曹雨晴，陶飛燕，高 慧，蔡雨情，余 遠(yuǎn)，宋林夢(mèng)，薛 鵬

（濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東濰坊 261200）

人參是五加科、人參屬多年生草本植物，其主要生物活性成分是人參皂苷，如Re、Rg1、Rb1、Rd 等[1]，而人參皂苷在人參屬植物（人參、西洋參、三七）的根、莖和葉、及果實(shí)中皆有分布[2-3]。人參制品在亞洲地區(qū)有數(shù)千年食用歷史，安全性較高，其主要活性成分人參皂苷被證實(shí)有諸多的活性作用，如抗腫瘤、抗衰老、降血糖等作用[1-2]，被廣泛用于醫(yī)藥領(lǐng)域和功能食品[3]。因含量低、活性好、化學(xué)合成難度大等因素，人參中含量極低的皂苷如Rg3，Rk1，F(xiàn)4，Rg6，Rg5 和Rh4 等又被稱為人參稀有皂苷[4-6]。

近年來，人參皂苷的安全性引起了科研工作者的重視。人參皂苷Re、Rg1 對(duì)大鼠口服慢性毒性的研究表明，無大鼠死亡，組織病理學(xué)檢查均未見異常[7-8]。SD 大鼠對(duì)人參稀有皂苷Rg3 的口服最高安全劑量為180 mg/kg[9]。以上研究都證明了人參皂苷有較高的安全性。但在人參皂苷Rb1 經(jīng)腸道細(xì)菌代謝轉(zhuǎn)化為人參稀有皂苷化合物K（CK）的口服慢性毒性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)CK（120 mg/kg）有明顯的肝腎毒性，表現(xiàn)為肝腎相對(duì)重量增加，并伴有灶性肝壞死和血漿ALT、ALP 升高[10]。人參皂苷類型豐富，限于人參稀有皂苷單體的制備成本，其相關(guān)的毒性研究較少。傳統(tǒng)人參稀有皂苷是通過轉(zhuǎn)化人參屬植物的根獲取，而人參莖和葉中皂苷的含量高于根部，且莖和葉為非藥用部位，采集周期短，材料成本低[11-12]。課題組前期通過熱轉(zhuǎn)化人參屬植物莖和葉的方法制備出了人參稀有皂苷混合物，主要含Rg3，Rk1，F(xiàn)4，Rg6，Rg5 和Rh4 等成分，不但提高了人參屬植物莖和葉的利用率，也極大地降低了人參稀有皂苷的制備成本[4-5]。

傳統(tǒng)毒理學(xué)對(duì)人參稀有皂苷毒性研究主要從血生化，血常規(guī)，體重指數(shù)和病理切片等常規(guī)方法評(píng)價(jià)，難以捕捉一些微觀的生理變化。而代謝組學(xué)作為一種新興的高通量測(cè)定技術(shù)，可以快速對(duì)大量微觀內(nèi)源性化合物同時(shí)進(jìn)行分析，從更加微觀的視角探究機(jī)體生理變化[13]。因此本研究在由課題組前期獲取人參稀有皂苷混合物的基礎(chǔ)上，對(duì)SD 大鼠進(jìn)行90 d 經(jīng)口灌胃處理，采用血生化指標(biāo)，肝臟病理切片和肝臟流式細(xì)胞凋亡結(jié)合非靶向代謝組學(xué)技術(shù)綜合評(píng)估其潛在肝臟毒性，以期為人參稀有皂苷食用的安全性提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西洋參莖葉皂苷 吉林宏州生物技術(shù)有限公司。將西洋參莖葉皂苷細(xì)粉過60 目篩后，與0.1%的甲酸混合，在高壓蒸汽滅菌鍋中140 ℃加熱2 h，得到熱轉(zhuǎn)化后的皂苷[4-5]；SPF 級(jí)SD 大鼠48 只，8 周齡，雌雄各半，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司（批號(hào)：SCXK（魯）2019003，370726210100415561 號(hào)）；乙腈（質(zhì)譜級(jí)）、甲醇（質(zhì)譜級(jí)）、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（FITC Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit）賽默飛世爾科技有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總蛋白（TP）試劑盒 南京建成生物工程研究所；4%多聚甲醛 上海橋星貿(mào)易有限公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司。

