聶雪梅,謝 昀,許博舟,許秀麗,
(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所,北京 100176;2.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(食品質(zhì)量與安全),北京 100176)
乳業(yè)是健康中國(guó)、強(qiáng)壯民族不可或缺的產(chǎn)業(yè)[1],隨著消費(fèi)者收入水平的提高,人們對(duì)牛奶品質(zhì)的要求越來(lái)越高,純天然、無(wú)污染、安全健康的有機(jī)奶得到了消費(fèi)者的青睞,因此有較高的安全性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,但受利益驅(qū)動(dòng),一些不法商家隨意標(biāo)注“有機(jī)”字樣來(lái)對(duì)食品采取假冒、偽造、以次充好等方式欺詐消費(fèi)者,因此對(duì)有機(jī)奶和非有機(jī)奶中差異性成分的研究非常重要。有機(jī)乳制品甄別目前主要集中在產(chǎn)地的認(rèn)證和安全指標(biāo)的檢測(cè),但僅依靠產(chǎn)地有機(jī)認(rèn)證的信息不能完全保證有機(jī)奶的真實(shí)性,目前尚無(wú)有效的檢測(cè)方法對(duì)有機(jī)奶和非有機(jī)奶進(jìn)行精準(zhǔn)鑒別。
在有機(jī)產(chǎn)品真實(shí)性鑒別方面,穩(wěn)定同位素質(zhì)譜技術(shù)可用于鑒別不同種類和來(lái)源的食品,是國(guó)際上目前用于鑒別食品成分和摻假的一種有效工具,并在有機(jī)乳[2-3]、葡萄酒[4]、蜂蜜[5-6]、果汁[7-8]等食品的鑒別方面有所應(yīng)用。葡萄酒、蜂蜜和果汁中摻假的問(wèn)題,由于添加物與天然糖中13C/12C、15N/14N 比值的不同,因此通過(guò)穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜技術(shù)可以比較明顯地區(qū)分出來(lái)。但有機(jī)乳與普通乳的區(qū)別在于有機(jī)牧場(chǎng)和普通牧場(chǎng)飼養(yǎng)方式不同,影響13C/12C、15N/14N 比值的因素較多。除不同牧場(chǎng)飼料差別外[3],同一牧場(chǎng)奶牛冬天食用玉米,夏天食用草或豆科植物,穩(wěn)定同位素C 和N 比值也會(huì)隨著飲食的季節(jié)不同而有變化[9]。此外,采樣時(shí)間和地理位置也會(huì)影響穩(wěn)定同位素C和N 的比值[10],因此僅通過(guò)一種檢測(cè)手段很難滿足精準(zhǔn)分析。
代謝組學(xué)近年來(lái)在動(dòng)植物疾病診斷、生物標(biāo)志物篩選、物質(zhì)毒性毒理研究、中醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[11],對(duì)食品中代謝小分子也可以進(jìn)行定性和定量的分析,從而動(dòng)態(tài)呈現(xiàn)出機(jī)體內(nèi)代謝物的變化,代謝組學(xué)常用的研究方法主要包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-14]、質(zhì)子核磁共振法[15-16]和超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法[17-19]等。已有相關(guān)報(bào)道代謝組學(xué)用于不同泌乳期乳制品的代謝物差異物分析[20-21],其中超高效液相串聯(lián)-四極桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜更具有高靈敏度、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),目前被廣泛應(yīng)用于代謝物測(cè)定、中藥組分分析鑒定研究,康佳欣等[22]采用超高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜非靶向代謝組學(xué)方法對(duì)薩能奶中山羊初乳和常乳進(jìn)行了代謝組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)有118 種代謝物與常乳存在差異,主要是脂質(zhì)類、氨基酸類、核苷類等。