田 歡，裴龍英，布海麗且姆·阿卜杜熱合曼，房丹丹，姜露熙，李 倩，張 坤，彭 靜，申 雪,

（1.新疆理工學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，新疆阿克蘇 843000；2.新疆黑木耳工程技術(shù)研究中心，新疆阿克蘇 843000）

桑葚（Fructus mori），又名桑葚子、桑果等，為?？浦参锷涞墓麑峓1]。桑葚中含有豐富的活性蛋白、維生素、氨基酸、胡蘿卜素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分[2-3]，營養(yǎng)價值非常高，享有“民間圣果”的美譽(yù)。桑葚還具有延緩衰老、保護(hù)血管、保護(hù)視力、提高免疫力、促進(jìn)消化和預(yù)防便秘的功效[4-6]。但桑葚采收期短，不易貯藏，每年有大量的桑葚腐爛在田地，因此將桑葚加工為果酒和飲料等產(chǎn)品可有效解決桑葚采收期的困難，同時能提高桑葚的商業(yè)價值，滿足人們對桑葚的需求。尹俊濤等[7]以蔓越莓與桑葚為原料研究蔓越莓桑葚復(fù)合飲料工藝；孫百虎[8]通過不同乳酸菌發(fā)酵桑葚汁，其活菌數(shù)均超過11 lg（CFU/mL），且乳酸菌發(fā)酵能有效提高總酚和總黃酮含量。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB），是能將碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的統(tǒng)稱[9]；乳酸菌能改善動物機(jī)體的腸道菌群結(jié)構(gòu)，維持腸道菌群平衡[10-11]；乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的各種消化酶可以將大分子物質(zhì)分解為小肽、葡萄糖等更易被消化吸收的小分子顆粒狀物質(zhì)，有助于機(jī)體的吸收，提高機(jī)體的免疫功能[12-14]；乳酸菌發(fā)酵可提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價值，改善產(chǎn)品風(fēng)味[15-17]。長雙歧桿菌具有調(diào)節(jié)人體腸道，改善健康的功效作用，可適用于乳酸菌食品的加工過程。植物乳桿菌廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜、牛羊乳和酒類等各類食品，用來制作各類乳酸菌加工制品。雖然關(guān)于乳酸菌發(fā)酵桑葚汁的相關(guān)研究較多，但對單菌株和混合菌株發(fā)酵桑葚汁工藝優(yōu)化及單菌株和混合菌株發(fā)酵之間的功能性成分和抗氧化活性的區(qū)別研究較少。因此本研究采用植物乳桿菌、長雙歧桿菌對桑葚汁進(jìn)行單菌株和混合菌株發(fā)酵實驗，利用單因素和響應(yīng)面試驗優(yōu)化桑葚汁發(fā)酵工藝，并測定單菌株和混合菌株發(fā)酵桑葚汁的pH、可溶性固形物、乳酸菌活菌數(shù)、總糖、總酸、功能性成分和抗氧化活性，對比分析不同乳酸菌發(fā)酵桑葚汁的區(qū)別，研究可為桑葚的深加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚 采摘自新疆阿克蘇；長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum18，BL）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum56，LP）西安米先爾生物科技有限公司；碳酸鈉、檸檬酸、果膠酶（酶活30000 U/g）均為食品級，購自江蘇佰葉生物科技有限公司；低聚果糖（食品級）、葡萄糖（食品級）、鹽酸、三氯乙酸、三氯化鐵、亞硝酸鈉、過硫酸鉀、水楊酸、鐵氰化鉀均為分析純，購自天津運(yùn)盛化學(xué)品有限公司；MRS 培養(yǎng)基 購自天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；DPPH、ABTS、蘆丁、沒食子酸 購自成都市科龍化工試劑廠；無水乙酸鈉、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、30%過氧化氫、硝酸鋁、硫酸銅 分析純，購自武漢荊隆化工有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 均為分析純，購自福晨化學(xué)試劑廠；酚酞、3,5 二硝基水楊酸（DNS）、碘、碘化鉀 購自天津市盛放化學(xué)試劑；福林酚 分析純，購自上海麥克林生化科技有限公司；總抗氧化試劑盒 購自北京索寶萊科技有限公司。

