童文烽，李勁松，徐 巧，李 劍

（杭州譜育科技發(fā)展有限公司，浙江杭州 311305）

亞硝胺是一類具有高度致癌性和致突變性的揮發(fā)性污染物，基本結(jié)構(gòu)單元為N-N=O[1]。常見的亞硝胺有N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基甲基乙胺（NMEA）、N-亞硝基二丁胺（NDBA）、N-亞硝基正丙胺（NDPA）、N-亞硝基嗎啉（NMOR）、N-亞硝基哌啶（NPIP）、N-亞硝基二苯胺（NDPhA）和 N-亞硝基吡咯烷（NPYR）等。在目前已發(fā)現(xiàn)的300 多種亞硝胺化合物中，超過90%的亞硝胺均有動(dòng)物致癌作用[2]，其中NDMA 和NDME已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）定為2A 類致癌物[3]。大量動(dòng)物試驗(yàn)表明，亞硝胺的暴露與食管癌、肝癌、胃癌以及心血管疾病的發(fā)生率呈正相關(guān)[4-8]。人體可通過內(nèi)源性合成和外源直接攝入亞硝胺[9]，內(nèi)源性合成可通過攝入含有亞硝酸鹽的植源性和動(dòng)物源性食品，亞硝酸鹽在胃部酸性的環(huán)境下與蛋白質(zhì)反應(yīng)生成亞硝胺。

研究表明，食品中的蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶和微生物作用下易生成胺類物質(zhì)，可與食品中的亞硝酸鹽反應(yīng)生成亞硝胺類化合物[10]。亞硝酸鹽通常作為防腐劑存在于肉制品和乳制品中[11]，并會(huì)進(jìn)一步形成致癌的亞硝胺，對(duì)人體健康有害。目前針對(duì)亞硝胺的檢測(cè)主要針對(duì)腌熏制品以及肉制品等，然而國內(nèi)外針對(duì)牛奶中亞硝胺殘留量的文獻(xiàn)較少。牛奶中含有大量的碳水化合物、乳脂以及蛋白質(zhì)，前處理凈化對(duì)于準(zhǔn)確測(cè)定牛奶中亞硝胺十分重要。研究表明，乳化/破乳法對(duì)于樣品中疏水性強(qiáng)的提取物質(zhì)（例如甘油三酯、萜類化合物、游離脂肪酸、甾醇等）有良好的凈化效果，通過在有機(jī)提取液中加水乳化，使弱極性雜質(zhì)形成許多微米級(jí)的液滴，再利用親水濾膜對(duì)乳液進(jìn)行破乳來達(dá)到凈化的目的[12]。該法在油脂農(nóng)殘檢測(cè)[12]、重金屬回收[13]、藥物分離[14]、染料去除[15-16]等領(lǐng)域都有較好的應(yīng)用效果。亞硝胺的檢測(cè)手段主要有氣相色譜法[17-19]、液相色譜法[20-21]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法[22-26]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法[27-28]。氣相或液相的方法相比于質(zhì)譜法而言靈敏度偏低，對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)中的準(zhǔn)確定量存在困難，且氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)于揮發(fā)性亞硝胺化合物有良好的靈敏度。鑒于此，本研究將乳化/破乳法應(yīng)用于牛奶基質(zhì)的前處理中，建立一種高效便捷、高靈敏度的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量方法，用于準(zhǔn)確測(cè)定牛奶中12 種亞硝胺的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

調(diào)制乳、巴氏殺菌乳、超高溫殺菌乳 市售；12 種亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度均為200 μg/mL上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；N-亞硝基二甲基胺-d6（1000 μg/mL）、N-亞硝基二丙胺-d14（100 μg/mL）、N-亞硝基二丁基胺-d18（100 μg/mL）上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；丙酮、乙腈 均為色譜純，德國Merck 公司；氯化鈉、無水硫酸鎂、檸檬酸鈉、檸檬酸二鈉 均為分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；聚四氟乙烯（PTFE）針式濾器、聚醚砜（PES）針式濾器、尼龍（PA）針式濾器，規(guī)格均為25 mm×0.22 μm 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