也有文獻(xiàn)表明通過(guò)穩(wěn)定同位素氮和高分辨質(zhì)譜結(jié)合的方式可對(duì)有機(jī)番茄進(jìn)行鑒別[23],因此本論文也將首次嘗試將穩(wěn)定同位素比值、超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法(UPLC-Q-Orbitrap)及化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合的分析技術(shù)對(duì)有機(jī)奶進(jìn)行研究,旨在揭示有機(jī)奶和普通奶之間的差異性,為有機(jī)牛奶的真實(shí)性篩選提供一定的科學(xué)依據(jù)。
泌乳早期有機(jī)牛奶(30~90 d)、泌乳晚期有機(jī)牛奶(210~270 d)、普通牛奶 內(nèi)蒙古的有機(jī)奶飼養(yǎng)基地和普通奶飼養(yǎng)基地,每批次牛奶從擠奶場(chǎng)隨機(jī)取樣,經(jīng)分析剔除掉不符合牛奶(經(jīng)代謝組學(xué)分析個(gè)體差異較大為不符合牛奶),共有63 個(gè)樣品,其中有機(jī)奶包括17 個(gè)泌乳早期奶,22 個(gè)泌乳晚期奶,普通奶包括24 個(gè),所取的牛奶混合均勻,具有代表性;乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、錫杯(9 mm×5 mm)、CN 反應(yīng)管 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司;甲酸 質(zhì)譜級(jí),J&K 科學(xué)有限公司;實(shí)驗(yàn)室用水 實(shí)驗(yàn)室自制;IAEA600 咖啡因(δ13C=-27.271‰,δ15N=1‰)國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)。
Delta V 同位素比質(zhì)譜儀、Flash EA2000 元素分析儀 美國(guó)Thermo-Fisher 公司;Q-exactive 高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific;Milli-R04 純水儀 德國(guó)Millipore 公司;ML104/02 分析天平 梅特勒-托利多上海有限公司;HSC-12B 針式氮吹儀 天津恒奧科技有限公司;旋渦混合儀 德國(guó)IKA 公司。
1.2.1 同位素質(zhì)譜測(cè)定方法
1.2.1.1 同位素質(zhì)譜樣品的制備 將鮮牛奶混勻后,冷凍干燥成粉末,過(guò)20 目篩放于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2.1.2 樣品中碳氮同位素比值分析 凍干成粉末的樣品,分別稱量約150~180 μg,并用錫杯密封包裹成球,每份樣品重復(fù)3 次,測(cè)定穩(wěn)定碳同位素比值。凍干成粉末的樣品,分別稱量約3000~3200 μg,并用錫杯密封包裹成球,每份樣品重復(fù)3 次,測(cè)定穩(wěn)定氮同位素比值。
1.2.1.3 同位素比質(zhì)譜儀參數(shù) 離子化方式:EI 離子源,離子源電壓:3.06 kV,真空度:1.5×10-6mbar。氦氣壓力:4 bar,氧氣壓力:4 bar,二氧化碳?jí)毫Γ? bar,氮?dú)鈮毫Γ? bar,空氣壓力:8 bar。
1.2.1.4 元素分析儀參數(shù) 元素分析儀氧化爐最高溫度為980 ℃,載氣氦流量為100 mL/min,氧氣流速為175 mL/min;氦氣吹掃氣為180 mL/min,柱溫為50 ℃。
