī)格:0.2 g)。

1.4 分組與制作動物模型

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,在此過程中每日觀察大鼠進食、飲水、活動是否正常,然后制作動物模型,按照隨機數(shù)字表法將48只大鼠隨機分為模型組、續(xù)斷種子方組、左卡尼汀組、空白組,每組12只。除空白對照組大鼠外,其他組大鼠均采用 80 mg/kg/d環(huán)磷酰胺以0.9%氯化鈉溶液稀釋后連續(xù)7 d腹腔注射造模[12],造模完成后通過精子質(zhì)量檢測造模是否成功。

1.5 給藥

造模第8天開始給藥,模型組大鼠每天給予0.9%氯化鈉溶液4 mL灌胃;續(xù)斷種子方組予續(xù)斷種子方配方顆粒10 g/kg/d溶于0.9%氯化鈉溶液灌胃,左卡尼汀組予左卡尼汀口服溶液100 mg/kg/d溶于0.9%氯化鈉溶液灌胃;持續(xù)8周。

1.6 觀察與檢測

1.6.1 精子質(zhì)量檢測 末次給藥后斷頸處死大鼠,摘取各組大鼠附睪組織,沖洗、剪碎、浸泡,參考WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》標準測定精子參數(shù)[6]。

1.6.2 大鼠附睪組織顯微及超微結(jié)構(gòu)觀察 取大鼠附睪組織,固定、包埋、切片機連續(xù)切片,脫蠟后進行HE染色,封片后光學顯微鏡觀察并拍照,光鏡下觀察各組附睪組織常規(guī)病理變化,包括結(jié)構(gòu)完整性、附睪上皮、生精細胞、精子、附睪間質(zhì)等。取2 mm3附睪組織,加入2.5%戊二醛,在4 ℃保存,經(jīng)固定、滲透,后將標本放入包埋板中固定48 h,超薄切片機切片,厚度80～100 nm,鈾鉛雙染色標本,最后用電鏡觀察。電鏡下觀察各組附睪組織超微結(jié)構(gòu)變化,如細胞核、染色質(zhì)、溶酶體、核仁、線粒體等。

1.6.3 Western blot檢測JAK2和STAT3蛋白表達 將附睪組織用研磨儀研磨粉碎,加入蛋白裂解液,充分裂解,重復5次;4 ℃ 10 000 g離心10 min,取上清液,加蛋白上樣緩沖液,煮沸10 min,使用10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel,SDS-PAGE) ,電泳、分離蛋白,然后修剪,根據(jù)膠的大小剪好吸水紙和聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,并放入轉(zhuǎn)膜液中浸泡,放入電轉(zhuǎn)槽中轉(zhuǎn)膜,再用5%脫脂牛奶搖床上孵育45 min,取出封閉過后的膜震蕩洗滌,加入JAK2(1:1 000)、STAT3(1:1 000)一抗4 ℃孵育過夜,放入緩沖液中震蕩洗滌,再加入二抗孵育1 h,用TBST緩沖液洗膜,顯色后在成像系統(tǒng)進行曝光成像,應(yīng)用Image J軟件對蛋白條帶進行分析。

1.6.4 免疫組化檢測JAK2和STAT3蛋白表達 取附睪組織石蠟切片5 μm,滴加3%的過氧化氫,5%牛血清白蛋白溶液封閉后,分別加JAK2(1:200)、STAT3(1:200)一抗,4 ℃恒溫過夜、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗后,滴加二抗,然后顯色、復染,脫水封片后鏡檢并拍照,陽性細胞染成棕黃色,使用Image J軟件分析目標蛋白平均光密度值。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

造模后的3組大鼠均出現(xiàn)不同程度的進食和飲水減少,精神不振,毛發(fā)光澤度降低、干枯掉落,活動減弱等表現(xiàn);空白組大鼠外觀、飲食與活動情況未見明顯異常。在給藥期間部分大鼠脫落,原因可能與環(huán)磷酰胺毒性或捕捉灌胃應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

