付 明，臧延青

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學體育教研部，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319）

運動性疲勞是指難以開始或維持自愿運動型活動，并可分為精神性運動疲勞和身體性運動疲勞，運動性疲勞會引起工作效率下降[1]，也是某些疾病的前兆，如癌癥、多發(fā)性硬化癥、抑郁癥和帕金森病[2-4]。非病理性/生理性疲勞在不同運動過程、類型、強度和持續(xù)時間等生理上均有所表現(xiàn)[5-6]。在長時間的耐力鍛煉中，肌肉所需的能量不足以維持和產(chǎn)生相同水平的力量，導致疲勞反應和降低運動表現(xiàn)[7]。由于現(xiàn)代社會的快速發(fā)展，疲勞已經(jīng)成為越來越普遍的健康問題，而現(xiàn)代人偏向于用運動的方式解決健康問題的同時又會引發(fā)運動性疲勞。目前，對運動性疲勞有效治療的藥物或療法在很大程度上仍無法滿足需求[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，自由基的產(chǎn)生、能量的消耗和有害代謝產(chǎn)物的積累都會導致運動性疲勞[10]。近年來，運動營養(yǎng)補充劑被認為是提高運動表現(xiàn)或減少運動后疲勞的必要手段，對科學鍛煉起到了重要作用。除了傳統(tǒng)的草藥、蛋白質和肌酸等，益生菌作為膳食補充劑受到越來越多的關注[11]。

益生菌是一種定植于腸道對宿主健康有益的活的微生物[12]。大量的研究表明，益生菌具有多種生物學效應，如提高胰島素敏感性、誘導癌細胞凋亡、抗高血壓、降膽固醇、抗炎、抗菌和抗氧化等[13-16]。近年來，越來越多的研究表明益生菌具有提高運動能力和抗疲勞的功能，因此越來越多地被運動員用作營養(yǎng)補充以提高運動表現(xiàn)和減少運動后疲勞[17]。在動物水平上，Yun 等[18]研究表明嗜酸乳桿菌、兩歧雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌可以延長小鼠力竭游泳時間。夏亞麗[19]研究表明混合益生菌可以改善大鼠疲勞相關指標。在人體水平，Callister 等[20]研究表明嗜酸乳桿菌具有緩解運動員疲勞的功能。Sullivan 等[21]研究表明嗜酸乳桿菌NCFB 1748、副干酪乳桿菌F19 和乳雙歧桿菌Bb12 可以緩解慢性疲勞綜合征患者疲勞程度。

本團隊前期從長跑運動員糞便中分離出嗜酸乳桿菌M6，發(fā)現(xiàn)其具有良好的模擬胃腸液耐受性和黏附腸道的潛力。因此本研究首先通過檢測小鼠肌肉力量和運動耐力評價嗜酸乳桿菌M6 改善小鼠運動能力的水平，隨后檢測疲勞相關指標、能量代謝相關指標、抗氧化相關指標，系統(tǒng)地評價嗜酸乳桿菌M6抗疲勞的作用，為開發(fā)提高運動表現(xiàn)和減少運動后疲勞的營養(yǎng)補充劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級雄 性C57BL/6N 小鼠 60 只，6 周齡，體質量18～21 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司[SYXK（京）2022-0052]；肌糖原試劑盒、肝糖原試劑盒、血糖試劑盒、甘油三酯試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物科技有限公司；其他試劑均為分析純 上海國藥集團；嗜酸乳桿菌M6 分離自長跑運動員糞便 經(jīng)過16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定，前期實驗表明該菌株良好的模擬胃腸液耐受性和黏附腸道的潛力，該菌株保存在本實驗室。