HWS-24 恒溫水浴鍋 上海精密儀器儀表有限公司；BM04 高精度數(shù)顯糖度計 惠州市優(yōu)普森儀器有限公司；pHS-3C 型pH 計 上海蟻霖科學(xué)儀器有限公司；FA1004 型電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司；L18-Y912C 九陽破壁機(jī) 九陽泰盛有限公司；330-5B 型恒溫培養(yǎng)箱 玖藍(lán)科學(xué)儀器；XFS-280CB 型高壓滅菌鍋 尚城儀器經(jīng)營部；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺 鴻運(yùn)實驗儀器；UV759 紫外可見分光光度儀 上海佑科儀器儀表有限公司；DNM-9602G 酶標(biāo)分析儀 北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑葚汁發(fā)酵工藝流程 桑葚挑選→榨汁過濾→果膠酶浸提→調(diào)配發(fā)酵液→高溫殺菌→接種乳酸菌發(fā)酵→發(fā)酵桑葚汁成品

1.2.2 桑葚汁發(fā)酵工藝操作要點 桑葚挑選：挑選無蟲害、無霉病的桑葚，用蒸餾水將桑葚表面的污垢進(jìn)行清洗，清洗完成后瀝干表面水分。

榨汁過濾：將瀝干水分的桑葚進(jìn)行榨汁，隨后用8 層無菌紗布進(jìn)行過濾，得到桑葚汁。

果膠酶浸提：稱取0.03%果膠酶（30000 U/g）加入過濾得到的桑葚汁中，隨后放入45 ℃恒溫水浴鍋中酶解2 h。

調(diào)配發(fā)酵液：向發(fā)酵液中添加低聚果糖，隨后使用碳酸鈉調(diào)節(jié)酶解后發(fā)酵液的初始pH，使用數(shù)顯糖度計測定發(fā)酵液的可溶性固形物為16.43°Brix。

高溫殺菌：將調(diào)配好的發(fā)酵液放入水浴鍋中進(jìn)行高溫殺菌（95 ℃滅菌30 min），滅菌完成后自然冷卻至室溫。

接種乳酸菌發(fā)酵：向冷卻好的發(fā)酵液中加入活化菌株（10 mL 葡萄糖水溶液活化20 min，活化后的菌種濃度為6.0 lg（CFU/mL），將活化好的菌株按一定比例接種至發(fā)酵液中，隨后放入恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行厭氧發(fā)酵48 h，發(fā)酵完成后得到成品。

1.2.3 桑葚汁發(fā)酵工藝單因素實驗

1.2.3.1 菌種類型對感官評分和活菌數(shù)的影響 設(shè)置菌種類型為LP、BL、LP&BL（1:1），按照1.2.1 中的工藝流程進(jìn)行樣品處理，固定初始pH 為6.0，低聚果糖添加量0.09%，菌種添加量0.06%，發(fā)酵溫度37 ℃，以發(fā)酵后的感官評分和活菌數(shù)為評價指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵菌種類型。

1.2.3.2 初始pH 對感官評分和活菌數(shù)的影響 設(shè)置初始pH 為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，按照1.2.1 中的工藝流程進(jìn)行樣品處理，固定菌種類型為LP&BL（1:1），低聚果糖添加量0.09%，菌種添加量0.06%，發(fā)酵溫度37 ℃，以發(fā)酵后的感官評分和活菌數(shù)為評價指標(biāo)，確定最佳初始pH。

1.2.3.3 低聚果糖添加量對感官評分和活菌數(shù)的影響 設(shè)置低聚果糖添加量為0.03%、0.06%、0.09%、0.12%、0.15%，按照1.2.1 中的工藝流程進(jìn)行樣品處理，固定菌種類型為LP&BL（1:1），初始pH 為6.0，菌種添加量0.06%，發(fā)酵溫度37 ℃，以發(fā)酵后的感官評分和活菌數(shù)為評價指標(biāo)，確定最佳低聚果糖添加量。