2.2 續(xù)斷種子方對模型大鼠精子濃度及總活動力的影響

與空白組大鼠比較,模型組大鼠的精子濃度與總活動力明顯下降(P<0.01);與模型組大鼠比較,續(xù)斷種子方組大鼠的精子濃度與總活動力明顯上升(P<0.01);與左卡尼汀組大鼠比較,續(xù)斷種子方組大鼠的精子濃度與總活動力上升(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠附睪精子濃度及總活動力

2.3 續(xù)斷種子方對大鼠附睪物理支持結(jié)構(gòu)的影響

光鏡下,模型組大鼠附睪結(jié)構(gòu)完整性可見明顯破壞,病理改變呈區(qū)段性。上皮細胞數(shù)量較少,管腔中存在非精子成分,精子濃度較低且分布不均勻,附睪間質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)缺損,見圖1A。續(xù)斷種子方組大鼠附睪各區(qū)段結(jié)構(gòu)相對完整,細胞排列整齊,附睪間質(zhì)稍見水腫,部分巨噬細胞與淋巴細胞浸潤,管腔內(nèi)刷狀緣形態(tài)基本正常,含大量成熟精子,與少量畸形、不成熟精子,見圖1B。左卡尼汀組大鼠附睪上皮完整度較模型組高,細胞排列整齊,偶可見上皮退化、變形,精子濃度較模型組高,有部分畸形精子存在,附睪間質(zhì)輕度水腫,微小血管擴張,見圖1C?？瞻捉M大鼠附睪組織結(jié)構(gòu)完整,刷狀緣形態(tài)正常,附睪上皮細胞層次清晰,排列整齊有序,管腔內(nèi)精子密集,見圖1D。

電鏡下,模型組大鼠附睪上皮細胞排列紊亂松散,可見主要為單層排列,游離面微絨毛大幅度減少,部分細胞呈空泡樣變性。細胞核較小、畸形或呈固縮狀態(tài),核膜褶皺,核內(nèi)染色質(zhì)分散,核仁未窺及,可見細胞質(zhì)中的線粒體腫脹且數(shù)量明顯少于空白組,部分上皮細胞甚至出現(xiàn)空泡樣變。附睪管腔面可見脫落胞質(zhì),管腔內(nèi)多為不成熟、畸形精子,見圖2A。續(xù)斷種子方組大鼠附睪上皮細胞超微結(jié)構(gòu)與空白組大鼠相近,細胞排列較整齊致密且形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,游離面微絨毛較模型組豐富,部分細胞空泡化程度較模型組輕。細胞核多位于基底部,大小適中,核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布,核仁明顯,核膜出現(xiàn)部分皺折,局部偶有內(nèi)陷,細胞質(zhì)內(nèi)細胞器結(jié)構(gòu)相對完整,圓形線粒體、溶酶體較豐富,高爾基體較模型組多。附睪管腔內(nèi)雖可見小部分畸形精子,但結(jié)構(gòu)正常的成熟精子占多數(shù),見圖2B。左卡尼汀組大鼠附睪上皮細胞排列整齊,游離面微絨毛較模型組明顯豐富。細胞核細胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)相對完整,線粒體數(shù)量較多,層次分明。相較于模型組大鼠,空泡樣改變的細胞較少且附睪管腔內(nèi)結(jié)構(gòu)正常的精子較多,見圖2C?？瞻捉M大鼠附睪上皮細胞結(jié)構(gòu)完整且邊緣清楚,可見正常形態(tài)結(jié)構(gòu)的細胞,排列整齊嚴密有序,細胞核較大,基膜連續(xù)完整,核仁清晰明顯,核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻,附睪管管腔中成熟精子大量存在,見圖2D。