DHP-9272 型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；LDZF-50KB-Ⅱ立式蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-16G 離心機 上海安亭科技儀器廠；DW-150W200 超低溫冰箱 青島海爾集團；HH-6D 單列數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市凱航儀器有限公司；MF1035B 電子天平 濟南童鑫生物科技有限公司；V-1600B 紫外可見分光光度計 青島明博環(huán)保科技有限公司；GL-12MS/GL-12M 高速臺式離心機賽默飛世爾科技（中國）有限公司；全波長酶標儀美國Bio-Rad 公司；Milli-Q 超純水儀 美國Millipore公司；低力測試系統(tǒng) 日本愛光公司；自動分析儀美國Beckman 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌處理方法 將第3 代培養(yǎng)至18 h的嗜酸乳桿菌M6 從培養(yǎng)箱中取出，8000×g 離心10 min，棄去上清液后，再用無菌蒸餾水洗滌菌體3 次，之后將菌體重懸于無菌蒸餾水中，菌體濃度均調至1.5×1010CFU/mL，備用。

1.2.2 動物分組與飼養(yǎng) 將60 只6 周齡C57BL/6N雄性小鼠在明暗交替l2 h，室溫為（22±2）℃，相對濕度為45%±5%的SPF 級動物房適應性飼養(yǎng)1 周，期間自由飲食和飲水，隨機分為4 組：對照組、嗜酸乳桿菌M6 低、中、高劑量組，每組15 只。嗜酸乳桿菌M6 低、中、高劑量組每天分別灌胃0.2 mL 的3×107、3×108和3×109CFU 嗜酸乳桿菌M6，對照組灌胃等體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃4 周。記錄小鼠體重。本實驗所涉及所有實驗動物飼養(yǎng)均符合國家實驗動物福利指南及實驗動物倫理規(guī)范。

1.2.3 前肢握力檢測實驗 按照文獻[22]描述，使用低力測試系統(tǒng)測量所有小鼠的前肢握力。

1.2.4 力竭游泳實驗 末次灌胃30 min 后，小鼠尾根部進行負荷5%體質量的鉛絲處理，放于40 cm 深度的游泳箱中游泳。實驗過程確保小鼠四肢持續(xù)運動。小鼠力竭游泳時間為小鼠從游泳開始至鼻孔完全沒入水中7 s，不能浮出水面的時間。

1.2.5 疲勞相關生化指標測定 末次灌胃后進行力竭游泳30 min，對所有小鼠進行無負重的游泳15 min，吹干，人道處死小鼠，取肝臟和前肢肌肉部位，洗凈，吸干。在小鼠眼球取血，靜置30 min 后，在4 ℃下1500×g 離心10 min 收集血清，血清中肌酸激酶活力、乳酸含量、尿素氮含量、氨含量用自動分析儀檢測。

1.2.6 能量代謝相關生化指標測定 按照試劑盒說明書測定肝糖原、肌糖原、血糖和血清甘油三酯含量。

1.2.7 抗氧化相關指標的測定 血清SOD、CAT 和GSH-Px 的活力以及MDA 含量按照試劑盒檢測方法檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗所有數(shù)據(jù)均平行測定3 次，數(shù)據(jù)結果以均值±標準偏差表示，采用SPSS 軟件進行數(shù)值變量趨勢性分析及Duncan' test 單因素分析，P＜0.05 為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌M6 對小鼠體重和肌肉力量的影響

通常情況下，需要有計劃的運動訓練才能增加握力[23]。如圖1A 所示，補充4 周的嗜酸乳桿菌M6后，相比于對照組小鼠的體重增重，嗜酸乳桿菌M6低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠的體重增重均無顯著差異（P＞0.05）。如圖1B 所示，補充4 周的嗜酸乳桿菌M6 后，相比于對照組小鼠的前肢握力，嗜酸乳桿菌M6 低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠的前肢握力均顯著增加（P＜0.001），分別是124.01±6.02、132.02±4.30 和139.66±4.72 g；趨勢分析顯示隨著嗜酸乳桿菌M6 劑量的增加，前肢握力呈劑量依賴性增加（P＜0.001），但中劑量組與高劑量組差異不顯著。前期研究表明補充乳酸菌可降低肌肉萎縮標志物相關基因的表達水平[24]，乳酸菌可以減少作為腓腸肌和脛骨肌蛋白質分解的主要系統(tǒng)的自噬-溶酶體途徑的標志物[25]。以上研究表明嗜酸乳桿菌M6 具有良好的增加肌肉力量的作用。