GC 2000 氣相色譜儀、EXPEC 5231 三重四極桿質(zhì)譜儀、MassExpert 軟件 杭州譜育科技發(fā)展有限公司；TGL-16M 冷凍離心機(jī) 湖南湘儀集團(tuán)；BSA 224S-CW 萬分之一天平 德國Sartorius 公司；230VEU PLUG 渦旋混勻器 美國Labnet 公司；Cascada I 超純水儀 美國PALL 公司；KQ-800DE 數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 分別吸取1.1 中N-亞硝基二甲基胺-d6 溶液10 μL，N-亞硝基二丙胺-d14 和N-亞硝基二丁基胺-d18 溶液各100 μL，乙腈定容至10 mL，得到濃度為1 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)混合溶液。樣品提取參考李登昆等[25]的研究，并進(jìn)行調(diào)整，具體如下：稱取5 g 牛奶樣品于50 mL 離心管中，加入內(nèi)標(biāo)混合溶液（50 μL），加5 mL 乙腈，振搖1 min 后超聲10 min，8000 r/min 離心5 min，取上清，重復(fù)提取一次后，合并上清液，加入3 g 無水硫酸鎂，1 g 氯化鈉，0.5 g 檸檬酸鈉，0.25 g 檸檬酸二鈉，渦旋15 min后，8000 r/min 離心5 min。

采用乳化/破乳操作對(duì)提取液進(jìn)行凈化，參考Wang 等[12]的研究并進(jìn)行調(diào)整，具體如下：取出上述離心后的5 mL 清液，加入5 mL 水乳化，手動(dòng)混勻后過PA 針式濾器進(jìn)行破乳后，在濾液中加入4 g 無水硫酸鎂，1 g 氯化鈉，8000 r/min 離心5 min，取1 mL上清于進(jìn)樣瓶中，上機(jī)進(jìn)樣。

1.2.2 氣相色譜條件 色譜柱：HP-INNOWAX 色譜柱（30 m?0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣（純度≥99.999%），恒流模式，柱流量1.2 mL/min；隔墊吹掃流量：3.3 mL/min；載氣吹掃流量：25 mL/min，于進(jìn)樣0.75 min 后打開；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣體積1 μL，不分流進(jìn)樣。柱升溫程序：初始溫度為50 ℃；以20 ℃/min 速率升溫至190 ℃，保持1 min，最后以40 ℃/min 速率升溫至250 ℃，保持5.5 min。

1.2.3 質(zhì)譜條件 離子源采用電子轟擊源（EI），離子源溫度250 ℃，氣質(zhì)接口溫度250 ℃，碰撞氣為高純氮?dú)猓兌取?9.999%），溶劑延遲設(shè)置3 min，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）參數(shù)的采集與優(yōu)化，各化合物的質(zhì)譜參數(shù)如表1 所示。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制 使用乙腈將亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，并加入等量?jī)?nèi)標(biāo)混合溶液，內(nèi)標(biāo)濃度為5 ng/mL，12 種亞硝胺的質(zhì)量濃度范圍均為1～100 ng/mL，混勻后裝瓶進(jìn)樣，由氣相色譜分離，質(zhì)譜檢測(cè)，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 方法應(yīng)用 完成方法學(xué)驗(yàn)證后，應(yīng)用該方法對(duì)購自當(dāng)?shù)爻械? 類牛乳樣品進(jìn)行測(cè)試，每份樣品重復(fù)3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 組平行，前處理優(yōu)化結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD），回收率結(jié)果表示為平均值，并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。數(shù)據(jù)通過Excel 進(jìn)行計(jì)算并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器與前處理?xiàng)l件