1.2.3.4 菌種添加量對感官評分和活菌數(shù)的影響設(shè)置菌種添加量為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%，按照1.2.1 中的工藝流程進(jìn)行樣品處理，固定菌種類型為LP&BL（1:1），初始pH 為6.0，低聚果糖添加量0.09%，發(fā)酵溫度37 ℃，以發(fā)酵后的感官評分和活菌數(shù)為評價指標(biāo)，確定最佳菌種添加量。

1.2.3.5 發(fā)酵溫度對感官評分和活菌數(shù)的影響 設(shè)置發(fā)酵溫度為33、35、37、39、41 ℃，按照1.2.1 中的工藝流程進(jìn)行樣品處理，固定菌種類型為LP&BL（1:1），初始pH 為6.0，低聚果糖添加量0.09%，菌種添加量0.06%，以發(fā)酵后的感官評分和活菌數(shù)為評價指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.4 桑葚汁發(fā)酵工藝響應(yīng)面試驗 以單因素實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇菌種添加量、初始pH、發(fā)酵溫度和低聚果糖添加量為影響因素，以感官評分和活菌數(shù)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.2.5 感官評價 參照盛潔等[18]方法稍作修改，制定發(fā)酵桑葚汁的感官評價標(biāo)準(zhǔn)；感官評價選取15 名身體健康且經(jīng)過感官評價培訓(xùn)的人員，按照感官評分表對發(fā)酵桑葚汁進(jìn)行感官評定，最終評價結(jié)果取平均值，感官評分表見表2。

1.2.6 理化指標(biāo)檢測方法 采用pH 計測定pH；可溶性固形物采用數(shù)顯糖度計進(jìn)行測定；乳酸菌活菌數(shù)測定參照GB 4789.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》[19]，總糖測定采用3,5 二硝基水楊酸法[20]；總酸測定參照GB 123456-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測定》[21]。

1.2.7 功能性成分檢測方法

1.2.7.1 總酚含量測定 參照Kwaw 等[22]方法稍作修改；取 2 mL 成品樣品，加入13 mL 蒸餾水、1.5 mL福林酚，室溫避光放置5 min，加入3 mL 12%碳酸鈉溶液，蒸餾水定容25 mL。室溫避光放置90 min，于765 nm 波長測定吸光度，使用沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.1125x+0.046，R2=0.9958，總酚含量以沒食子酸含量計。

1.2.7.2 總黃酮含量測定 參照Gao 等[23]方法稍作修改；取2 mL 成品樣品加入0.6 mL 5%亞硝酸鈉溶液，放置6 min；加入0.6 mL 10%硝酸鋁溶液，放置6 min；再加8 mL 4%氫氧化鈉溶液；用蒸餾水定容至15 mL，充分搖晃3 min。于508 nm 波長測定吸光度，使用蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0539x+0.0158，R2=0.9979，總黃酮含量以蘆丁含量計。

1.2.7.3 總花青素含量測定 采用pH 示差法；取10 mL 成品樣品，用氯化鉀-鹽酸緩沖液（pH1.0）和乙酸鈉-鹽酸緩沖液（pH4.5）定容至20 mL；避光放置90 min，于525 nm 和700 nm 波長測定吸光度。

式中：MW為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷分子量449.2；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)26900；I 為比色皿光程1 cm；DF 為稀釋因子10。

1.2.8 抗氧化指標(biāo)檢測方法

1.2.8.1 DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率和總抗氧化能力測定 參照Chen 等[24]方法；DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率按下式計算：

式中：A1為樣品吸光值，A2為對照組吸光值，A3為空白組吸光值。

式中：A1為空白組吸光值，A2為樣品吸光值。

總抗氧化能力中以硫酸亞鐵為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0995x+0.1209，R2=0.9936，總抗氧化能力以硫酸亞鐵含量表示。