Multiskan FC 酶標(biāo)儀、UHPLC-Q-Exactive 型超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀、Waters C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）賽默飛世爾科技有限公司；Cyto-Nova 流式細(xì)胞儀 北京博奧晶典有限公司；CKX41倒置光學(xué)顯微鏡 日本Olympus 有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)申請(qǐng)（2020 SDL147）通過后，將48 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。課題組前期急毒實(shí)驗(yàn)測(cè)出人參稀有皂苷的LD50為6 g/kg，按照GB 15193.13-2015 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行90 d 經(jīng)口毒性試驗(yàn)，以LD50的10%作為高劑量組，遞減劑量組間距按照2～4 倍設(shè)置中劑量和低劑量組，將48 只雄性和雌性大鼠，每組6 只成年SD 大鼠，隨機(jī)分為4 組：低劑量人參稀有皂苷組（60 mg/kg）、中劑量人參稀有皂苷組（200 mg/kg）、高劑量人參稀有皂苷組（600 mg/kg）和空白（蒸餾水）對(duì)照組。高中低劑量組以5 mL/kg 人參稀有皂苷灌胃，對(duì)照組予以等體積蒸餾水。正式分組后，飼養(yǎng)條件保持不變。禁食5 h 后每日灌胃，連續(xù)90 d。所有大鼠在采血前禁食24 h，用試劑盒測(cè)量血清中的生化指標(biāo)。

1.2.2 肝細(xì)胞懸液的制備與細(xì)胞凋亡檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死大鼠后迅速取出肝臟組織，冰上剝離多余的脂肪，放入預(yù)先冷藏的生理鹽水中漂洗，洗去紅細(xì)胞，稱重，然后置于潔凈的培養(yǎng)皿中。用眼科剪將肝小葉剪成小塊，將剪碎的肝小葉組織加入提前預(yù)冷的PBS（pH7.4）中進(jìn)行沖洗，過200 目的網(wǎng)篩，洗去剪碎的細(xì)胞碎片，經(jīng)過網(wǎng)篩的過濾作用，收集細(xì)胞懸液于離心管中，1500 r/min，離心5 min，棄掉上清液，加入適量的不含EDTA 的胰蛋白酶消化液，將收集的細(xì)胞沉淀在水浴鍋中以37 ℃恒溫消化10 min，期間不斷吹打細(xì)胞。水浴結(jié)束后，用PBS 重新洗滌細(xì)胞，再次離心，棄去上清液。按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（FITC Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit）說明書，將5X 膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液稀釋成1X 膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液，并將下層細(xì)胞沉淀重新懸浮在1X 膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液中，確定細(xì)胞密度，使得細(xì)胞密度不少于1×106cells/mL，將5 μL 的FITC Annexin V 和1 μL的PI 工作液加入到每100 μL 的細(xì)胞懸液中，輕輕混勻，使用鋁箔避光孵育15 min，盡快用流式細(xì)胞儀上機(jī)分析[14]。

1.2.3 組織病理學(xué)檢查 90 d 灌胃結(jié)束后，對(duì)大鼠采血，解剖器官進(jìn)行尸檢，評(píng)估組織器官的損傷程度。這些器官和組織被摘除并稱重：大腦、心臟、腎臟、肝、肺、脾臟、睪丸、附睪、子宮和卵巢。比較各組絕對(duì)臟器重量（g）。用4%多聚甲醛固定，用蘇木精和伊紅（HE）染色法對(duì)肝小葉組織進(jìn)行染色，制作常規(guī)石蠟切片，光鏡下觀察肝臟組織病理切片的變化。

1.2.4 代謝組學(xué)分析

1.2.4.1 血液前處理 血清：75%甲醇=1:3（V:V）混合，12000 r/min 離心5 min，取上清，按照上清：二氯甲烷=1:4（V:V）稀釋，渦旋振蕩30 s 混勻，12000 r/min離心5 min，取下層（二氯甲烷層）200 μL，干燥揮發(fā)后，用甲醇再復(fù)溶，過0.22 μm 濾膜[15-16]。

1.2.4.2 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用條件 使用UHPLC-QExactive 型超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)血液樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，色譜柱為Waters C18柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相A 為0.1%的甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈。梯度洗脫條件為：0 min 為2%B；2 min 為50% B；9 min 為98% B；15 min 為98%B；20 min 為50% B；23 min 為2% B；28 min 為2%B。速率0.3 mL/min，進(jìn)樣體積為4 μL；質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），數(shù)據(jù)采集范圍50～1200 m/z，采用Full MS-ddMS 模式在正負(fù)離子模式下掃描[15-16]。

