周桂成，肖 珊，王 波, ，王際輝,

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116034；2.東莞理工學(xué)院生命健康技術(shù)學(xué)院，廣東東莞 523808）

鋅在人體內(nèi)起著維持機(jī)體免疫功能和正常生長(zhǎng)發(fā)育的作用，同時(shí)也是1000 多種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)的輔因子[1]。由于人體內(nèi)沒有有效且可靠的鋅存儲(chǔ)位點(diǎn)，攝入足夠的鋅是維持體內(nèi)鋅平衡的關(guān)鍵[2]。機(jī)體獲取鋅的途徑主要包括日常飲食攝入和口服鋅補(bǔ)充劑兩種形式。然而，膳食鋅在人體的吸收效率較低，食物基質(zhì)中的成分，例如植酸、多酚、皂苷和纖維素等在胃腸中與鋅發(fā)生結(jié)合會(huì)形成難溶的復(fù)合物[3]，阻礙鋅的吸收和利用。同時(shí)，食物中的礦物質(zhì)，如鐵、鈣、銅離子會(huì)競(jìng)爭(zhēng)部分非特定金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體和載體蛋白，抑制機(jī)體對(duì)鋅的吸收。因此，開發(fā)高效補(bǔ)鋅劑對(duì)改善人體鋅營養(yǎng)狀況具有現(xiàn)實(shí)意義。目前，補(bǔ)鋅劑主要分為無機(jī)鋅鹽、有機(jī)弱酸鋅、氨基酸鋅和以肽作為配體的補(bǔ)鋅劑等四類。然而在實(shí)際應(yīng)用中，無機(jī)鹽補(bǔ)鋅劑會(huì)改變食物的理化和感官性質(zhì)，引起人體胃腸道不適[4]；有機(jī)弱酸鋅制備工藝復(fù)雜、且易與其他營養(yǎng)素發(fā)生拮抗，不宜長(zhǎng)期攝入[5]；氨基酸鋅具有良好的穩(wěn)定性，但其鋅含量較低，較難滿足機(jī)體日常需要。目前，以肽作為配體的補(bǔ)鋅劑因其安全可靠、鋅利用率高等優(yōu)點(diǎn)，具有成為高效可靠鋅補(bǔ)充劑的潛力[6]。

酪蛋白是乳中含量最高的蛋白質(zhì)，同時(shí)也是生物活性多肽的重要來源[7-8]。酪蛋白肽能夠與礦物質(zhì)結(jié)合，促進(jìn)微量元素在人體中的高效吸收。近年來，許多學(xué)者利用不同的食源性生物活性肽，如蛋清肽[9]、牡蠣肽[10]、南瓜種子肽[11]等，制備出穩(wěn)定可溶的肽鋅螯合物。然而，肽鋅螯合物在人體內(nèi)的消化和吸收是一個(gè)復(fù)雜的過程，不同的肽鋅螯合物之間由于分子量[12]、電荷性質(zhì)[13]、疏水性[11]、氨基酸組成等差異，其穩(wěn)定性和生物利用率也不同。需要對(duì)更多來源的多肽進(jìn)行開發(fā)，尋找更安全、高效和穩(wěn)定的鋅配體，滿足人們?nèi)粘?duì)鋅的需要。