1.2.1.5 碳氮同位素比值測(cè)定 元素分析-同位素比質(zhì)譜(EA-IRMS)分析結(jié)果以δ表示,它反應(yīng)了樣品和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)之間同位素豐度比的相對(duì)差異:
其中,R 代表13C/12C 或15N/14N 的同位素含量比,SPL 與STD 分別代表樣品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì);δ值用千分?jǐn)?shù)表示(‰)。
表1 有機(jī)奶和普通奶樣品δ13C 和δ15N 值對(duì)比Table 1 δ13C and δ15N in organic milk and ordinary milk
1.2.2 高分辨質(zhì)譜測(cè)定方法
1.2.2.1 高分辨質(zhì)譜樣品前處理 前處理方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[24-25],將鮮牛奶稱量約2 g,加入 10 mL乙腈,超聲提取30 min 后,加入3 g NaCl,在4 ℃下10000 r/min 離心10 min,取5 mL 上層提取液,在40 ℃下氮?dú)庀麓抵两?。殘?jiān)右译? mL 進(jìn)行復(fù)溶,過(guò)0.22 μm 濾膜,放置于2 mL 液相進(jìn)樣瓶中,待測(cè)。
1.2.2.2 高分辨質(zhì)譜儀器參數(shù) 液相色譜條件[26]:色譜柱Accucore aQ(2.1 mm×150 mm,2.6 μm);流動(dòng)相為A 為有機(jī)相乙腈,流動(dòng)相B 為水溶液(0.1%甲酸,v/v);流速0.3 mL/min;進(jìn)樣體積為5 μL,柱溫40 ℃;流動(dòng)相梯度洗脫程序:0~0.5 min,5% A;0.5~5 min,5%~30% A;5~10 min,30%~100% A;10~12 min,100% A;12~15 min,5% A。
質(zhì)譜條件:離子源為加熱電噴霧離子源;噴霧電壓為3.5 kV;離子傳輸管溫度為320 ℃;全掃描-數(shù)據(jù)依賴二級(jí)掃描模式,一級(jí)分辨率70000,二級(jí)分辨率17500,實(shí)驗(yàn)中所用的氣體均為高純氮?dú)?,質(zhì)量掃描范圍(m/z)為100~1500,監(jiān)測(cè)模式:正離子監(jiān)測(cè)模式。
通過(guò)Xcalibur 軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)采集,將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound DiscoverTM3.0 軟件,對(duì)總離子流圖中的色譜峰提取、峰對(duì)齊、匹配分析等,質(zhì)荷比范圍為m/z 100~1500;峰相應(yīng)強(qiáng)度最小值1×10-6。同時(shí)將數(shù)據(jù)矩陣提取出來(lái)的數(shù)據(jù)信息利用SIMCA-13.0 軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化歸一化處理,并進(jìn)行正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA),根據(jù)VIP(VIP>1)和組間變化的顯著性(P<0.01)進(jìn)行有機(jī)奶和普通奶的差異性代謝物的篩選。
利用元素分析儀共測(cè)定39 個(gè)有機(jī)奶和24 個(gè)普通奶,表1 為有機(jī)奶和普通奶的δ13C 和δ15N 值對(duì)比。
