郭鵬燕，徐振林，陳子鍵 ，沈 興,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東肇慶 526061）

我國(guó)作為傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)規(guī)模巨大，農(nóng)藥濫用及不合理施用的現(xiàn)象也比比皆是[1]。農(nóng)藥在水、土壤以及農(nóng)作物中的殘留嚴(yán)重威脅了人類(lèi)的生命健康[2-3]。殺螟硫磷作為一種廣譜的有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)劑，因其高效的殺蟲(chóng)性能和低廉的價(jià)格被廣泛地應(yīng)用于蔬菜、水果、谷物等農(nóng)產(chǎn)品的蟲(chóng)害防治[4-5]，其不合理施用導(dǎo)致的農(nóng)藥殘留嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康安全。我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2763-2021 對(duì)殺螟硫磷在谷物、油類(lèi)、蔬菜、水果和肉類(lèi)等食品中的最大殘留限量（MRLs）作出了規(guī)定，以蔬菜水果為例，最大殘留限量均不超過(guò)0.5 mg/kg。近年來(lái)在各地農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè)中，仍常有殺螟硫磷殘留檢出的報(bào)導(dǎo)，例如2017 年一項(xiàng)針對(duì)泉州地區(qū)蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的監(jiān)測(cè)顯示，幾種殘留超標(biāo)的化合物殺螟硫磷、甲拌磷、丙溴磷和水胺硫磷的氣相檢測(cè)值分別為5.85、0.04、1.28、0.062 mg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)標(biāo)規(guī)定的蔬菜中最大殘留限量，其中殺螟硫磷超標(biāo)最為嚴(yán)重[6]。因此，應(yīng)對(duì)殺螟硫磷殘留進(jìn)行監(jiān)測(cè)，找到有效保障人民健康安全，高效、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的檢測(cè)方法。

目前，我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法（GB 23200.113-2018）規(guī)定的殺螟硫磷殘留的檢測(cè)方法是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器分析法[7]，但是其需要繁瑣的前處理、儀器操作相對(duì)復(fù)雜，對(duì)相關(guān)操作人員要求較高，不能滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)?？焖贆z測(cè)[8]。免疫分析方法由于其靈敏度高、特異性好、方便快捷、易操作等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、獸藥殘留等食品安全監(jiān)測(cè)[9-10]。近幾年報(bào)道了很多食品中殺螟硫磷殘留的免疫分析檢測(cè)方法，其中應(yīng)用較多的是單克隆抗體和多克隆抗體[11-14]，但存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高、免疫效果不穩(wěn)定、重復(fù)性較差等問(wèn)題[15]。與傳統(tǒng)抗體相比，基因工程抗體具有制作成本較低、制備周期短、抗體較穩(wěn)定具有更好的實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性，并且可以通過(guò)基因工程的手段對(duì)抗體進(jìn)行改造等諸多優(yōu)勢(shì)[16-17]。納米抗體（Nbs）本質(zhì)上屬于基因工程抗體的一種，相較于傳統(tǒng)抗體衍生來(lái)的Fab、scFv 等基因工程抗體，Nbs 分子極小、結(jié)構(gòu)緊致，具有溶解度好、穩(wěn)定性和親和力高的優(yōu)勢(shì)[18-20]，因而從被發(fā)現(xiàn)以來(lái)迅速地被應(yīng)用于生物制藥、醫(yī)療診斷和食品安全監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，應(yīng)用前景十分廣闊。