實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，利用堿性蛋白酶水解酪蛋白得到的多肽具備一定的鋅螯合能力，但是其肽鋅螯合物的胃腸消化穩(wěn)定性較低。在此基礎(chǔ)上，利用乳酸菌發(fā)酵對(duì)酶解法進(jìn)行進(jìn)一步補(bǔ)充[14]，制備了更多潛在的、具備優(yōu)異鋅螯合特性和消化穩(wěn)定性的多肽。本研究利用酪蛋白為原料，通過堿性蛋白酶酶解與乳酸菌發(fā)酵結(jié)合的方式獲得具有高效鋅螯合能力的多肽，與七水合硫酸鋅反應(yīng)制備肽鋅螯合物，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征；通過模擬體外消化，探討酪蛋白肽鋅螯合物在消化過程中的鋅溶解性和抗氧化性的變化，對(duì)胃腸消化產(chǎn)物進(jìn)行圓二色譜測(cè)定，分析肽鋅螯合物在消化過程中的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。為推動(dòng)酪蛋白肽的利用與酪蛋白肽鋅螯合物的開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MRS 肉湯培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；酪蛋白 生物試劑級(jí)、七水合硫酸鋅 分析純，上海源葉生物科技有限公司；堿性蛋白酶（1:200000）北京索萊寶生物科技有限公司；4-(2-pyridylazo) resorcinol（PAR）、HEPES-KOH 緩沖液（pH7.9）、硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、鄰苯二甲醛、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、谷胱甘肽（GSH）、4,4'-二（1H-1,2,4-三 唑-1-基）-1,1'-聯(lián) 苯（TPTZ）均為分析純，上海阿拉丁公司；胃蛋白酶P7000、胰液素P1750 美國Sigma 公司；血鋅濃度試劑盒 南京建成科技有限公司；鄰苯二甲醛、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）分析純，上海麥克林生物科技有限公司；其他試劑均為分析純；所有實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水；植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) LPA 和LPB 是實(shí)驗(yàn)室先前從西蘭花中篩選得到的兩株具有高發(fā)酵能力的乳酸菌；Caco-2 細(xì)胞 中國科學(xué)院。

Chiracan V100 圓二色光譜儀 英國Applied Photophysics 公司；Nicolet IS50 顯微紅外光譜系統(tǒng)、Easy-nano 1200 色譜儀器、Q Exactive Plus 質(zhì)譜儀器、EVOLUTION 220 紫外可見光譜儀 美國Thermo公司；F7100 熒光光譜儀 日本日立公司；Spark 多功能微孔板檢測(cè)儀 瑞士Tecan 公司；EM-30 Plus超高分辨率掃描電鏡 韓國Coxem 公司；ZS90 馬爾文納米激光粒度儀 英國馬爾文帕納科公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)及鋅螯合肽的制備 植物乳酸菌LPA 和LPB 在MRS 培養(yǎng)基上37 ℃連續(xù)培養(yǎng)（3 代×24 h）。6000×g 下離心5 min，使菌種懸浮在無菌鹽水（0.9%）中。在20 mL 酪蛋白培養(yǎng)基（5%，w/v）中加入0.15%的堿性蛋白酶，酶解2 h，調(diào)節(jié)pH 至6.5，按3%的接種量（v/v）加入植物乳酸菌，在37 ℃條件下發(fā)酵12 h。然后，對(duì)不同的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，固定發(fā)酵條件為酶解pH7、堿性蛋白酶添加量0.15%，以不同發(fā)酵時(shí)間（6、8、10、12、14、16 h）分別進(jìn)行酶解與發(fā)酵；固定發(fā)酵條件為酶解pH 為7、發(fā)酵時(shí)間為12 h 以不同堿性蛋白酶添加量（0、0.15%、0.30%、0.45%、0.60%、0.75%）分別進(jìn)行酶解與發(fā)酵；固定發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間為12 h、0.30%堿性蛋白酶添加量，以不同初始的酶解pH（5、6、7、8、9、10）分別進(jìn)行酶解與發(fā)酵。發(fā)酵產(chǎn)物用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH 至4.6，在6000×g，4 ℃條件下離心10 min，取上清液，用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.0，離心收集上清液冷凍干燥并儲(chǔ)存在-80 ℃中備用。

1.2.2 鋅螯合能力測(cè)定 根據(jù)Zhu 等[15]的方法，將1.2.1 中得到的發(fā)酵產(chǎn)物在40 mmol/L HEPESKOH 緩沖液（pH7.5）中重新溶解，與ZnSO4·7H2O（250 μmol/L）以49:1 的比例充分混合，在37 ℃水浴中反應(yīng)10 min。然后加入200 μL 2 mmol/L 4-（2-pyridylazo）resorcinol（PAR），以HEPES-KOH 緩沖液為空白，在波長(zhǎng)500 nm 下測(cè)定吸光值。鋅螯合率計(jì)算公式為：

1.2.3 多肽含量的測(cè)定 多肽含量的測(cè)定參考Spellman 等[16]的方法，將100 mL 硼酸鈉（0.1 mol/L）和10 mL 20%（w/v）十二烷基硫酸鈉混合均勻，攪拌至沉淀消失。取160 mg 鄰苯二甲醛溶于4 mL 乙醇，轉(zhuǎn)移到上述溶液中。加入400 μL 巰基乙醇，用去離子水定容至200 mL。取200 μL 1.2.1 中得到的發(fā)酵產(chǎn)物與3 mL 鄰苯二甲醛工作液充分混勻，室溫下避光孵育2 min，測(cè)量340 nm 處的吸光值。取不同濃度的DL-絲氨酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品結(jié)果以每克樣品的絲氨酸毫克當(dāng)量表示。