圖1 嗜酸乳桿菌M6 對小鼠體重增重（A）和前肢握力（B）的影響Fig.1 Effects of L.acidophilus M6 supplementation on body weight gain (A) and forelimb grip strength (B) in mice

2.2 嗜酸乳桿菌M6 對小鼠運動耐力的影響

負重游泳實驗可用于評估小鼠的運動耐力，且具有較高的重現(xiàn)性[26]。如圖2 所示，補充4 周的嗜酸乳桿菌M6 后，相比于對照組小鼠，嗜酸乳桿菌M6 低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠的力竭游泳時間均顯著增加（P＜0.001），分別增加0.55%、1.11%、2.07%；趨勢分析顯示隨著嗜酸乳桿菌M6 劑量的增加，力竭游泳時間呈劑量依賴性增加（P＜0.001）。Yun 等[18]研究表明嗜酸乳桿菌、兩歧雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌可以延長小鼠力竭游泳時間約7 min。本研究顯示在不通過訓練的方式下，嗜酸乳桿菌M6 可以顯著提高力竭游泳時間，以上研究表明嗜酸乳桿菌M6 具有良好的提高運動耐力的效果。

圖2 嗜酸乳桿菌M6 對小鼠力竭游泳時間的影響Fig.2 Effect of L.acidophilus M6 supplementation on exhaustive swim time in mice

2.3 嗜酸乳桿菌M6 對小鼠抗疲勞相關指標的影響

肌酸激酶是一種與能量轉移、肌肉收縮和ATP再生直接相關的重要激酶。運動鍛煉后，體內肌酸激酶顯著增加，且與運動強度呈正相關[27]。如圖3A 所示，補充4 周的嗜酸乳桿菌M6 后，相比于對照組小鼠，嗜酸乳桿菌M6 低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠的血清肌酸激酶活力均顯著（P＜0.001）降低，但中劑量組與高劑量組間無顯著性差異。小鼠血清肌酸激酶活力分別降低16.00%、28.50%、33.90%；趨勢分析顯示隨著嗜酸乳桿菌M6 劑量的增加，肌酸激酶活力呈劑量依賴性降低（P＜0.001）。夏亞麗[19]研究表明混合益生菌可以降低大鼠肌酸激酶的活力。這表明嗜酸乳桿菌M6 能夠降低小鼠體內肌酸激酶活力，進而緩解機體疲勞。

圖3 嗜酸乳桿菌M6 對小鼠疲勞指標的影響Fig.3 Effect of L.acidophilus M6 supplementation on fatigue-associated factors in mice

血液中的乳酸是機體發(fā)生糖代謝的必然產(chǎn)物，乳酸的升高將導致肌肉組織和血液的pH 下降，引發(fā)對人體功能有害的生化和生理過程，乳酸是評價機體有氧代謝和疲勞的重要指標[28]。如圖3B 所示，補充4 周的嗜酸乳桿菌M6 后，相比于對照組小鼠，嗜酸乳桿菌M6 低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠的血乳酸含量均顯著（P＜0.001）降低，但中劑量組與高劑量組間無顯著性差異，其乳酸含量分別是10.13±1.00、8.36±0.99 和6.09±0.36 mol/L；Huang 等[22]研究表明運動訓練和長雙歧桿菌OLP-01 聯(lián)合可以顯著降低乳酸含量，而本研究這表明嗜酸乳桿菌M6 單獨使用能夠降低小鼠血液中的乳酸，進而緩解機體疲勞。

在正常生理條件下，蛋白質和氨基酸等經(jīng)過分解代謝產(chǎn)生氨，進一步通過肝臟產(chǎn)生尿素，最后經(jīng)血液循環(huán)進入腎臟，隨著尿液排出體外。由于疲勞時機體內糖含量無法滿足運動供能的需求，因此機體內的蛋白質參與供能反應[29]。運動疲勞發(fā)生與血尿素氮含量的呈正相關[30]。如圖3C 所示，補充4 周的嗜酸乳桿菌M6 后，相比于對照組小鼠的血尿素氮含量，嗜酸乳桿菌M6 低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠的血尿素氮含量顯著降低（P＜0.001），但三個劑量組間無顯著性差異，分別降低13.40%、14.90%、31.50%；Lee 等[31]研究表明，1000 mg/kg 劑量的唾液酸乳桿菌SA-03 可以降低血尿素氮含量16.16%，低于本研究的效果（34.86%）。這表明嗜酸乳桿菌M6 能夠降低小鼠血尿素氮，進而緩解機體疲勞。