目前常用的納米抗體體外表達(dá)體系主要是大腸桿菌和酵母細(xì)胞，其中大腸桿菌是最早用于外源基因表達(dá)的宿主細(xì)胞，也是目前重組蛋白制備最常用的表達(dá)系統(tǒng)，有成熟的操作方法以及各類(lèi)商業(yè)化表達(dá)載體和宿主[21]，具有表達(dá)水平高，操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)成本低、周期短等優(yōu)勢(shì)[22]。Nbs 可以在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)或者通過(guò)信號(hào)肽介導(dǎo)到周質(zhì)腔表達(dá)，后者處于氧化環(huán)境，有利于二硫鍵形成，促進(jìn)Nbs 正確折疊表達(dá)，產(chǎn)生可溶性蛋白[23-24]。但是Nbs 在周質(zhì)腔中的表達(dá)水平較低，往往難以富集，因此需要通過(guò)適宜的表達(dá)與純化策略以達(dá)到高效獲取Nbs 的目的。除了本實(shí)驗(yàn)室的前期研究之外，目前尚未見(jiàn)其他關(guān)于抗殺螟硫磷納米抗體的報(bào)道，而本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的異源表達(dá)體系表達(dá)水平和純度較低，抗體富集較為困難，無(wú)明確的表達(dá)及純化策略用于制備高純度的抗殺螟硫磷納米抗體，制約了其在殺螟硫磷監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用[25-26]。本研究在前期構(gòu)建的一株低表達(dá)水平的抗殺螟硫磷納米抗體工程菌基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化以及對(duì)純化策略進(jìn)行研究，以期高效制備高純度的抗殺螟硫磷納米抗體，并驗(yàn)證其檢測(cè)性能，為納米抗體的制備與相關(guān)免疫檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PINQ-VHH（sm6）質(zhì)粒、殺螟硫磷檢測(cè)抗原 實(shí)驗(yàn)室前期制備；質(zhì)粒小提試劑盒 北京天根生化科技有限公司；表達(dá)菌株BL21（DE3）感受態(tài) 北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨美國(guó)Thermo 公司；瓊脂糖 廣州BioFroxx 公司；卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）廣州華奇盛生物公司；Tris、咪唑、甘氨酸、SDS 廣州Bio-Froxx 公司；PAGE Gel Fast Preparation Kit 上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；Ni SepharoseTM 6 Fast Flow、Hiload Superdex 75 pg 16/600 層析柱 美國(guó)GE Healthcare 公司；DTT 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Protein Marker、DNA Marker 美國(guó)Thermo 公司；ultra GelRed（10000×）南京Vazyme公司；MonoRabTM Rabbit anti-Camelid VHH（HRP）南京金斯瑞科技有限公司；殺螟硫磷標(biāo)準(zhǔn)品 壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；白菜、生菜樣品 購(gòu)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)三角市市場(chǎng)；其他化學(xué)試劑均為分析純。

PowerPac TM 通用電泳儀 美國(guó)Bio-Rad 公司；AKTA pure 蛋白質(zhì)層析系統(tǒng) 美國(guó)GE Healthcare公司；SW-CJ-IF 型凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng)；HZQ-X100 恒溫振蕩培養(yǎng)箱 培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；-80 ℃超低溫冰箱 Panasonic；LRH-150A 型生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠(chǎng)；高壓滅菌鍋 日本Hirayama 公司；Universal Hood II 多功能凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad 公司；Nanodrop 2000c 微量分光光度儀 美國(guó) Thermo 公司；Sorvall Lynx 4000 超高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo 公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國(guó) Thermo 公司；Wellwash MK2 洗板機(jī)上海艾研生物科技有限公司；HH W21-600 電熱恒溫水浴箱 上海悅豐儀器儀表有限公司；SKFG-01電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PINQ-VHH-sm6 質(zhì)粒提取與轉(zhuǎn)化 實(shí)驗(yàn)室前期制備的含有sm6 重組質(zhì)粒的凍存甘油菌[27]，接種到10 mL Kana 抗性L(fǎng)B 液體培養(yǎng)基中活化，用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取完成后用核酸電泳進(jìn)行驗(yàn)證。將1～2 μL 重組質(zhì)粒加入到感受態(tài)中，輕彈混勻后置于冰水浴30 min，接著于42 ℃水浴鍋熱擊90 s，立即冰水浴2 min，取出后加入600～800 μL LB 液體培養(yǎng)基，200 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h。培養(yǎng)后的菌液12000 r/min 離心2 min 棄去大部分上清，留150 μL 進(jìn)行菌體重懸，涂布于LB-Kana 平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h，待長(zhǎng)出單一菌落。