2.4 Western blot檢測JAK2和STAT3蛋白表達

各組大鼠Western blot檢測分析結(jié)果顯示,與空白組大鼠比較,模型組大鼠JAK2、STAT3在附睪組織中的表達水平明顯下降(P<0.01);與模型組大鼠比較,續(xù)斷種子方組大鼠JAK2、STAT3在附睪組織中的表達水平明顯上升(P<0.01),左卡尼汀組大鼠JAK2表達明顯上升(P<0.01),STAT3表達上升(P<0.05),見圖3。

注:與模型組比較*P<0.05,**P<0.01;與左卡尼汀組比較##P<0.01;酪氨酸蛋白激酶2(JAK2),信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)A.模型組;B.續(xù)斷種子方組;C.左卡尼汀組;D.空白組

A.模型組;B.續(xù)斷種子方組;C.左卡尼汀組;D.空白組

A.模型組;B.續(xù)斷種子方組;C.左卡尼汀組;D.空白組

2.5 免疫組化法檢測JAK2與STAT3表達

如圖4所示,模型組大鼠JAK2蛋白棕黃色陽性表達低見圖4A;續(xù)斷種子方組大鼠見圖4B與左卡尼汀組大鼠見圖4C的JAK2蛋白棕黃色陽性表達較模型組高;空白組大鼠JAK2蛋白棕黃色陽性表達最高,見圖4D。

如圖5所示,模型組大鼠STAT3免疫組化棕黃色陽性表達低,見圖5A;與模型組大鼠比較,續(xù)斷種子方組大鼠(圖5B)與左卡尼汀組大鼠(圖5C)附睪的STAT3棕黃色陽性表達更高;空白組大鼠STAT3免疫組化中棕黃色陽性表達最高(圖5D)。另外,STAT3蛋白在模型大鼠附睪中的精子頭部表達相對豐富。

如圖6所示,與空白組大鼠比較,模型組大鼠JAK2、STAT3表達明顯下降(P<0.01);與模型組大鼠比較,續(xù)斷種子方組大鼠和左卡尼汀組大鼠JAK2、STAT3表達明顯上升(P<0.01)。

注:與模型組比較**P<0.01;與左卡尼汀組比較##P<0.01;酪氨酸蛋白激酶2(JAK2),信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)A.模型組;B.續(xù)斷種子方組;C.左卡尼汀組;D.空白組

3 討論

JAK2/STAT3通路能介導來自多種細胞因子的信號轉(zhuǎn)導,在多種致病因素的侵襲導致相關(guān)細胞因子的釋放和疾病的進展中發(fā)揮重要作用,參與調(diào)控細胞的增殖凋亡過程[13-15],亦是各種理化因素誘導的廣泛的組織細胞損傷及相應(yīng)病理改變的機制之一[16-18],與細胞的各種生理和病理功能有關(guān),其關(guān)鍵蛋白在精子中與激活核轉(zhuǎn)錄、精卵識別與精子活動相關(guān)。精子活動能源在于線粒體,在精子中,STAT3主要富集于頭部與鞭毛部位,STAT3受抑制后,線粒體膜去極化上升,伴隨ROS與ATP水平的變化與精子活動力的下降。因此氧化損傷與細胞凋亡相關(guān)的附睪輸出小管上皮結(jié)構(gòu)完整性與內(nèi)環(huán)境受破壞,分泌功能失調(diào),JAK2/STAT3信號通路的抑制,精子數(shù)量減少,活動力下降,可能是少弱精子癥的發(fā)病機制之一。附睪是精子發(fā)育成熟的重要場所,精子在附睪中成熟過程的分子機制與參與免疫反應(yīng)、細胞運動、精子成熟、精子儲存和獲能的某些RNA有關(guān)[19],附睪中的特異性蛋白質(zhì)在精子發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用,如直接參與附睪中精子的成熟、獲能、頂體反應(yīng)與精卵結(jié)合,與管腔液其他成分形成動態(tài)平衡的附睪微環(huán)境,以及免疫保護、抗菌、抗氧化等作用[20]。環(huán)磷酰胺、熱刺激、奧硝唑等各種造模方式導致大鼠睪丸和附睪物理支持結(jié)構(gòu)的破壞與精子發(fā)生發(fā)育的時空節(jié)點受到干擾,進而使得生殖機能出現(xiàn)缺陷[21]。附睪頭部有自己的組織學特征和明確的同質(zhì)化基因表達模式,專門用于防御和免疫反應(yīng)以及受精,遠端體和附睪尾部因數(shù)量有限的差異表達基因而不同。附睪這種顯著的區(qū)域性物理支持結(jié)構(gòu)具有相當?shù)目臻g特征,與精子在附睪中發(fā)育成熟處于不同時間段的時間特征共同構(gòu)成了附睪結(jié)構(gòu)與功能時空節(jié)點相關(guān)的微環(huán)境。

