張玉偉,孟雅楠,張馨月,苗宇船,△

(1.山西省中醫(yī)藥研究院,太原 030000;2.山西中醫(yī)藥大學,山西晉中 030619)

近年來隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的巨大變化,代謝相關(guān)性疾病逐漸呈現(xiàn)出全球性大流行的態(tài)勢,其中非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)的發(fā)病率更是居高不下。運用代謝組學技術(shù)可以對樣本進行高通量檢測,篩查與NASH相關(guān)的差異代謝物與代謝途徑,為NASH的基礎(chǔ)研究尋找新靶點、開拓新思路[1-2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),逍遙丸具有疏肝解郁、養(yǎng)血健脾的功效,能夠減少肝細胞內(nèi)脂肪蓄積,治療NASH,然而其作用機制尚不明確[3-5]。本研究建立大鼠NASH模型,運用高通量液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS)技術(shù),觀察逍遙丸對NASH模型大鼠糞便代謝產(chǎn)物及相關(guān)代謝通路的影響,從分子生物學角度揭示逍遙丸治療NASH的潛在靶點,可為闡明NASH的發(fā)病機制、治療途徑及藥物研發(fā)提供依據(jù)。本實驗已通過山西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審批,編號:2021081001。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠24只,體質(zhì)量(220±20)g,購自湖南斯萊克實驗動物有限公司,許可證號:SXK(湘)2019-0004,飼養(yǎng)于江西中洪博元生物技術(shù)有限公司實驗動物中心,溫度(22±2)℃,濕度50%～60%,12 h光照。

1.2 藥物

四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)購自天津大茂化學試劑有限公司,貨號:AR-M1896。 逍遙丸購自太極集團重慶中藥二廠有限公司,規(guī)格:1.24 g/3丸,國藥準字:Z50020454。

1.3 主要試劑

大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)試劑盒(貨號C009-2-1)、總膽固醇(total cholesterol,T-CHO)試劑盒(貨號A111-1-1)、甘油三酯(triglycerides,TG)試劑盒(貨號A110-1-1)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)試劑盒(貨號A113-1-1),南京建成生物工程研究所;大鼠白介素(interleukin,IL)-1β試劑盒(貨號RA20020)、IL-6試劑盒(貨號RA20607)、IL-10試劑盒(貨號RA20090),武漢貝茵萊生物科技有限公司;蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色液(貨號DH0006),北京雷根生物技術(shù)有限公司;飽和油紅O染色液(貨號G1260),北京索萊寶科技有限公司;雙巰基苯甲酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒(貨號AR0146)、二抗(貨號BA1054),武漢博士德生物工程有限公司;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(貨號P0012A),碧云天生物技術(shù)有限公司;GAPDH(貨號AP0063),美國Bioworld公司;過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha,PPARα)抗體(貨號ab227074),英國Abcam公司;過氧化物酶體增殖子活化受體γ共激活因子(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator,PGC)-1α抗體,貨號(A12348),武漢愛博泰克生物科技有限公司;超敏增強型化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)顯色液(貨號MAO186),大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器

SpecfraMay型全波長酶標儀,美國Molecular Device公司;EG115型石蠟包埋機、RM223型切片機、CM1950型冰凍切片機、DM40008型正置熒光顯微鏡,德國Leica公司;164-5050型電泳儀、165-6001型電泳槽、170-3930型轉(zhuǎn)印槽,美國 Bio-Rad 公司;ChampChemi professional型全自動多色熒光及化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng),北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

2 方法

2.1 分組與干預(yù)

24只雄性SD大鼠,適應(yīng)性飼喂1周后隨機分為對照組、模型組與治療組,每組各8只。對照組大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料;模型組和治療組大鼠飼喂高糖高脂飼料,并于第3周開始以0.2 mL/100 g劑量在背部皮下注射CCl4豆油溶液(CCl4:豆油=2:3),每周2次,共注射2周。第5周開始停止造模,同時給予對照組和模型組大鼠0.9%氯化鈉溶液2 mL灌胃,治療組大鼠給予等體積逍遙丸水溶液灌胃,連續(xù)給藥4周。逍遙丸水溶液按成人每日所需藥量換算為大鼠等效藥量,即成人每日需服用濃縮丸9丸(1次3丸,1日3次),重3.72 g,大鼠每日所需藥量則為3.72 g×0.018/0.2 kg=0.3348 g/kg(0.018為大鼠體表面積轉(zhuǎn)換系數(shù))。每周稱取大鼠體質(zhì)量并相應(yīng)調(diào)整藥量。