1.2.8.2 ·OH 清除率測定 參照李佩佩等[25]方法；·OH 清除率按下式計算：

式中：A1為樣品吸光值，A2為對照組吸光值，A3為空白組吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗平行測定3 次，對得到的數(shù)據(jù)采用Design-ExpertV8.0.6 和SPSS 25.0 分析處理實驗數(shù)據(jù)，origin8.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 菌種對桑葚汁感官評分和活菌數(shù)的影響 由圖1 可知，不同乳酸菌發(fā)酵的感官評分和活菌數(shù)各不相同，植物乳桿菌發(fā)酵的活菌數(shù)比長雙歧桿菌高，呈顯著性差異（P＜0.05），可能是植物乳桿菌適應(yīng)生長能力較強(qiáng)，在桑葚汁發(fā)酵液中的生長代謝較好；在菌種發(fā)酵方式方面，植物乳桿菌和長雙歧桿菌均勻混合配比發(fā)酵桑葚汁的感官評分和活菌數(shù)最高，可能是由于混合菌種發(fā)酵時不同種類菌種發(fā)酵特性的協(xié)同作用，豐富了產(chǎn)品的口感，同時提高活菌數(shù)。綜合考慮感官評分和活菌數(shù)的變化，選擇植物乳桿菌和長雙歧桿菌均勻混合配比進(jìn)行發(fā)酵。

圖1 菌種類型對桑葚汁感官評分和活菌數(shù)的影響Fig.1 Effects of culture model on sensory score and viable bacteria count of mulberry juice

2.1.2 初始pH 對桑葚汁感官評分和活菌數(shù)的影響不同初始pH 對發(fā)酵產(chǎn)品的感官評分和活菌數(shù)均有影響；由圖2 可知，感官評分和活菌數(shù)隨pH 的升高呈先增大后降低的變化趨勢，當(dāng)桑葚汁初始pH為6.0 時其感官評分和活菌數(shù)最高。感官評分的變化可能是在初始pH 較小時發(fā)酵液環(huán)境適宜乳酸菌的繁殖，乳酸菌發(fā)酵可增加發(fā)酵液中的有機(jī)酸類和低濃度乙醛等芳香物質(zhì)，且乳酸菌發(fā)酵可使發(fā)酵液中的物質(zhì)更細(xì)膩[26]，提升產(chǎn)品口感；初始pH 為6.0 時達(dá)到乳酸菌發(fā)酵最適生長環(huán)境，感官評分最高。隨著初始pH 升高，碳酸鈉加入量過多使得產(chǎn)品風(fēng)味變差，感官評分降低?；罹鷶?shù)變化趨勢可能是由于乳酸菌的生長繁殖條件所影響，在初始pH 較低的環(huán)境下會增加乳酸菌的發(fā)酵延滯期，乳酸菌的生長繁殖會減緩[27]；初始pH 升高會使發(fā)酵液中的離子平衡發(fā)生移動，降低發(fā)酵液中的有效營養(yǎng)成分，限制了乳酸菌的生長繁殖。綜合考慮感官評分和活菌數(shù)的變化，故選擇初始pH 為5.5、6.0 和6.5 進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

圖2 初始pH 對桑葚汁感官評分和活菌數(shù)的影響Fig.2 Effects of initial pH on sensory score and viable bacteria count of mulberry juice

2.1.3 低聚果糖添加量對桑葚汁感官評分和活菌數(shù)的影響 低聚果糖由植物的果糖短鏈組成，是一種水溶性膳食纖維，同時也被作為益生元應(yīng)用于益生菌生長研究中[28]。由圖3 可知，隨著低聚果糖添加量的增大，感官評分和活菌數(shù)均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。在低聚果糖添加量為0.09%時，感官評分最高為93 分，活菌數(shù)達(dá)到最大值為12.31 lg（CFU/mL），這可能是由于低聚果糖具有促進(jìn)益生菌生長的功能[29-30]；當(dāng)添加適量低聚果糖時，可有效促進(jìn)桑葚汁中乳酸菌的生長繁殖，低聚果糖添加量過多時，加快了乳酸菌的生長速度，其代謝產(chǎn)物乳酸等酸類化合物產(chǎn)量增大，影響了發(fā)酵液中乳酸菌的活菌數(shù)量，同時使產(chǎn)品口感受到影響。綜合考慮，故選擇低聚果糖添加量0.06%、0.09%、0.12%進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