2.1.1 儀器條件的優(yōu)化 參考前人研究，本實(shí)驗(yàn)選擇HP-INNOWAX 毛細(xì)管色譜柱作為分析柱，并對(duì)升溫程序進(jìn)一步優(yōu)化，在保證較好分離度的前提下，使色譜分離時(shí)間控制在15 min 內(nèi)，相比于國標(biāo)《GB 5009.26-2016 食品中N-亞硝胺類化合物的測(cè)定》，分析時(shí)間縮短一半。同時(shí)對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，將MRM 模式下的碰撞能量做了調(diào)整，確定了質(zhì)譜條件。優(yōu)化后的亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)品的提取離子流圖（EIC）如圖1 所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的EIC 圖Fig.1 Extracted ion chromatogram of the standard

2.1.2 濾膜的選擇 分別采用PTFE，PES 以及PA濾膜對(duì)牛奶加標(biāo)樣品進(jìn)行前處理，以化合物回收率進(jìn)行評(píng)價(jià)其前處理效果。結(jié)果如圖2 所示，相較其它2 種濾膜，PA 膜對(duì)于12 種化合物均有較好的回收率，均在80%～120%之間。而使用PTFE 膜進(jìn)行破乳，NPYR 回收率偏高，大于120%；PES 則有6 個(gè)化合物回收率偏高，不符合國標(biāo)《GB/T 27404-2008 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中的要求（當(dāng)被測(cè)組分含量＜0.1 mg/kg 時(shí)，回收率應(yīng)控制在60%～120%之間），因此本研究選取PA 膜進(jìn)行前處理破乳。

圖2 不同濾膜對(duì)方法準(zhǔn)確性的影響Fig.2 Effect of different filters on method accuracy

2.1.3 提取劑的選擇 亞硝胺屬強(qiáng)極性化合物，且牛奶中含有較多的蛋白質(zhì)、乳脂肪以及碳水化合物等，選擇合適的提取劑能有效提升亞硝胺化合物的提取效率，而且鹽析效應(yīng)有助于萃取效率的提升[29]。本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈，丙酮以及乙腈/丙酮（80/20）提取劑對(duì)加標(biāo)樣品中亞硝胺的提取效果。從圖3 可以看出，使用丙酮進(jìn)行提取，有8 種亞硝胺化合物有較好的提取效果，但NMPhA 和NEPhA 提取效率不佳，回收率均低于50%，NYPR 和NDPhA 回收率高于150%；使用乙腈/丙酮（80/20）進(jìn)行提取，NEPhA 提取效率仍舊不佳，且NPYR 回收率偏高。而使用乙腈進(jìn)行提取，12 種亞硝胺回收率均能保持在80%～120%之間，效果良好。因此本研究選擇乙腈作為最佳提取劑。

圖3 提取劑對(duì)方法準(zhǔn)確性的影響Fig.3 Effect of extractants on method accuracy

2.1.4 提取次數(shù)的優(yōu)化 考察了不同提取次數(shù)對(duì)于提取效率的影響，分別對(duì)牛奶加標(biāo)樣品使用最佳提取劑提取1、2、3 次，以回收率比較不同提取次數(shù)下的提取效果，結(jié)果如圖4 所示。可以看出，提取1 次的情況下，NDPA、NMPhA，NEPhA 和NPIP 提取效率不佳，回收率較差（低于70%）；而提取2 次和3 次，各化合物均有較好的提取效果，回收率較好，并無明顯差異，故本研究選擇提取次數(shù)為2 次作為最佳的提取次數(shù)。

圖4 提取次數(shù)對(duì)方法準(zhǔn)確性的影響Fig.4 Effect of extraction times on method accuracy