2.1.1 有機(jī)與普通牛奶穩(wěn)定碳同位素比值的分析通過(guò)碳同位素元素分析儀測(cè)定63 個(gè)有機(jī)奶和普通奶,對(duì)比分析了有機(jī)奶和普通奶的δ13C 值,39 個(gè)有機(jī)奶樣品的中位值δ13C 為-27.46‰;24 個(gè)普通奶的δ13C 中位值為-27.36‰,有機(jī)奶和普通奶δ13C 值有部分交叉,但有機(jī)奶和普通奶的單因素方差分析P<0.01,從結(jié)果的平均值分析,有機(jī)奶的δ13C 值的整體情況比普通奶的δ13C 值更偏負(fù),這與趙超敏等[2]有機(jī)奶粉所研究的結(jié)果一致,δ13C 值反映了奶牛飼料中C3 植物與C4 植物的比值,理論上有機(jī)牛奶的奶牛是食用天然牧草長(zhǎng)大的,這些牧草主要都是C3 植物[27-28],C3 植物的δ13C 值變化范圍為-23‰至-35‰之間,普通牛奶的奶牛主要食用的玉米屬于C4植物,C4 植物的δ13C 值變化范圍在-9‰至-19‰之間,因此從理論上分析,有機(jī)奶的δ13C 應(yīng)該比普通奶更偏負(fù)。但由于有機(jī)奶的奶牛所食用的并非只有有機(jī)牧場(chǎng)的牧草,還包括其他進(jìn)口燕麥等一定比例的飼料,且存在其他含有C 元素的物質(zhì)對(duì)結(jié)果有影響,所以導(dǎo)致有機(jī)奶和普通奶的δ13C 數(shù)值有交叉,但是從單因素方差分析P<0.01,說(shuō)明存在顯著差異,因此碳穩(wěn)定同位素比值可以作為區(qū)分有機(jī)奶和普通奶的一種技術(shù)手段。
2.1.2 有機(jī)奶與普通牛奶穩(wěn)定氮同位素比值的差異分析 通過(guò)氮同位素元素分析儀測(cè)得63 個(gè)樣品數(shù)據(jù),共計(jì)39 個(gè)有機(jī)奶和24 個(gè)普通奶,對(duì)比分析了有機(jī)奶和普通奶的δ15N 值,有機(jī)奶的δ15N 的中位值為3.40‰,普通奶的δ15N 的中位值為2.81‰。有機(jī)奶和普通奶的δ15N 具有顯著的差異(P<0.01),從δ15N 平均比值來(lái)分析,有機(jī)奶中δ15N 比值明顯高于普通牛奶,王世成等[23]所研究的有機(jī)番茄中氮同位素比值明顯高于普通番茄,兩者結(jié)論較為一致,δ15N值反映了奶牛飼料中15N 與14N 的比值,理論上來(lái)說(shuō)有機(jī)牧草不允許使用人造肥料,有機(jī)牧場(chǎng)的奶牛所食用的飼料主要為有機(jī)牧草,有機(jī)牧草中高含量的15N 使有機(jī)奶中15N 比例增高[23],而普通牧草的種植允許使用化肥,因此牛奶中氮同位素比取決于土壤中的氮源,有機(jī)奶中δ15N 比值明顯高于普通牛奶,氮同位素比值也可以作為區(qū)分有機(jī)奶和普通奶的一種技術(shù)手段。
2.2.1 UPLC-Q-Orbitrap 譜圖分析 采用正離子模式對(duì)有機(jī)奶和普通奶進(jìn)行分析,圖1 為有機(jī)奶和普通奶的總離子流圖,由圖1 可知,譜圖基線較為平穩(wěn),說(shuō)明儀器有較好的穩(wěn)定性,圖像可信度較高,有機(jī)奶和普通奶的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Compound Discover 軟件降噪后進(jìn)一步分析研究,提取了所有化合物的質(zhì)譜信息,共提取1682 個(gè)化合物,下述分析以1682 個(gè)正離子檢測(cè)進(jìn)行研究。
圖1 普通奶(A)和有機(jī)奶(B)單個(gè)樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram for a random single ordinary milk (A) and organic milk (B)
2.2.2 液相色譜-高分辨質(zhì)譜的主成分分析 將有機(jī)奶和普通奶的1682 種化合物信息導(dǎo)入SIMCA-P 軟件,進(jìn)行PCA 主成分分析,用以判別有機(jī)奶和普通奶之間的差異,但PCA 不能很好地將兩種牛奶分開,由于PCA 無(wú)監(jiān)督分析方法存在組內(nèi)的誤差和無(wú)關(guān)的隨機(jī)誤差,所以本研究采用了有監(jiān)督的判別方法OPLS-DA(正交偏最小二乘-判別分析)進(jìn)行代謝差異物的篩選,OPLS-DA 不同于PCA,運(yùn)用正交偏最小二乘回歸建立代謝物表達(dá)量與樣本類別之間的關(guān)系模型,來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本類別的預(yù)測(cè),能夠更科學(xué)|更客觀的區(qū)分代謝物的組間差異。