2.2 取材

末次給藥后所有大鼠均禁食禁飲12 h,戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉,腹主動脈取血,收集上清于-80 ℃?zhèn)溆?稱取各組大鼠肝臟質(zhì)量并記錄;各組大鼠部分肝臟用4%多聚甲醛固定,4 ℃?zhèn)溆?部分肝臟組織于-80 ℃保存?zhèn)溆?。收集新鮮糞便標本,迅速液氮淬滅,-80 ℃冰箱保存,足量干冰低溫送檢。

2.3 指標檢測

2.3.1 一般情況 觀察并記錄各組大鼠的精神狀態(tài)、活動度、毛發(fā)、攝食量、糞便等。

2.3.2 肝指數(shù)和體質(zhì)量指數(shù) 計算各組大鼠肝指數(shù)和體質(zhì)量指數(shù)。肝指數(shù)=肝臟(kg)/體質(zhì)量(kg)×100%。體質(zhì)量指數(shù)=體質(zhì)量(kg)/身長2(m2)。

2.3.3 肝臟組織病理學觀察 取出固定液中的肝臟,石蠟包埋、切片,HE染色觀察肝細胞形態(tài);取出-80 ℃保存的部分肝臟,制備冰凍切片,油紅O染色觀察肝細胞內(nèi)脂滴數(shù)量。

2.3.4 血清實驗室指標檢測 比色法、ELISA法檢測各組大鼠血清ALT、T-CHO、TG、LDL-C、IL-1β、IL-6、IL-10含量。

2.3.5 LC-MS檢測糞便代謝物譜

2.3.5.1 LC-MS備樣 取大鼠糞便樣本0.2 g,加400 μL預(yù)冷的80%乙腈混勻,離心后取上清過濾,裝入液相小瓶。每個樣本取10 μL混合制成質(zhì)控(quality control,QC)樣本。

2.3.5.2 LC-MS實驗條件設(shè)置 液相條件:Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)。流動相:A(0.1%甲酸水),B(0.1%甲酸,乙腈);流動相梯度:0～2 min,98%～98% A;2～3 min,98%～65% A;3～17 min,65%～30% A;17～18 min,30% A;18～29 min,30%～2% A;29～31 min,2%A;31～33 min,2%～98% A;33～35 min,98% A。進樣量:5 μL,流速:0.2 mL/min,柱溫:40 ℃。

質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源(ESI),正負離子模式采集,full scan/dd-MS2掃描模式,掃描范圍100～1 500 m/z;噴霧電壓3.5 kV(ESI+)和2.5 kV(ESI-);毛細管溫度320 ℃;加熱器溫度300 ℃;鞘氣流速35 arb,輔助氣流速10 arb;分辨率為MS full scan 35 000FWHM以及MS/MS17 500FWHM,NCE12.5、25和37.5 eV。

2.3.5.3 數(shù)據(jù)分析 運用SIMCA-P 14.1軟件進行多元統(tǒng)計分析,不同組間的分離度用偏最小二乘法判別分析(partial least squaresdiscriminate analysis,PLS-DA)展示,模型驗證通過置換測試的響應(yīng)值以及R2(模型適應(yīng)度)和Q2(預(yù)測能力)進行,驗證200次。正交偏最小二乘法判別(orthogonal PLS-DA,OPLS-DA)分析對照組與模型組之間的代謝差異,S-plot曲線中,距離原點越遠,貢獻越大。差異代謝物篩選標準為變量重要性值投影(variable importance in projection,VIP)>1和P<0.05。進一步根據(jù)MetaboAnalyst 5.0通路富集分析Pvalues值和通路拓撲學分析Impact values篩選最相關(guān)的作用通路。

2.3.6 Western blot檢測肝組織PPARα、PGC1α蛋白表達 取大鼠部分肝臟組織,冰上快速提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度,電泳分離條帶,轉(zhuǎn)膜,封閉,分別加入一抗PPARα(1:1 000)、PGC1α(1:1 000)、GAPDH(1:10 000),4 ℃孵育過夜,二抗(1:10 000)室溫搖床孵育2 h, ECL 化學發(fā)光法顯影,ImageJ 軟件分析目的條帶灰度值。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 一般情況比較

給藥期間,對照組大鼠精神佳,毛發(fā)細膩光澤,活動靈敏,食量、二便未見異常;模型組大鼠毛發(fā)晦暗、枯燥,早期暴躁、易激惹,后期情緒低落、食量下降、倦怠少動,大便稀溏;治療組較模型組大鼠一般情況有明顯改善。