氨是運動能量代謝過程中產(chǎn)生的一種重要代謝物，由不同來源產(chǎn)生。運動期間血液和大腦中積累的氨會對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生負面影響，會導致疲勞。盡管運動引起的氨中毒是短暫和可逆的，具體取決于疾病狀態(tài)，但它可能會影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)關鍵區(qū)域的持續(xù)協(xié)調活動。中樞神經(jīng)系統(tǒng)在身體疲勞的發(fā)展中起著至關重要的作用[32]。如圖3D 所示，補充4 周的嗜酸乳桿菌M6 后，相比于對照組小鼠的血氨水平，嗜酸乳桿菌M6 低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠的血氨水平均顯著（P＜0.001）減少，分別為115.34±4.50、99.67±4.50 和94.33±4.72 μmol/L，但中劑量組與高劑量組差異不顯著；Lee 等[33]研究表明不同劑量的植物乳桿菌TWK10 均可以顯著降低血氨水平，這表明嗜酸乳桿菌M6 能夠降低小鼠血氨水平，進而緩解機體疲勞。

2.4 嗜酸乳桿菌M6 對小鼠能量供給的影響

低血糖會抑制運動時大腦的活躍功能，導致無法繼續(xù)運動[34]。如圖4A 可以觀察得到，嗜酸乳桿菌M6 低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠的血糖濃度分別是3.26±0.25、4.00±0.20 和4.33±0.15 mmol/L，相比于對照組小鼠呈現(xiàn)出顯著（P＜0.001）增加趨勢，且血糖濃度隨嗜酸乳桿菌M6 劑量的增加表現(xiàn)出劑量依賴性增加（P＜0.001），但中劑量組高劑量組之間差異不顯著。綜上，嗜酸乳桿菌M6 可以通過提高血糖濃度為機體提供能量。

圖4 嗜酸乳桿菌M6 對小鼠能量供給的影響Fig.4 Effect of L.acidophilus M6 supplementation on energy supply in mice

肝糖原主要是在糖消耗后對其進行補充，使血糖穩(wěn)定在正常水平。當處于疲勞狀態(tài)下，在機體運動過程中首先消耗肌糖原，隨后消耗肝糖原供能，因此，糖原消耗與疲勞程度緊密關聯(lián)[35]。如圖4B 顯示出肝糖原含量與嗜酸乳桿菌M6 劑量成正比，與對照組小鼠的肝糖原含量相比均顯著（P＜0.001）增加，但中劑量組與高劑量組差異不顯著；在有氧運動中，肌糖原是中等強度運動時主要供能物質之一，因而肌糖原含量明顯影響機體持續(xù)亞強度運動的時間。如圖4C，肌糖原含量同肝糖原含量變化相似，含量分別是1.70±0.11、2.06±0.15 和2.46±0.30 mg/g。這表明嗜酸乳桿菌M6 可以通過提高肌糖原和肝糖原的積累為機體提供能量。

大部分能量以甘油三酯的形式儲存在脂肪組織中。甘油三酯轉化成游離脂肪酸，進入血液，就可以作為組織中的能量來源[36]。如圖4D，相比于對照組，嗜酸乳桿菌M6 低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠的血清甘油三酯含量均顯著（P＜0.001）降低，數(shù)據(jù)顯示分別為2.04±0.12、1.78±0.08 和1.55±0.04 mmol/L。這表明嗜酸乳桿菌M6 可以通過利用甘油三酯為機體提供能量。Zhang 等[37]研究表明發(fā)酵乳桿菌HFY03 可以顯著提高運動后小鼠的能量供給水平，這與本研究較為一致。