如圖2 所示,有機(jī)奶樣品主要分布在該置信區(qū)間的左側(cè),普通奶樣品主要分布在置信區(qū)間的右側(cè),有機(jī)奶和普通奶樣品區(qū)分效果佳。本次OPLS-DA 模型分析得到2 個(gè)主成分,該模型的參數(shù)R2和Q2分別為0.997 和0.709,均大于0.5,說(shuō)明該模型穩(wěn)定性可靠。從圖2 可以看出不同的樣品分布在不同的象限,普通奶差異較小,聚集在一起,而有機(jī)奶差異較大,較為分散,這是有機(jī)奶中包括不同泌乳期的有機(jī)牛奶的緣故,該結(jié)果表明有機(jī)奶和普通奶的代謝成分在種類、數(shù)量和含量上存在顯著的差異。
圖2 有機(jī)奶和普通奶樣品的OPLS-DA 得分圖Fig.2 Score plot of OPLS-DA between organic milk and ordinary milk
由于有機(jī)奶依據(jù)泌乳期分為泌乳早期奶和泌乳晚期奶兩種,因此同時(shí)對(duì)不同泌乳期和普通奶進(jìn)行差異分析,如圖3 所示,有機(jī)泌乳早期奶和有機(jī)泌乳晚期奶與普通奶分布在不同的置信區(qū)間,區(qū)分效果佳。但是有機(jī)泌乳早期奶活性成分差異較大,樣品點(diǎn)較分散。本次OPLS-DA 模型分析得到2 個(gè)主成分,R2和Q2分別為 0.928 和0.773,均大于0.5,說(shuō)明該模型穩(wěn)定性可靠。這結(jié)果也表明不同泌乳期的有機(jī)奶其含量、種類和數(shù)量相差較大,但能夠與普通奶有所區(qū)分。
2.2.3 有機(jī)牛奶和普通牛奶差異性組分的分析 通過(guò)Compound Discover 軟件分析共有1682 個(gè)化合物,對(duì)有機(jī)奶和普通奶間數(shù)據(jù)峰面積均值進(jìn)行比對(duì)形成S-PLOT 圖(圖4)。在S-PLOT 圖的右側(cè)象限為普通奶的代謝物,左側(cè)象限為有機(jī)奶的代謝物,距離中心原點(diǎn)越遠(yuǎn)的代謝物表示在兩者之間的差異越大,從圖上可以看到,有機(jī)奶中的差異性化合物種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于普通奶,通過(guò)Compound Discover 軟件匹配mzcloud、chemspider 等數(shù)據(jù)庫(kù),識(shí)別了294 個(gè)化合物的信息,如保留時(shí)間、分子量、一級(jí)質(zhì)譜碎片和二級(jí)質(zhì)譜碎片等,并查閱了相關(guān)文獻(xiàn),進(jìn)一步確認(rèn)相關(guān)化合物的信息,從結(jié)果分析,牛奶成分中除了乳糖、葡萄糖等糖類,肌酸、氨基酸等有機(jī)酸類,還包括飼料里產(chǎn)生的葛根素,以及次生代謝物膽堿等,另外還有環(huán)境暴露的一些化合物例如塑化劑等。
圖4 有機(jī)奶和普通奶的S-plot 圖Fig.4 S-plot of organic milk and ordinary milk
其中含量較高的包括α-乳糖,普通奶中的乳糖含量是有機(jī)乳中的1~2 倍,這與Wu 等[29]的研究是一致的。膽堿在有機(jī)泌乳早期奶含量較高,是普通奶中的2 倍左右,肌酸在普通奶中含量是有機(jī)奶中的1~2 倍,異亮氨酸在有機(jī)奶中的含量是普通奶中的2~3 倍。
經(jīng)過(guò)Simca-p 篩查共發(fā)現(xiàn)651 種VIP 值大于1 的物質(zhì),同時(shí)依據(jù)t檢驗(yàn)(t-test)的P值(P<0.05)篩查差異性代謝物,經(jīng)與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配確證發(fā)現(xiàn),以下5 種化合物成分在有機(jī)和普通牛奶中在含量、數(shù)量上存在較大差異(見表2),有機(jī)泌乳早期奶中組氨酸含量高于普通奶的138 倍,有機(jī)泌乳晚期奶組氨酸含量高于普通奶的22 倍,其他4 種物質(zhì)包括2,6-二氨基甲苯、3,5-二甲基吡唑-1-甲酰胺、6-正己基氨基嘌呤、二乙煙酰胺含量也均高于普通奶。