3.2 各組大鼠肝指數(shù)、體質(zhì)量指數(shù)、血清生化指標比較

與對照組比較,模型組大鼠肝指數(shù)、ALT、T-CHO、TG及LDL-C含量顯著升高,體質(zhì)量指數(shù)顯著下降(P<0.01);與模型組比較,治療組大鼠肝指數(shù)、ALT、T-CHO、TG及LDL-C含量均顯著下降,體質(zhì)量指數(shù)顯著升高(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠肝指數(shù)、體質(zhì)量指數(shù)及血清ALT、T-CHO、TG、LDL-C含量比較

3.3 各組大鼠肝組織病理比較

3.3.1 HE染色結(jié)果

光鏡下觀察HE染色大鼠肝組織石蠟切片,對照組大鼠肝細胞結(jié)構(gòu)完整,核清晰,細胞索排列有序,中央靜脈向四周呈放射狀排列,肝竇正常;與對照組比較,模型組大鼠肝細胞結(jié)構(gòu)紊亂、體積增大,細胞內(nèi)可見大量脂肪空泡、細胞核被擠壓至邊緣,炎性細胞浸潤明顯,未見明顯的纖維化和假小葉形成;與模型組比較,治療組大鼠肝細胞結(jié)構(gòu)較為完整,肝細胞內(nèi)脂肪空泡減少,炎性細胞浸潤明顯減輕,見圖1。

3.3.2 油紅O染色結(jié)果

光鏡下觀察油紅O染色大鼠肝組織冰凍切片,對照組大鼠肝組織未見異常;與對照組比較,模型組大鼠肝組織可見大量的紅色脂滴,大小不等,甚至融合成片;與模型組比較,治療組大鼠肝組織脂滴含量顯著減少,見圖2。

圖2 各組大鼠肝組織冰凍切片油紅O染色

3.4 各組大鼠血清炎癥因子含量比較

與對照組比較,模型組大鼠血清IL-1β、IL-6含量顯著升高,IL-10含量顯著降低(P<0.01);與模型組比較,治療組大鼠血清IL-1β、IL-6含量顯著降低,IL-10含量顯著升高(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6及IL-10含量比較

3.5 各組大鼠糞便代謝組學檢測結(jié)果

3.5.1 代謝輪廓分析

PLS-DA結(jié)果顯示,對照組和模型組大鼠糞便樣本數(shù)據(jù)區(qū)分明顯,提示NASH模型復(fù)制成功,見圖3A。PLS-DA模型驗證采用排列實驗(permutation test),設(shè)定檢驗次數(shù)為200,R2和Q2的所有排列值均小于原始值或Q2的回歸線與縱軸相交數(shù)值小于零,且R2和Q2值均接近于1,證明實驗?zāi)Ｐ头€(wěn)定可靠,見圖3B。對所有組別進行PLS-DA分析,3組大鼠數(shù)據(jù)均能明顯分開,表明逍遙丸對NASH引起的大鼠代謝功能紊亂有一定的改善作用。且PLS-DA的QC樣本聚在一起,表明系統(tǒng)的穩(wěn)定性良好,見圖3E。

注:“CON”為對照組,“MON”為模型組,“XYW”為治療組;“QC”為質(zhì)控樣本A.對照組與模型組PLS-DA得分圖;B.PLS-DA模型驗證圖;C.對照組與模型組OPLS-DA得分圖;D.S-plots圖;E.不同組別大鼠糞便樣本數(shù)據(jù)PLS-DA得分圖

3.5.2 差異代謝物分析

取對照組和模型組大鼠糞便樣本數(shù)據(jù)進行OPLS-DA分析,尋找與NASH相關(guān)的差異代謝物。根據(jù)S-Plots圖中的VIP值(VIP>1)和t檢驗(P<0.05)結(jié)果,篩選出對組分貢獻較大的代謝物。結(jié)果表明,與對照組比較,模型組大鼠糞便中乙酰左旋肉堿、組胺、丙酮酸、L-絲氨酸、胞嘧啶等57個代謝物發(fā)生了顯著性變化,給予逍遙丸干預(yù)后,25個差異代謝物的含量出現(xiàn)顯著性改善,見圖4。

圖4 各組大鼠糞便樣本的LC-MS正負離子總離子圖

3.5.3 代謝通路分析

MetaboAnalyst 5.0通路富集分析結(jié)果(圖5)顯示,模型組大鼠糞便中的差異代謝物涉及10條與NASH最相關(guān)的代謝途徑(pathway impact>0.1)。具體包括: a.D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝;b.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝;c.組氨酸代謝;d.精氨酸生物合成;e.嘌呤代謝;f.精氨酸和脯氨酸代謝;g.甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝;h.半胱氨酸與蛋氨酸代謝;i.苯丙氨酸代謝;j.氨酰-tRNA生物合成,見圖5A。進一步研究表明,給予逍遙丸干預(yù)后,其中5條代謝通路發(fā)生了一定的變化,見圖5B。