使用Compounds Discover 3.1.1 對(duì)液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)導(dǎo)出的.raw 文件進(jìn)行進(jìn)行峰對(duì)齊，峰過濾，峰提取和自動(dòng)積分。搜索BioCyc、Metabolome Database、Human Metabolome Database、KEGG、Serum Metabolome Database 數(shù)據(jù)庫，使用保留時(shí)間RT、分子式和精確分子量等對(duì)化合物進(jìn)行判定分析，通過對(duì)比高劑量組與對(duì)照組、中劑量組與對(duì)照組和低劑量組與對(duì)照組后導(dǎo)出Excel 數(shù)據(jù)文件，后使用SIMCAP 14.1 對(duì)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0 軟件對(duì)人參稀有皂苷給藥組和對(duì)照組的血清生化參數(shù)進(jìn)行分析。對(duì)雌性和雄性大鼠均采用單因素方差分析（ANOVA）。當(dāng)P＜0.05，視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間差異比較采用最小顯著性差異法（LSD）檢驗(yàn)。使用SIMCA-P 14.1 對(duì)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA），檢驗(yàn)R2、Q2值，得Folding Change值及P值后，篩選差異代謝物（VIP＞1，P＜0.05），使用MetaboAnalyst 5.0 進(jìn)行代謝通路富集分析[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱轉(zhuǎn)化后皂苷的組成

根據(jù)課題組前期研究[4-5]獲得高效液相色譜分析結(jié)果如圖1 所示，熱轉(zhuǎn)化后的皂苷主要由Rg3，Rk1，F(xiàn)4，Rg6，Rg5 和Rh4 等稀有皂苷組成。人參稀有皂苷的含量占熱轉(zhuǎn)化后總皂苷含量的80%以上，熱轉(zhuǎn)化后的總皂苷總含量約為（0.83±0.02 mg/mg），人參稀有皂苷總含量約為（0.76±0.02 mg/mg）。

圖1 熱轉(zhuǎn)化后人參稀有皂苷液相圖Fig.1 Chromatogram of heat-transformed rare ginsenosides

2.2 熱轉(zhuǎn)化后的人參皂苷對(duì)大鼠生理指標(biāo)的影響

對(duì)大鼠進(jìn)行90 d 灌胃實(shí)驗(yàn)后無大鼠死亡，只有高劑量人參稀有皂苷組雌雄大鼠在給藥第一周出現(xiàn)輕度腹瀉和稀便。各組織和器官均未出現(xiàn)異常變色、大小異常、膿液、腫塊形成或其他肉眼可見病變發(fā)展。各組雌雄大鼠絕對(duì)器官重量見表1，人參稀有皂苷給藥組和空白對(duì)照組大鼠的絕對(duì)器官重量無顯著性差異（P＞0.05）。高劑量雌雄大鼠的肝臟絕對(duì)重量略高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖2 所示，肝功能指標(biāo)谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），總蛋白（TP）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測(cè)定結(jié)果顯示，高劑量組雌雄大鼠的AST 水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。然而，TP 和LDL-C 的水平在不同劑量人參稀有皂苷組和空白對(duì)照組之間，無顯著性差異（圖2）。高劑量組雄雌大鼠AST 水平顯著升高，提示肝臟代謝異常。

表1 熱轉(zhuǎn)化后人參皂苷劑量對(duì)雌雄大鼠絕對(duì)臟器重量的影響（g）Table 1 Effect of ginsenoside dosage after thermal transformation on absolute organ weight in male and female rats (g)

圖2 熱轉(zhuǎn)化后人參皂苷劑量對(duì)雌雄大鼠血液生化指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of ginsenoside dosage on blood biochemical indicators in male and female rats after thermal transformation