表2 有機(jī)奶和普通奶樣品部分差異物Table 2 Partial different metabolites of organic milk and ordinary milk
2.2.4 有機(jī)牛奶和普通牛奶代謝物成分層次聚類分析 熱圖是對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分布情況進(jìn)行分析的直觀可視化方法,可通過(guò)顏色深淺和差異來(lái)直觀展示研究對(duì)象的差異,并對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析(見圖5A 和圖5B),在圖5A 中右側(cè)為有機(jī)奶,左側(cè)為普通奶,從圖5A可以看出右側(cè)有機(jī)奶中代謝物較多,且有機(jī)奶和普通奶組數(shù)據(jù)分別能夠較好的聚集在一起,說(shuō)明代謝物聚集效果良好。由圖5B 可以看出6-正己基氨基嘌呤、2,6-二氨基甲苯、組氨酸、3,5-二甲基吡唑-1-甲酰胺、二乙煙酰胺在有機(jī)泌乳早期奶中含量較高,在有機(jī)泌乳晚期奶中含量較低,而膽堿在有機(jī)泌乳早期奶含量較高,α-乳糖、肌酸等在普通奶中的含量較有機(jī)奶中要高一些,尤其是有機(jī)泌乳早期奶中含量很低,這與呂牧軍等[30]研究結(jié)論一致,常乳的乳糖含量比初乳高。總體來(lái)說(shuō),有機(jī)奶中代謝物數(shù)量大于普通奶中代謝物的數(shù)量,盡管部分化合物在有機(jī)泌乳早期和晚期也不盡相同,但通過(guò)上面5 種差異較大的代謝物可將有機(jī)奶和普通奶進(jìn)行區(qū)分。
本文采用穩(wěn)定同位素比例質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜兩種分析技術(shù)共同對(duì)有機(jī)奶和普通奶進(jìn)行差異性的分析研究。首先通過(guò)對(duì)有機(jī)奶和普通奶進(jìn)行C 和N 同位素平均比值分析,有機(jī)奶的δ13C 比普通奶更偏負(fù),有機(jī)奶中δ15N 比值明顯高于普通奶,從統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上分析,由于單因素方差分析P<0.01,因此具有顯著性差異,說(shuō)明碳氮穩(wěn)定同位素比值可以作為區(qū)分有機(jī)奶和普通奶的一種技術(shù)手段。其次結(jié)合UPLCQ-Orbitrap 進(jìn)行代謝組學(xué)分析,通過(guò)Simca-p 篩查共發(fā)現(xiàn)651 種VIP 值大于1 的物質(zhì),經(jīng)與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配確證發(fā)現(xiàn),包括5 種化合物成分在有機(jī)和普通牛奶中在含量、數(shù)量上存在較大差異,例如有機(jī)泌乳早期奶中組氨酸含量高于普通奶的138 倍,有機(jī)泌乳晚期奶組氨酸含量高于普通奶的22 倍,這些化合物可作為有機(jī)奶和普通奶的差異性特征成分。另外含量較高的α-乳糖在普通奶中的含量是有機(jī)奶中1~2 倍,普通奶中肌酸含量是有機(jī)奶中的1~2 倍;膽堿在有機(jī)泌乳早期奶含量較高,是普通奶中的2 倍左右,異亮氨酸在有機(jī)奶中的含量是普通奶中的2~3 倍。因此該研究初步判定通過(guò)C 和N 同位素比值、這些差異性成分基本可區(qū)分內(nèi)蒙乳企的有機(jī)奶和普通奶,該結(jié)論對(duì)有機(jī)奶和普通奶的差異化成分研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。