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 基質(zhì)效應(yīng) 為了驗(yàn)證牛奶基質(zhì)對(duì)目標(biāo)分析物的信號(hào)是否存在抑制或者增強(qiáng)作用，本研究通過比較溶劑標(biāo)準(zhǔn)品響應(yīng)值和同濃度基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品響應(yīng)值的比值來評(píng)估亞硝胺類化合物在牛奶中的基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effects，ME），根據(jù)公式：ME（%）=（AM/AS-1）×100 計(jì)算[30]，其中，AM 是樣品溶液中亞硝胺的響應(yīng)值，AS 是標(biāo)準(zhǔn)溶液中亞硝胺的響應(yīng)值。ME（%）的絕對(duì)值在0～20%之間，表明基質(zhì)效應(yīng)較弱，可以忽略；ME（%）大于20%，表明基質(zhì)效應(yīng)明顯，影響樣品分析準(zhǔn)確性。結(jié)果如表2 顯示，牛奶基質(zhì)中12 種亞硝胺類化合物的ME（%）的絕對(duì)值均大于20%，表明目標(biāo)化合物在牛奶中展現(xiàn)出較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，使用內(nèi)標(biāo)法校準(zhǔn)后，各化合物的基質(zhì)效應(yīng)均得到有效消除。因此，本研究采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正，減少了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)亞硝胺類化合物的準(zhǔn)確定量影響。

表2 亞硝胺在牛奶基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)（n=3）Table 2 Evaluation of matrix effect of nitrosamines in milk(n=3)

2.2.2 線性與定量限 各化合物的線性以及靈敏度如表3 所示，其中NPYR 的線性范圍為2～100 ng/mL，其余亞硝胺的線性范圍均為1～100 ng/mL；12 種亞硝胺的決定系數(shù)R2均大于0.995，說明其在試驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍內(nèi)線性良好。通過對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品的逐步稀釋進(jìn)樣，以信噪比S/N=10 為定量限（LOQ），其中NPYR 的定量限為4 μg/kg，其余化合物的定量限均為2 μg/kg，表明該方法的靈敏度較好，與同為氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定亞硝胺的國標(biāo)GB/T 29669-2013 相比，靈敏度更優(yōu)。

表3 方法線性及靈敏度評(píng)價(jià)Table 3 Evaluation of method linearity and sensitivity

2.2.3 方法精密度與回收率 取牛奶樣品，平行6 份，將已知量的亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入牛奶樣品中，加標(biāo)量為高、中、低3 個(gè)水平，經(jīng)過同樣的前處理步驟完成3 d、3 個(gè)濃度水平、6 個(gè)樣品平行加標(biāo)試驗(yàn)。計(jì)算測(cè)定值的RSD，得到日內(nèi)精密度和日間精密度，并計(jì)算回收率，來評(píng)估方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，各亞硝胺化合物的日內(nèi)精密度范圍在1.76%～7.62%之間，日間精密度范圍在2.75%～7.71%之間（表4），且回收率為90.90%～114.30%，RSD 為2.54%～9.93%（表5），說明該方法具有良好的準(zhǔn)確度與精密度，滿足12 種亞硝胺的準(zhǔn)確定量需求。

表4 日內(nèi)及日間精密度結(jié)果Table 4 Results of intra-day and inter-day precision

表5 三水平加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of three-level spiked recovery test

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

選擇3 類具有代表性的市售牛奶，分別為巴氏殺菌乳、調(diào)制乳以及超高溫殺菌乳，每類各選擇兩個(gè)不同品牌進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果顯示，3 類牛奶共6 份牛奶樣品中均有NDPhA 檢出，含量范圍在4.29～6.67 μg/kg，其余亞硝胺未檢出。樣品圖譜如圖5所示。

圖5 牛奶樣品色譜圖Fig.5 Chromatograms of milk samples

3 結(jié)論

本研究基于乳化-破乳法，利用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜平臺(tái)建立了牛奶中12 種亞硝胺的定量檢測(cè)方法。該方法前處理步驟簡(jiǎn)單，能夠在15 min 內(nèi)完成12 種目標(biāo)亞硝胺的分離與定量，各化合物的線性與穩(wěn)定性良好，決定系數(shù)R2均大于0.995，日內(nèi)精密度在1.76%～7.62%之間，日間精密度在2.75%～7.71%之間，且回收率為90.90%～114.30%，NPYR 的定量限為4.00 μg/kg，其余化合物的定量限均為2.00 μg/kg。方法的精密度與準(zhǔn)確度良好，大大縮短了分析時(shí)間，可滿足牛奶中12 種亞硝胺的準(zhǔn)確定量。