A.與NASH相關(guān)的代謝通路分析;B.逍遙丸干預(yù)后的代謝通路分析

3.6 各組大鼠肝臟組織PPARα、PGC1α蛋白表達比較

與對照組比較,模型組大鼠肝臟組織PPARα、PGC1α蛋白表達顯著下降(P<0.01);與模型組比較,治療組大鼠肝臟組織PPARα、PGC1α蛋白表達顯著升高(P<0.05),見圖6、表3。

注:過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα),過氧化物酶體增殖子活化受體γ共激活因子-1α(PGC1α)

表3 各組大鼠肝臟組織PPARα、PGC1α蛋白表達比較

4 討論

高糖高脂飲食誘導(dǎo)NASH的造模方法有操作簡單、重復(fù)性好、動物死亡率低、與人類病變的形成過程有較高的相似性等優(yōu)點,但造模周期長,模型動物在短期內(nèi)不易表達明顯的疾病表型,不利于進行機制研究。CCl4皮下注射可誘導(dǎo)形成以肝細胞單純性大皰性脂肪變?yōu)橹鞯腘ASH病變,其造模速度快、肝臟病理變化與人類NASH相似[6]。本實驗采用高糖高脂飲食+40% CCl4豆油溶液皮下注射的復(fù)合造模方法,能夠大大縮短造模時間,增加模型穩(wěn)定性,用藥4周后通過血清生化及炎癥指標、肝臟病理學檢測,證明NASH模型復(fù)制成功[7]。

PPARα和PGC1α是脂肪酸β氧化的主要調(diào)控因子,在肝臟中高表達,主要通過調(diào)控過氧化物酶、線粒體和微粒體氧化代謝體系上關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄表達而發(fā)揮作用[8-11]。正常機體內(nèi)PPARα、 PGC1α有較高表達,當其受到抑制時,肝組織內(nèi)脂肪酸代謝通路上起關(guān)鍵作用的限速酶轉(zhuǎn)錄異常,導(dǎo)致脂肪在肝細胞內(nèi)不能正常氧化分解而過度沉積,同時還可引發(fā)炎性細胞聚集,從而加劇NASH的發(fā)生發(fā)展。眾多研究也已證實,NASH發(fā)生時,肝臟中PPARα與PGC1α表達下降[12-15]。本實驗中模型組大鼠肝臟組織中PPARα與PGC1α的蛋白表達降低證實了脂肪酸代謝異常在NASH模型中確實存在。

本實驗采用LC-MS技術(shù)對NASH大鼠糞便代謝產(chǎn)物進行高通量分析,通過多元統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),模型組大鼠糞便中乙酰左旋肉堿含量明顯減少,提示脂肪酸進入線粒體參與氧化代謝受阻,即出現(xiàn)了脂肪酸氧化代謝障礙。乙酰左旋肉堿將脂肪酸從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至線粒體,在線粒體內(nèi)參與脂肪酸氧化過程中能量的產(chǎn)生和釋放[16]。另一方面,乙酰左旋肉堿不僅為脂肪酸的氧化提供能量,還可以消除使細胞膜不穩(wěn)定的自由基。乙酰左旋肉堿濃度降低可導(dǎo)致細胞氧化損傷、脂肪酸合成和能量代謝紊亂,最終導(dǎo)致NASH[17]。另外,丙酮酸是機體三大能量代謝的中間產(chǎn)物。研究證實,丙酮酸能夠豐富三羧酸循環(huán)池,從而增加能量消耗,此過程會導(dǎo)致細胞內(nèi)AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)含量增加,并使乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)磷酸化水平上升而降低其活性,進而減少脂肪酸合成并促進脂肪酸氧化代謝[18]。本實驗通過多元統(tǒng)計分析顯示模型組大鼠丙酮酸含量降低,逍遙丸干預(yù)后明顯回升,由此推測,逍遙丸治療NASH可能通過調(diào)控脂肪酸代謝通路而發(fā)揮作用。本實驗運用Western blot檢測,發(fā)現(xiàn)逍遙丸可以使模型組大鼠肝組織中脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶PPARα、PGC1α的蛋白表達升高,證實了逍遙丸確實具有調(diào)控脂肪酸代謝的作用。

綜上所述,逍遙丸可通過上調(diào)PPARα、PGC1α在NASH大鼠肝組織中的表達來誘導(dǎo)脂肪酸β氧化,并能夠改善糞便代謝物譜、減輕脂肪在肝細胞內(nèi)堆積以緩解NASH。本實驗為從代謝通路研究NASH的發(fā)病和治療機制提供了思路和前期基礎(chǔ),尚需更多的體內(nèi)外實驗進一步驗證。