1.2.2 抗殺螟硫磷納米抗體表達(dá)條件優(yōu)化 從轉(zhuǎn)化后的平板上挑取單菌落到10 mL LB-Kana 液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取活化的菌液以1:100 的比例加入到2×YT-Kana 液體培養(yǎng)基，37 ℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，將菌液以每管10 mL 分裝到50 mL 離心管中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)溫度分別選擇37、28、16 ℃，誘導(dǎo)劑IPTG 用量分別采用1、0.7、0.5、0.3、0.1 mmol/L[28]，于250 r/min 振蕩誘導(dǎo)表達(dá)16 h，以探索不同溫度與誘導(dǎo)劑用量下的目的蛋白表達(dá)情況。將培養(yǎng)好的菌液在12000 r/min、4 ℃條件下離心5 min 收集菌體，棄去上清。采用蔗糖滲透壓法提取周質(zhì)蛋白[29]，每管收集菌體中加入70 μL 5×TES，重懸菌體，-80 ℃凍存3 h，取出后加入210 μL 1×TES，室溫解凍重懸菌體，16 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)1 h 后，于12000 r/min、4 ℃條件下離心25 min，收集上清，即為周質(zhì)蛋白。將不同表達(dá)條件下的周質(zhì)蛋白跑SDS-PAGE 電泳驗(yàn)證表達(dá)情況。

1.2.3 抗殺螟硫磷納米抗體純化

1.2.3.1 親和層析純化 采用Ni Sepharose HP 5 mL親和柱對(duì)上一步提取的周質(zhì)蛋白進(jìn)行第一步親和純化，首先使用結(jié)合緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl，pH7.4）進(jìn)行上樣，繼續(xù)沖洗5 個(gè)柱體積后，逐漸提高洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、500 mmol/L 咪唑，pH7.4）的濃度進(jìn)行梯度洗脫，在50 min 內(nèi)洗脫緩沖液的比例從0%增加到100%，對(duì)洗脫峰進(jìn)行收集并用Nanodrop 測(cè)定蛋白濃度，跑SDS-PAGE 電泳對(duì)純化效果進(jìn)行驗(yàn)證。此外，為了提升親和層析的純化效果，同時(shí)采用在結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液中加入1 mmol/L DTT 的策略，探索對(duì)純化效果的影響。

1.2.3.2 凝膠過(guò)濾層析法 采用Superdex 75pg 凝膠柱進(jìn)行第二步純化。將上一步純化得到的蛋白溶液用3000 Da 的超濾管反復(fù)離心濃縮到5 mL，用1.2 個(gè)柱體積的平衡緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl，pH7.4）平衡柱子后進(jìn)行上樣，繼續(xù)沖洗1 個(gè)柱體積，不同分子量大小的蛋白在不同時(shí)間被洗脫下來(lái)，收集全部的洗脫峰進(jìn)行SDSPAGE 電泳驗(yàn)證，用Nanodrop 測(cè)定目的蛋白濃度。

1.2.4 間接ELISA 檢測(cè)方法建立 利用純化得到的抗殺螟硫磷納米抗體建立間接ELISA 方法（indirect competitive enzyme-linked immunesorbent assay,ic-ELISA），對(duì)納米抗體的檢測(cè)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，具體操作步驟如下：用包被液將殺螟硫磷檢測(cè)抗原稀釋至0.5 μg/mL，加入到96 孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，置于37 ℃恒溫水浴鍋中孵育12 h，用PBST洗板后用封閉液封閉3 h。在0.5 μg/mL 包被原條件下，測(cè)定波長(zhǎng)450 nm 處的吸光值在0.8～1.5 之間的抗體濃度作為工作濃度。將50 μL 抗體工作溶液與50 μL 不同濃度殺螟硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液在微孔中混合，37 ℃孵育40 min 后洗板5 次。按照1:5000 的比例用PBST 稀釋anti-VHH HRP 二抗，每孔加入100 μL二抗，37 ℃孵育30 min 后再次洗板5 次。每孔加入100 μL 顯色液37 ℃孵育10 min，用10% H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm 處的吸光值，以B/B0值為縱坐標(biāo)，以殺螟硫磷藥物濃度為橫坐標(biāo)，其中B 為相應(yīng)濃度稀釋的吸收值，B0為空白孔的吸收值，擬合函數(shù)的方程為：

式中，A 是藥物濃度最低時(shí)對(duì)應(yīng)的吸收值；D 是藥物濃度最高時(shí)對(duì)應(yīng)的吸收值；C 是中點(diǎn)濃度，當(dāng)藥物濃度等于C 是吸收值為（A+D）/2，處于曲線(xiàn)的拐點(diǎn)處，對(duì)應(yīng)濃度即為IC50；B 是曲線(xiàn)的陡峭程度，即斜率因子。