通過本次實驗我們發(fā)現(xiàn)大鼠附睪顯微超微結(jié)構(gòu)的病理改變與精子濃度、活動力可能存在密切聯(lián)系。一方面環(huán)磷酰胺給藥能導致模型大鼠導致丙二醛、亞硝酸鹽和過氧化氫水平顯著升高,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性顯著降低。此外,血漿促黃體生成素、卵泡刺激素和睪酮水平降低[22];另一方面,附睪區(qū)段性上皮退化變性,同一層面的細胞發(fā)育不同步,附睪管柱狀上皮細胞退行性改變,基底部胞質(zhì)空泡化,各級細胞排列紊亂甚至脫落,部分主細胞、基細胞空泡樣變,附睪管壁結(jié)構(gòu)完整性被破壞,附睪管腔中精子數(shù)目明顯減少,非精子細胞成分增加,附睪間質(zhì)水腫,精子尾部線粒體鞘部分缺失,線粒體溢出,內(nèi)部結(jié)構(gòu)崩解碎裂導致附睪內(nèi)分泌功能和附睪管腔內(nèi)液的成分改變,直至微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)被破壞從而影響精子發(fā)生發(fā)育。

本研究以模型大鼠為研究對象,采用補腎健脾益氣的方法進行治療,續(xù)斷種子方這一中藥方劑的組方思路源自中醫(yī)學經(jīng)典著作《醫(yī)學正印》里的補腎健脾益氣種子煎方,基于“種子土壤學說”的理論且謹守少弱精子癥“營氣不從”的機制遣藥組方,方中續(xù)斷、杜仲、菟絲子行少陰益腎溫補填其先天之精,山藥、黨參、白術(shù)和緩甘平,走太陰健脾養(yǎng)其后天水谷之精,骨碎補、枸杞子佐助續(xù)斷強腎益陽之效,女貞子系方中陽中之陰,陰陽并補則生精有源。本實驗研究結(jié)果表明:各組大鼠附睪組織中均有JAK2蛋白和STAT3蛋白的表達,模型組大鼠JAK2蛋白和STAT3蛋白的表達量低于其他3組大鼠,提示少弱精子癥的發(fā)生機制可能與附睪JAK2/STAT3信號通路受抑制有關(guān),續(xù)斷種子方有可能通過活化JAK2/STAT3信號通路培育附睪精子發(fā)育成熟的微環(huán)境,有利于精子結(jié)構(gòu)的塑造和獲能。這與本方“精氣互用”改善人體的虛勞狀態(tài)的中醫(yī)藥理論基本一致[23],為中醫(yī)辨證論治少弱精子癥提高其精子質(zhì)量與配偶妊娠率提供可行的治療途徑。

綜上所述,續(xù)斷種子方可能通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號通路維護模型大鼠附睪組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,培育附睪精子發(fā)育成熟的微環(huán)境,有利于精子結(jié)構(gòu)的塑造和獲能。