圖3 低聚果糖添加量對桑葚汁感官評分和活菌數(shù)的影響Fig.3 Effects of fructooligosaccharide addition on sensory score and viable bacteria count of mulberry juice

2.1.4 菌種添加量對桑葚汁感官評分和活菌數(shù)的影響 由圖4 可知，菌種添加量在0.02%～0.06%范圍內(nèi)感官評分和活菌數(shù)均呈上升趨勢，且上升幅度較大，當(dāng)菌種添加量為0.06%時，感官評分和活菌數(shù)達(dá)到最大，分別為90 分和12.16 lg（CFU/mL）；菌種添加量大于0.06%時，感官評分和活菌數(shù)均下降，感官評分下降幅度較大?？赡苁怯捎诰N添加量過高時，發(fā)酵液內(nèi)的營養(yǎng)成分無法滿足過量乳酸菌的生長代謝需求，影響乳酸菌的生長繁殖，近而降低活菌數(shù)量[31]；同時過量乳酸菌在發(fā)酵時會產(chǎn)生大量酸類化合物，使桑葚汁感官評分降低。綜合考慮選擇菌種添加量0.04%、0.06%和0.08%進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

2.1.5 發(fā)酵溫度對桑葚汁感官評分和活菌數(shù)的影響由圖5 可知，活菌數(shù)隨著發(fā)酵溫度上升呈先增大后減小的趨勢，發(fā)酵溫度在37 ℃時活菌數(shù)達(dá)到最大；這可能是由于乳酸菌的最適生長溫度所致，當(dāng)溫度過高時會使乳酸菌失去活性，影響乳酸菌的活菌數(shù)[32]。發(fā)酵溫度為37 ℃時感官評分最大為90 分，發(fā)酵溫度高于37 ℃感官評分降低，可能是由于溫度過高影響了桑葚汁中香味成分，破壞桑葚汁中的呈味物質(zhì)，同時乳酸菌發(fā)酵也對感官評分有所影響。綜合考慮感官評分和活菌數(shù)的變化，選擇發(fā)酵溫度35、37 和39 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

圖5 發(fā)酵溫度對桑葚汁感官評分和活菌數(shù)的影響Fig.5 Effects of fermentation temperature on sensory score and viable bacteria count of mulberry juice

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 試驗設(shè)計方案與結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取菌種添加量（0.04%、0.06%、0.08%）、初始pH（5.5、6.0、6.5）、發(fā)酵溫度（35、37 和39 ℃）和低聚果糖添加量（0.06%、0.09%、0.12%）為影響因素，以感官評分和活菌數(shù)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計方案與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與結(jié)果Table 3 Response surface experimental design and results

2.2.2 回歸模型與方差分析 利用響應(yīng)面處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理擬合，得到桑葚汁發(fā)酵工藝感官評分（Y）和活菌數(shù)（M）的多元二次回歸方程：

Y=90.78+1.80A+4.50B+2.81C+2.51D+0.65AB+0.48AC-0.27AD+1.32BC-1.02 BD+1.72CD-3.51A2-5.09B2-5.10C2-3.67D2

M=12.26+0.27A+0.22B+0.31C+0.17D-0.20AB-0.075AC-0.15AD+0.025BC-0.025BD+0.025CD-0.80A2-0.59B2-0.53C2-0.44D2

對擬合的模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4，感官評分（Y）和活菌數(shù)（M）的模型為差異極顯著（P＜0.01），失擬項結(jié)果顯示不顯著（P＞0.05），且感官評分（Y）和活菌數(shù)（M）模型的相關(guān)系數(shù)分別為R2（Y）=96.52%、R2（M）=97.07%，校正系數(shù)分別為R2Adj（Y）=93.04%、R2Adj（M）=94.13%，綜上可知感官評分（Y）和活菌數(shù)（M）的模型擬合度較好，模型可用于桑葚汁發(fā)酵工藝的結(jié)果預(yù)測。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression models