1.2.5 實(shí)際樣品檢測(cè) 樣品前處理方法參考GB 23200.113-2018 進(jìn)行：白菜和生菜去除根部，分別打成勻漿，準(zhǔn)確稱(chēng)取勻漿樣品10 g 于50 mL 離心管，加入10 mL 乙腈、4 g 硫酸鎂、1 g 氯化鈉、1 g 檸檬酸鈉、0.5 g 檸檬酸氫二鈉和1 顆陶瓷攪拌子，振蕩渦旋1 min，4200 r/min，離心5 min。吸取6 mL 上清液到15 mL 離心管中，加入885 mg 硫酸鎂、150 mg乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）及15～45 mg 石墨化炭黑（GCB），渦旋混勻1 min，4200 r/min 離心5 min。為了簡(jiǎn)化前處理步驟，樣品提取液不經(jīng)過(guò)氮吹復(fù)溶，用PBS 稀釋至一定倍數(shù)后直接用于ic-ELISA檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)均為3 次平行實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并采用Origin 2018 軟件（美國(guó)OriginLab 公司）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗殺螟硫磷納米抗體誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

提升納米抗體體外表達(dá)水平的方法有很多，如對(duì)基因編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化[30-31]、與分子伴侶（GroES、GroEL、DnaK 等）、折疊酶（PDI、Dsb 家族等）或可溶性蛋白融合表達(dá)[32-33]，以及更換表達(dá)載體或宿主等，而優(yōu)化培養(yǎng)條件是一種最為簡(jiǎn)單且有效的方法，可以通過(guò)低溫誘導(dǎo)、調(diào)整誘導(dǎo)劑濃度或在培養(yǎng)基中加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等方式提高重組蛋白可溶性表達(dá)水平。

本研究以37 ℃、1 mmol/L IPTG 作為初始表達(dá)條件，首先進(jìn)行溫度優(yōu)化，分別在37、28、16 ℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)設(shè)置不加IPTG 的樣品作為對(duì)照，提取周質(zhì)蛋白進(jìn)行電泳驗(yàn)證，結(jié)果如圖1（a）所示。在1 mmol/L IPTG 條件下，目的蛋白表達(dá)量隨著誘導(dǎo)溫度升高而降低，在16 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)提取得到的周質(zhì)可溶性蛋白量最多。與此同時(shí)，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有IPTG誘導(dǎo)的對(duì)照組也能正常表達(dá)，且表達(dá)量較高，說(shuō)明該重組質(zhì)粒存在泄露表達(dá)，因此接著對(duì)誘導(dǎo)劑的濃度進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 抗體表達(dá)條件優(yōu)化Fig.1 Optimization of antibody expression conditions

通過(guò)在16 ℃下對(duì)0～1 mmol/L 濃度范圍的IPTG用量進(jìn)行探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)劑的用量對(duì)于蛋白的表達(dá)量影響并不大，且與無(wú)IPTG 條件下的表達(dá)量接近，因此從節(jié)約成本和簡(jiǎn)化操作的角度考慮，選擇不加誘導(dǎo)劑直接進(jìn)行表達(dá)，并在此條件下重新確定最優(yōu)表達(dá)溫度。結(jié)果與預(yù)想不同，如圖1（c）所示，目的蛋白表達(dá)量隨溫度升高而升高，在37 ℃下表達(dá)量最高，與1 mmol/L IPTG 下的結(jié)果正好相反，說(shuō)明Nbsm6的表達(dá)水平隨溫度的變化趨勢(shì)與IPTG 用量密切相關(guān)，不同的IPTG 含量使得Nbsm6 的表達(dá)水平隨溫度變化呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。高IPTG 條件下，可溶蛋白含量隨溫度的升高而降低；無(wú)IPTG 條件下，可溶蛋白含量隨溫度的升高而增加，同樣在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀(guān)察到的菌體含量也呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。有研究表明IPTG在誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的同時(shí)可能會(huì)具有影響表達(dá)菌生長(zhǎng)的雙重作用，原因在于IPTG 本身的毒性以及異源基因快速誘導(dǎo)表達(dá)消耗了大腸桿菌的營(yíng)養(yǎng)成分，造成了大腸桿菌的代謝負(fù)擔(dān)。此外，重組蛋白活性引起的副反應(yīng)或其底物、產(chǎn)物和中間體的毒性都會(huì)影響菌體生長(zhǎng)[34-35]，因此蛋白的表達(dá)量不會(huì)隨著IPTG 濃度的增加而無(wú)限增加，IPTG 濃度過(guò)高反而形成負(fù)面影響。除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)在高溫條件下，IPTG 對(duì)大腸桿菌的毒性作用更加明顯，其原因可能是高溫條件加速了早期重組蛋白表達(dá)以及半乳糖苷衍生物的積累，加大了對(duì)宿主的毒性以及胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，進(jìn)一步減緩了大腸桿菌生長(zhǎng)[36-37]，最終顯著影響了蛋白表達(dá)水平；而在無(wú)IPTG 時(shí)，由于泄漏表達(dá)可以使重組抗體在較高培養(yǎng)溫度下產(chǎn)量更高。