2.3 肝臟流式細(xì)胞分析

如圖3 所示，每個(gè)圖的右上象限和右下象限之和代表細(xì)胞凋亡率（Q2+Q4）。和對(duì)照組相比，雌雄大鼠高劑量組，中劑量組，低劑量組細(xì)胞凋亡率都有所上升。如圖4 所示，與空白對(duì)照組相比，雌雄大鼠高劑量組肝細(xì)胞凋亡率有極顯著差異（P＜0.01），提示長期攝入高劑量的人參稀有皂苷可能對(duì)雌雄大鼠肝臟造成了一定損傷，促使肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。而雌雄大鼠人參稀有皂苷中、低劑量組肝細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較無顯著差異（P＞0.05）。課題組既往研究表明，人參稀有皂苷更容易通過破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)引起細(xì)胞凋亡[5]，人參稀有皂苷可以與細(xì)胞膜表面的甾醇相連，導(dǎo)致細(xì)胞膜的穿孔和破裂，最終導(dǎo)致生物膜系統(tǒng)的破裂[12]。臨床一線抗腫瘤輔助藥物人參稀有皂苷Rg3（10 mg/kg）和Rh2（80 μmol/L）在低劑量下對(duì)人正常肝細(xì)胞沒有明顯毒性[17-18]。盡管在安全劑量內(nèi)人參皂苷沒有明顯的肝毒性，但過量使用人參皂苷（4000 mg/L）會(huì)抑制正常肝細(xì)胞增殖，引起肝細(xì)胞損傷[19]。本研究中使用的人參稀有皂苷混合物（主要含Rg3，Rk1，F(xiàn)4，Rg6，Rg5 和Rh4 等成分），糖基含量較少，通過細(xì)胞膜的滲透性好，更利于機(jī)體吸收[12]，當(dāng)劑量過高時(shí)會(huì)破壞生物膜系統(tǒng)導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡。中、低劑量組的肝細(xì)胞凋亡率與對(duì)照相比，無顯著差異（P＞0.05），說明中、低劑量組的人參稀有皂苷對(duì)肝細(xì)胞并無明顯的損傷作用。

圖3 雌雄大鼠肝細(xì)胞凋亡圖Fig.3 Hepatic cell apoptosis in male and female rats

圖4 雌雄大鼠肝細(xì)胞凋亡率Fig.4 Hepatocyte apoptotic rate in male and female rats

2.4 肝切片病理學(xué)檢查

用蘇木精-伊紅（HE）對(duì)肝組織進(jìn)行染色，制備常規(guī)石蠟切片。結(jié)果如圖5 所示，與空白對(duì)照組相比，高劑量組的雌雄大鼠均肝索排列紊亂，有炎癥細(xì)胞浸潤并伴有少量空泡；中劑量組的雌雄大鼠有少量炎癥細(xì)胞和空泡；低劑量組肝臟切片顯示肝索排列整齊，從中央靜脈中心呈放射狀排列，未見明顯病理損傷。說明低劑量的人參稀有皂苷對(duì)雌雄大鼠肝臟并未造成明顯病理損傷。

圖5 雌雄大鼠肝臟HE 染色切片（200×，50 μm）Fig.5 HE staining sections of the liver of male and female rats (200×,50 μm)

2.5 代謝組學(xué)研究

2.5.1 差異代謝物有監(jiān)督的判別分析 如圖6 所示的OPLS-DA 模型，對(duì)于雌雄大鼠，空白對(duì)照組與人參稀有皂苷灌胃各組均存在差異，說明不同劑量的人參稀有皂苷對(duì)雄性和雌性大鼠的代謝有一定影響。同一組的點(diǎn)聚集在一起，對(duì)照組雌雄大鼠血液樣本均位于X 軸左側(cè)，而人參稀有皂苷高劑量灌胃組大鼠血液樣本均分散于X 軸右側(cè)。雌性大鼠高劑量灌胃組（圖6A）與對(duì)照組區(qū)分明顯，雄性大鼠不同劑量人參皂苷灌胃組與對(duì)照組區(qū)分明顯（圖6B）。