2.5 嗜酸乳桿菌M6 對小鼠氧化應激指標的影響

越來越多的證據(jù)表明，活性氧誘導蛋白質氧化，并強烈地促進肌肉疲勞[38]。益生菌可以減輕氧化應激，改善運動能力，降低疲勞程度[39]。因此本研究采用小鼠氧化應激指標評價嗜酸乳桿菌M6 的改善運動能力和緩解疲勞的作用。超氧化物歧化酶（SOD）是一種來源于活體的活性物質。它是一種含有金屬元素的活性蛋白酶，能清除代謝過程中產(chǎn)生的有害物質，SOD 的含量可以直接反映機體的衰老疲勞程度[40]。如圖5A 所示，相比于對照組小鼠的血清SOD 活力，嗜酸乳桿菌M6 低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠的血清SOD 活力均顯著（P＜0.001）增加，分別提高了6.82%、23.17%和37.80%；趨勢分析顯示隨著嗜酸乳桿菌M6 劑量的增加，血清SOD 活力呈劑量依賴性增加（P＜0.001）。這表明嗜酸乳桿菌M6 可以通過提高SOD 活力，提高機體抗氧化能力，進而緩解疲勞。

圖5 嗜酸乳桿菌M6 對小鼠氧化應激指標的影響Fig.5 Effect of L.acidophilus M6 supplementation on oxidative stress in mice

過氧化氫酶（CAT）可以將H2O2催化分解生成H2O 和O2，保護細胞膜結構和功能完整。因此，CAT常用來評價機體抗氧化能力。如圖5B 所示，嗜酸乳桿菌M6 中劑量組和高劑量組小鼠的血清CAT 活力相較于對照組小鼠的血清CAT 活力均顯著（P＜0.001）增加，分別提高了16.36%和35.15%。這表明嗜酸乳桿菌M6 可以通過提高CAT 活力，提高機體抗氧化能力，進而緩解疲勞。

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是人體最重要的過氧化物酶之一，可用于評估疲勞和健康，能在體內將有毒的過氧化氫還原為無毒無害的羥基化合物，分解過氧化氫，保護細胞膜結構和功能的完整性[41]。運動使身體產(chǎn)生強烈的脂質氧化和葡萄糖代謝等氧化反應[42]。如圖5C 所示，嗜酸乳桿菌M6 中劑量組和高劑量組小鼠的GSH-Px 活力隨著嗜酸乳桿菌M6劑量的增加呈正比顯著（P＜0.001）增加，分別提高了24.13%和38.96%。這表明嗜酸乳桿菌M6 可以通過提高GSH-Px 活力，提高機體抗氧化能力，進而緩解疲勞。

丙二醛（MDA）是機體內氧自由基的重要代謝物，反映機體潛在的抗氧化能力、脂質過氧化的速率以及組織過氧化損傷的程度[43]。運動缺氧可在心肌組織中產(chǎn)生大量自由基。自由基作用于細胞膜上的不飽和脂肪酸，使膜脂發(fā)生過氧化作用，導致心肌細胞損傷，形成脂質過氧化，因此，在疲勞狀態(tài)下，丙二醛濃度升高[40]。如圖5D 所示，嗜酸乳桿菌M6 中劑量組和高劑量組小鼠的MDA 含量降低了14.71%和21.69%，其變化呈現(xiàn)反向增長。這表明嗜酸乳桿菌M6 可以降抑制體內脂質過氧化作用，進而發(fā)揮抗疲勞作用。Yi 等[44]研究表明植物乳桿菌CQPC02 可以緩解疲勞運動引起的氧化應激。Huang 等[45]報道植物乳桿菌PS128 可以改善高強度耐力訓練引起的氧化應激，這與本研究結果相一致。

3 結論

本研究發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量的嗜酸乳桿菌M6 均可以顯著提高（P＜0.001）小鼠前肢握力和力竭游泳時間，低、中、高劑量的嗜酸乳桿菌M6 均可以顯著（P＜0.001）降低小鼠肌酸激酶活力、乳酸、尿素氮和血氨等疲勞指標，增加血糖、肌糖原和肝糖原并降低甘油三酯含量等能量代謝指標，增加小鼠超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶酶活，并降低丙二醛含量，且存在劑量效應。因此，嗜酸乳桿菌M6具有改善小鼠運動能力和緩解運動后疲勞的作用。