因此，在對(duì)重組蛋白進(jìn)行表達(dá)制備時(shí)不能忽略IPTG 對(duì)大腸桿菌的負(fù)面作用及其對(duì)不同溫度的響應(yīng)情況，應(yīng)同時(shí)考慮溫度和誘導(dǎo)劑濃度的交互效應(yīng)，以確定最優(yōu)表達(dá)策略，不能只是通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定抗體的最佳表達(dá)條件，應(yīng)該將不同溫度和IPTG 濃度進(jìn)行交叉研究。另外，在對(duì)抗體的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，不能忽略不同因素對(duì)抗體活性的影響，抗體活性的降低將直接影響其檢測(cè)效果。本研究中Nbsm6的表達(dá)最終確定在37 ℃、無(wú)IPTG 條件下進(jìn)行，相較于優(yōu)化前在37 ℃、1 mmol/L IPTG 條件下蛋白表達(dá)量1.565 mg/L，優(yōu)化后蛋白表達(dá)量為6 mg/L，是優(yōu)化前的3 倍以上。

2.2 抗體純化策略?xún)?yōu)化

將提取的周質(zhì)蛋白，采用Ni 親和柱層析方法進(jìn)行第一步純化，純化結(jié)果如圖2（a）所示。親和層析后18 kDa 左右有明顯目的蛋白富集，但依然存在較多雜蛋白，可能是在蛋白質(zhì)濃度過(guò)高時(shí)發(fā)生了聚集[38]，形成多聚體吸附在層析柱上隨單體一起被洗脫下來(lái)，可以通過(guò)改變緩沖液體系、pH、加入還原劑等方法提高純化效果[39]。本研究中采取在親和層析的緩沖溶液中加入1 mmol/L DTT，利用其還原作用破壞雜蛋白的構(gòu)象，減少雜蛋白與鎳柱的結(jié)合能力，從而達(dá)到去除雜蛋白的目的。圖2（b）顯示了緩沖液中含有DTT 的純化效果，可以看出在1 mmol/L DTT 的作用下，大大減少了雜蛋白的結(jié)合，但仍有少量雜蛋白殘留，且分子量較大，因此進(jìn)一步地采用分子篩色譜利用分子量差異去除雜蛋白。結(jié)果如圖3 所示，經(jīng)由分子篩純化后，電泳結(jié)果顯示在18.6 kDa 處得到了條帶非常單一的目的蛋白，確定了兩步法純化方案，所獲得的納米抗體經(jīng)Image J 軟件分析純度達(dá)到98%以上。

圖2 親和純化分離蛋白峰圖及SDS-PAGE 電泳圖Fig.2 Peak diagram of protein isolated by affinity purification and SDS-PAGE electrophoresis

圖3 凝膠過(guò)濾層析分離蛋白峰圖及SDS-PAGE 電泳圖Fig.3 Protein peaks separated by gel filtration chromatography and SDS-PAGE electrophoresis