由表4 可知，感官評分（Y）模型中一次項A、B、C、D 和二次項A2、B2、C2、D2對感官評分結(jié)果呈差異極顯著（P＜0.01），交互項CD 呈差異顯著（P＜0.05），其余為不顯著（P＞0.05）；活菌數(shù)（M）模型中一次項A、B、C、D 和二次項A2、B2、C2、D2對活菌數(shù)結(jié)果呈差異極顯著（P＜0.01），交互項AB 呈差異顯著（P＜0.05），其余為不顯著（P＞0.05）；同時F值能反映出響應(yīng)面因素對響應(yīng)值的影響大小，響應(yīng)面因素對感官評分（Y）的影響順序為初始pH＞發(fā)酵溫度＞低聚果糖添加量＞菌種添加量，對活菌數(shù)（M）的影響順序為發(fā)酵溫度＞菌種添加量＞初始pH＞低聚果糖添加量。

2.2.3 響應(yīng)面因素交互作用 響應(yīng)面三維立體圖是由響應(yīng)面因素與響應(yīng)值構(gòu)成，可通過響應(yīng)面三維立體圖的曲面彎曲坡度反映兩個響應(yīng)面因素之間的交互作用強(qiáng)弱，曲面彎曲坡度越大，交互作用越強(qiáng)，對響應(yīng)值的影響越大；同時響應(yīng)面三維立體圖中的等高線圖反映出兩個響應(yīng)面因素間的交互作用顯著性，等高線圖越接近橢圓的說明兩個響應(yīng)面因素間的交互作用越明顯，呈顯著性差異[33-34]。

由圖6 可知，感官評分（Y）和活菌數(shù)（M）與四個響應(yīng)面因素間形成的響應(yīng)面圖曲面彎曲坡度均較大，且坡面較陡，說明四個響應(yīng)面一次項和二次項因素對感官評分（Y）和活菌數(shù)（M）的影響均為差異極顯著；發(fā)酵溫度（C）和低聚果糖（D）形成的響應(yīng)面圖坡度較小，說明二者交互作用對感官評分（Y）的影響為差異顯著；同時菌種添加量（A）和初始pH（B）的交互作用對活菌數(shù)（M）的影響為差異顯著。

2.2.4 模型驗證實驗 通過響應(yīng)面軟件模擬分析得到響應(yīng)面因素對感官評分影響的發(fā)酵桑葚汁工藝參數(shù)為菌種添加量0.066%，初始pH6.24，發(fā)酵溫度37.48 ℃，低聚果糖0.101%，此時感官評分最高為93.175 分。響應(yīng)面因素對活菌數(shù)影響的發(fā)酵桑葚汁工藝參數(shù)為菌種添加量0.062%，初始pH6.083，發(fā)酵溫度37.41℃，低聚果糖0.094%，此時活菌數(shù)最高為12.354 lg（CFU/mL）。發(fā)酵桑葚汁工藝以活菌數(shù)為第一評價指標(biāo)，感官評分為第二評價指標(biāo)，在活菌數(shù)最高的條件下，感官評分為92.885 分，與感官評分最優(yōu)條件下的差別較小。故綜合考慮發(fā)酵桑葚汁工藝參數(shù)為菌種添加量0.062%，初始pH6.083，發(fā)酵溫度37.41℃，低聚果糖0.094%，便于實際生產(chǎn)操作，根據(jù)實際情況將工藝參數(shù)微調(diào)為菌種添加量0.06%，初始pH6.1，發(fā)酵溫度37℃，低聚果糖0.09%，對此工藝參數(shù)進(jìn)行實際驗證實驗，得到感官評分為93分，活菌數(shù)為12.32 lg（CFU/mL），與模型擬合預(yù)測值基本一致，說明此模型較切合實際情況。