2.5.2 差異代謝物通路富集分析 主要對(duì)差異明顯的高劑量組雌雄大鼠血清與空白對(duì)照組雌雄大鼠血清進(jìn)行富集分析。雌性大鼠篩選出差異化合物23種，其中11 種差異化合物下調(diào)，12 種差異化合物上調(diào)。雄性大鼠篩選出差異化合物10 種，其中5 種差異化合物下調(diào)，5 種差異化合物上調(diào)。雌雄大鼠血清差異化合物見表2 和表3。將差異代謝物帶入MetaboAnalyst 5.0 進(jìn)行通路富集分析，雌鼠代謝通路中，組氨酸代謝和尿素循環(huán)等代謝途徑改變明顯（圖7A）。雄鼠代謝通路中，α-亞麻酸和亞油酸代謝途徑改變明顯（圖7B）。對(duì)于雌鼠，高劑量的人參稀有皂苷通過提高組氨酸代謝中差異化合物組氨酸的水平，導(dǎo)致氨產(chǎn)量增加，血氨升高，有研究表明高氨血癥會(huì)引發(fā)肝性腦病，導(dǎo)致肝臟受損[20]。同樣人參稀有皂苷提高了尿素循環(huán)代謝中差異化合物谷氨酸和精氨酸的水平，影響了尿素的合成排泄。研究表明，肝臟中尿素的合成是去除氨毒害作用的主要途徑，血氨升高導(dǎo)致尿素循環(huán)障礙，無法將游離的氨合成尿素排出體外，導(dǎo)致肝功能異常[21-22]。高劑量人參稀有皂苷組AST 升高和肝細(xì)胞凋亡率增加，提示人參稀有皂苷改變了上述代謝途徑對(duì)肝臟產(chǎn)生的損傷。對(duì)于雄鼠，人參稀有皂苷提高了差異化合物亞油酸的水平進(jìn)而影響了α-亞麻酸和亞油酸代謝途徑。亞油酸在體內(nèi)會(huì)合成花生四烯酸，而高濃度的花生四烯酸具有致炎性[23-24]，且花生四烯酸在環(huán)氧化酶及脂氧化酶合體催化下產(chǎn)生炎癥因子前列腺素PGE2 和白三烯B4，后者通過破壞細(xì)胞膜穩(wěn)定性，加速細(xì)胞凋亡[25-26]。高劑量組肝臟切片中有炎癥細(xì)胞浸潤伴有少量空泡，這些炎癥因子如前列腺素PGE2 和白三烯B4 可以通過血液吸收進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)引起肝臟輕度損傷[27-28]。綜上，人參稀有皂苷主要影響了組氨酸代謝、尿素循環(huán)、α-亞麻酸和亞油酸等代謝途徑，導(dǎo)致肝臟輕度受損?？紤]到人參稀有皂苷在世界范圍內(nèi)的廣泛使用，不能完全排除其過量食用存在的肝毒性風(fēng)險(xiǎn)，如人參稀有皂苷CK 會(huì)增加血清肝酶水平，促使機(jī)體出現(xiàn)局灶性肝壞死[29-31]。因此，對(duì)熱轉(zhuǎn)化后的人參稀有皂苷混合物進(jìn)行90 d 口服毒性的研究，明確其安全食用劑量，不但可以為人參稀有皂苷的安全制備提供新思路，還可進(jìn)一步擴(kuò)展人參稀有皂苷的應(yīng)用領(lǐng)域。

表2 雌鼠血清差異化合物Table 2 Serum differential compounds in female rats

圖7 雌雄大鼠通路富集分析圖Fig.7 Pathway enrichment analysis plots of male and female rats

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，高劑量熱轉(zhuǎn)化人參皂苷（600 mg/kg）肝細(xì)胞凋亡率極顯著升高（P＜0.01），肝切片有炎癥細(xì)胞浸潤伴有少量空泡；血液中代謝物如組氨酸、谷氨酸、精氨酸和亞油酸的變化影響了組氨酸代謝、尿素循環(huán)和α-亞麻酸和亞油酸等代謝途徑，引發(fā)血氨升高和炎癥因子產(chǎn)生，說明長期高劑量攝入（600 mg/kg）人參稀有皂苷對(duì)肝臟有輕微損傷。本研究結(jié)合非靶向代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)了人參稀有皂苷對(duì)大鼠潛在肝毒性影響因素，由于非靶向代謝組學(xué)定性時(shí)較為困難，也只能相對(duì)定量，結(jié)合篩選出目標(biāo)代謝物，為后續(xù)研究提供了數(shù)據(jù)支持。確定了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中人參稀有皂苷對(duì)雌性和雄性大鼠的未觀察到的肝臟不良反應(yīng)水平均小于200 mg/kg。人參稀有皂苷因其各種有益的特性而具有廣泛的用途。因此，低劑量短期攝入人參稀有皂苷對(duì)機(jī)體是安全的。