2.3 間接ELISA 檢測(cè)方法建立

在包被原濃度為0.5 μg/mL，抗體濃度為900 ng時(shí)，在PBS 緩沖溶液中建立抗殺螟硫磷納米抗體的ic-ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果如圖4 所示。優(yōu)化前低表達(dá)抗體檢出限（IC10）為0.8 ng/mL，線(xiàn)性范圍為1.5～10.9 ng/mL[27]；優(yōu)化后抗體所建立的ic-ELISA 方法的IC50為5.81 ng/mL，檢出限（IC10）為0.25 ng/mL，線(xiàn)性范圍為0.78～43.07 ng/mL，相較于優(yōu)化前所建方法在檢出限和檢測(cè)范圍上都有提升。目前已經(jīng)報(bào)道的基于殺螟硫磷單克隆抗體在緩沖體系中建立的ic-ELISA 方法IC50分別是為8.72 ng/mL[11]、120.7 ng/mL[40]，多克隆抗體LOD 為12 ng/mL[12]，基于scFv的ELISA 方法IC50為3.4 ng/mL[41]，本研究經(jīng)表達(dá)和純化優(yōu)化后制備的Nb 所建立的殺螟硫磷ic-ELISA 檢測(cè)方法與目前已經(jīng)報(bào)道的基于單克隆抗體ELISA 檢測(cè)方法相比具有更高的靈敏度，與報(bào)道的基于多克隆抗體和scFv 的ELISA 方法靈敏度相當(dāng)，表明本研究所制備獲得的抗殺螟硫磷納米抗體具有良好的檢測(cè)活性。

圖4 抗殺螟硫磷納米抗體ic-ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 Anti-fenitrothion nanobody ic-ELISA standard curve

2.4 樣品添加回收

經(jīng)過(guò)QuEChERS 凈化后的白菜和生菜樣品提取液，用PBS 稀釋10、20、30 倍后直接用于ic-ELISA檢測(cè)。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（見(jiàn)圖5）分析發(fā)現(xiàn)，兩種蔬菜樣品提取液稀釋20 倍后標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與PBS 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)重合，而稀釋10、30 倍的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與PBS 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)重合度較差，影響樣品中殺螟硫磷的定量檢測(cè)效果。最終確定稀釋20 倍為消除基質(zhì)效應(yīng)的最小稀釋倍數(shù)，其檢測(cè)線(xiàn)性范圍為0.33～46.08 ng/mL，滿(mǎn)足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2021 中規(guī)定的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)。

圖5 基質(zhì)效應(yīng)消除Fig.5 Elimination of matrix effect

在樣品中添加低中高三個(gè)水平的殺螟硫磷標(biāo)準(zhǔn)藥物，采用上述的前處理方法處理樣品，ic-ELISA 檢測(cè)樣品中的殺螟硫磷，結(jié)果如表1 所示，兩種果蔬樣品的回收率在93.3%～111.7%之間，變異系數(shù)（CV）值在2.3%～18.2%之間，說(shuō)明方法準(zhǔn)確性較高，誤差在可接受范圍內(nèi)。

表1 兩種蔬菜樣品添加回收實(shí)驗(yàn)Table 1 Additive recovery experiment of two vegetable samples

3 結(jié)論

本研究通過(guò)優(yōu)化抗殺螟硫磷納米抗體在大腸桿菌表達(dá)體系中的培養(yǎng)條件，增加了重組蛋白在周質(zhì)腔中的可溶性表達(dá)量，建立了獲得高純度抗殺螟硫磷納米抗體的兩步純化法。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，可以成功高效表達(dá)并純化得到高純度抗殺螟硫磷納米抗體，表達(dá)量為6 mg/L，純度達(dá)到98%以上。此外，ic-ELISA 對(duì)純化得到的納米抗體建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行活性鑒定，結(jié)果顯示IC50為5.81 ng/mL，檢出限LOD 為0.25 ng/mL。選擇生菜和白菜樣品進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)，其檢測(cè)線(xiàn)性范圍為0.33～46.08 ng/mL，能夠滿(mǎn)足國(guó)標(biāo)規(guī)定的殺螟硫磷最大殘留限量監(jiān)測(cè)需求，為開(kāi)發(fā)殺螟硫磷快速免疫檢測(cè)方法做了準(zhǔn)備，也為后續(xù)抗殺螟硫磷納米抗體結(jié)構(gòu)、功能及相互作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。此外，研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)溫度過(guò)高時(shí)IPTG 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)表達(dá)水平的影響巨大，不利于宿主菌正常生長(zhǎng)，不利于蛋白質(zhì)可溶表達(dá)；相反溫度較低時(shí)IPTG 誘導(dǎo)劑的用量對(duì)可溶性蛋白的表達(dá)量沒(méi)有太大影響，且誘導(dǎo)劑濃度與誘導(dǎo)溫度對(duì)納米抗體的表達(dá)存在交互效應(yīng)，為之后納米抗體的異源表達(dá)提供了參考。