2.3 乳酸菌對發(fā)酵桑葚汁理化指標(biāo)的影響

由表5 可知，在乳酸菌發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵的深入，BL、LP 和LP&BL 的TSS 均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，降低幅度較?。磺以贚P&BL 發(fā)酵中，TS 由未發(fā)酵時的68.49 mg/mL 降低為發(fā)酵48 h 的57.44 mg/mL，呈現(xiàn)顯著性（P＜0.05）降低，這可以歸因于乳酸菌菌株利用其進(jìn)行生長代謝和生物轉(zhuǎn)化為乳酸；TS 含量變化可以被認(rèn)為是發(fā)酵過程中消耗糖類化合物和產(chǎn)生有機(jī)酸之間的平衡作用[35]。同理，發(fā)酵桑葚汁pH 呈下降趨勢，TA 呈上升趨勢；TA 含量變化表明乳酸菌菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了酸性化合物。與單菌株發(fā)酵相比，混合菌株隨著發(fā)酵時間的延長TA 含量顯著升高（P＜0.05）?；旌暇臧l(fā)酵能顯著提高發(fā)酵桑葚汁的總酸含量，降低總糖含量，促進(jìn)乳酸菌的生長繁殖。

表5 桑葚汁發(fā)酵過程中理化指標(biāo)變化Table 5 Changes of physical and chemical indexes during fermentation of mulberry juice

2.4 乳酸菌對發(fā)酵桑葚汁功能性成分影響

由圖7 可知，總酚（TPC）、總黃酮（TFC）和總花青素（TAC）的含量在發(fā)酵各階段間均有不同的變化趨勢，發(fā)酵桑葚汁與未發(fā)酵桑葚汁相比，乳酸菌發(fā)酵能有效提高發(fā)酵桑葚汁的功能性化合物含量；這可能是因為在發(fā)酵過程中乳酸菌會產(chǎn)生一些特定的水解酶，而這些特定的水解酶將發(fā)酵液中復(fù)雜的酚類化合物去糖基化，使其分解成分子量較小、結(jié)構(gòu)組成較簡單的酚酸化合物[36]，這與Gan 等[37]研究結(jié)果一致，其利用乳酸菌發(fā)酵豆奶，發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵可有效提高總酚含量。發(fā)酵桑葚汁間的化合物濃度差異可能是由于不同乳酸菌自身的生理特性以及在發(fā)酵時所分泌的產(chǎn)物不同所致。

圖7 桑葚汁發(fā)酵過程中功能性成分含量變化Fig.7 Changes in content of functional components during fermentation of mulberry juice

TPC 含量如圖7（A），在單菌株發(fā)酵方式中，隨著發(fā)酵時間的延長，TPC 含量呈逐漸增大的變化趨勢；其中發(fā)酵48 h 的TPC 含量最高；同時在發(fā)酵后24 h 中混合菌株發(fā)酵TPC 含量趨于平穩(wěn)（P＞0.05）；產(chǎn)生這種趨勢變化可能是發(fā)酵過程中乳酸菌生長代謝所引起的，乳酸菌代謝過程中產(chǎn)生的物質(zhì)將復(fù)雜的酚類化合物分解為結(jié)構(gòu)簡單的化合物，分子量變小[38]，提高了TPC 含量；隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸菌生長降低pH，致使乳酸菌生長繁殖受到限制，代謝產(chǎn)物分泌受阻，生長速度減緩；TPC 含量趨于穩(wěn)定。

TFC 含量如圖7（B）,TFC 含量變化中單菌株發(fā)酵與混合菌株發(fā)酵相比，混合菌株發(fā)酵方式的TFC含量較高，這可能是由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的酶類物質(zhì)將復(fù)雜的多酚分解為小分子的黃酮醇物質(zhì)[39]。在發(fā)酵前24 h 中，TFC 含量升高趨勢較大，呈顯著差異（P＜0.05）；發(fā)酵時間36 h 至48 h 中，TFC 含量變化趨于穩(wěn)定（P＞0.05），可能是由于發(fā)酵初期發(fā)酵液環(huán)境適宜乳酸菌生長繁殖，其生長速度較快，代謝產(chǎn)物較多，對多酚物質(zhì)分解為黃酮醇物質(zhì)加快，發(fā)酵后期隨著乳酸菌含量增多，發(fā)酵液pH 降低，致使乳酸菌生長速度減緩。

TAC 含量變化如圖7（C），發(fā)酵前24 h 中植物乳桿菌發(fā)酵和混合菌株發(fā)酵的TAC 含量呈顯著上升趨勢（P＜0.05），發(fā)酵24 h 至48 h 中長雙歧桿菌和植物乳桿菌的單菌株TAC 含量呈下降趨勢，混合菌株發(fā)酵的TAC 含量趨于穩(wěn)定（P＞0.05），在發(fā)酵開始至發(fā)酵結(jié)束中混合菌株發(fā)酵的TAC 含量高于長雙歧桿菌和植物乳桿菌的單菌株發(fā)酵；混合菌株發(fā)酵的TAC 含量由未發(fā)酵時0.67 mg/mL 增加為發(fā)酵48 h 后的1.95 mg/mL；這可能是由于發(fā)酵初期乳酸菌生長繁殖使得花青素中結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，增加了其含量；發(fā)酵后期單菌株發(fā)酵的花青素含量下降可能是由于花青素不太穩(wěn)定的原因所致，發(fā)酵后期混合菌株發(fā)酵的花青素含量趨于穩(wěn)定（P＞0.05）可能是由于乳酸菌菌株間的協(xié)同作用，混合菌株發(fā)酵更深層次影響TAC 的含量。混合菌株發(fā)酵能提高TAC 含量可能與TAC 易受外界環(huán)境條件（光照、溫度和發(fā)酵類型等）的影響有關(guān)[40]。

綜上所述，植物乳桿菌和長雙歧桿菌均勻混合配比的混合菌株發(fā)酵可有效提高發(fā)酵桑葚汁中的TPC、TFC 和TAC 含量。

2.5 乳酸菌對發(fā)酵桑葚汁抗氧化活性影響

由表6 可知，與未發(fā)酵樣品相比，發(fā)酵樣品擁有較高的抗氧化活性，呈顯著性差異（P＜0.05），說明乳酸發(fā)酵對抗氧化活性的提高具有積極的影響，乳酸菌在發(fā)酵時可以增加發(fā)酵液中的總酚等化合物的含量，同時增加具有給質(zhì)子特性化合物的可用性，這些化合物有效地提高了DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除率抗氧化反應(yīng)中陽離子還原率[41]，從而提高抗氧化活性；混合菌株發(fā)酵桑葚汁的抗氧化活性要優(yōu)于單菌株發(fā)酵?；旌暇臧l(fā)酵48 h 時的抗氧化活性顯著（P＜0.05）高于單菌株發(fā)酵。

表6 桑葚汁發(fā)酵過程中抗氧化活性變化Table 6 Changes in antioxidant activity during fermentation of mulberry juice

3 結(jié)論

本研究以植物乳桿菌和長雙歧桿菌為發(fā)酵菌株，分別進(jìn)行單菌株發(fā)酵和混合菌株發(fā)酵，優(yōu)化桑葚汁發(fā)酵工藝及探討桑葚汁發(fā)酵時的功能品質(zhì)。研究結(jié)果表明，在優(yōu)化發(fā)酵工藝方面，混合菌株發(fā)酵桑葚汁的感官評分和活菌數(shù)最高，在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面試驗得到最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為菌種添加量0.06%，初始pH6.1，發(fā)酵溫度37 ℃，低聚果糖添加量0.09%，此時感官評分最高為93 分，活菌數(shù)為12.32 lg（CFU/mL）；在發(fā)酵桑葚汁的功能品質(zhì)方面，混合菌株發(fā)酵可以提高乳酸菌活菌數(shù)量、功能性化合物含量和抗氧化活性。在桑葚汁發(fā)酵過程中，混合菌株發(fā)酵具有較好的生物活性和化合物特性，總黃酮含量由4.18 mg/mL 增加為6.36 mg/mL，總花青素由0.67 mg/mL 增加為1.95 mg/mL，總酚含量由12.62 mg/mL 增加為18.65 mg/mL；同時ABTS+自由基清除率、DPPH 自由基清除率、羥自由基清除率和總抗氧化能力均得到有效提高。因此，植物乳桿菌和長雙歧桿菌混合發(fā)酵可有效提高發(fā)酵桑葚汁的感官體驗和功能特性，可為桑葚深加工提供一種新的高附加值產(chǎn)品。