1.2.4 肽鋅螯合物的制備 10 mL 酪蛋白肽（10 mg/mL）與硫酸鋅（鋅螯合肽:硫酸鋅質(zhì)量比為1:1）混合，將反應(yīng)混合物的pH 調(diào)節(jié)至6.0，50 ℃條件下反應(yīng)1 h，隨后將混合物轉(zhuǎn)移到冰水浴中迅速冷卻，加入無水乙醇（1:4，v/v）并靜置，在8000 r/min 條件下離心10 min，收集沉淀冷凍干燥得到肽鋅螯合物。

1.2.5 掃描電鏡 取一定量的酪蛋白肽及肽鋅螯合物粉末于感電膠上，進(jìn)行噴金處理后，利用COXEM掃描電鏡進(jìn)行觀察，其中，加速電壓為3 kV，放大倍數(shù)為：×1.0 k。

1.2.6 紅外光譜 使用Nicolet IS50 顯微紅外光譜系統(tǒng)，在4000～675 cm-1范圍內(nèi)對(duì)酪蛋白肽及肽鋅螯合物凍干粉進(jìn)行掃描，選擇模式為透射模式，采用冷卻后檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 Zeta 電位測(cè)定 將酪蛋白肽和肽鋅螯合物溶于去離子水，配制成1 mg/mL 溶液，平衡120 s，采用馬爾文激光粒度儀測(cè)定Zeta 電位。

1.2.8 熒光光譜 使用日立公司的F-7100 熒光分光光度計(jì)，對(duì)酪蛋白肽螯合鋅離子后的熒光特性進(jìn)行分析。在酪蛋白肽溶液（5 mg/mL）中加入不同濃度（1、2、4、6、8 和10 mmol/L）的硫酸鋅溶液反應(yīng)30 min。采用掃描模式，在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm 和發(fā)射波長(zhǎng)為300～500 nm 的條件下進(jìn)行掃描。

1.2.9 抗氧化性測(cè)定

1.2.9.1 DPPH 自由基清除率 根據(jù)文獻(xiàn)[17]報(bào)道的方法，取一定量酪蛋白肽及肽鋅螯合物溶于去離子水，配制成不同濃度溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL），取2 mL 0.1 mmol/L DPPH 溶液與樣品溶液充分混合，于517 nm 處測(cè)吸光值。以還原型谷胱甘肽作為陽性對(duì)照。取2 mL 95% 乙醇和2 mL 樣品混合反應(yīng)作為對(duì)照組，取2 mL 95%乙醇樣品和2 mL DPPH 溶液混合反應(yīng)作為空白組，對(duì)DPPH 自由基的清除率用以下公式計(jì)算：

1.2.9.2 ABTS+自由基清除率 根據(jù)文獻(xiàn)[18]報(bào)道的方法，將ABTS 溶液（7 mmol/L）和過硫酸鉀溶液（2.45 mmol/L）混合，在室溫避光放置16 h，得到ABTS 母液。隨后對(duì)ABTS 母液稀釋，使其在734 nm處的吸光值為0.70±0.02。將0.5 mL 不同濃度（0.02、0.04、0.06、0.08 和0.10 mg/mL）的樣品溶液和3 mL的ABTS 稀釋液混合，在室溫避光反應(yīng)5 min。然后測(cè)量734 nm 處的吸光值。以還原型谷胱甘肽作為陽性對(duì)照，空白組用去離子水代替樣品。ABTS+自由基清除率計(jì)算如下：

1.2.9.3 鐵還原力的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[19]報(bào)道的方法，將30 mL TPTZ 溶液（10 mmol/L）與30 mL FeCl3溶液（20 mmol/L）充分混合，加入300 mL 醋酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH3.6）進(jìn)行稀釋得到TPTZ 工作液。將100 μL 不同濃度樣品溶液（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL）與 3 mL TPTZ 工作液在 37 ℃下混合30 min，在593 nm 處測(cè)量吸光值。以不同濃度Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以還原型谷胱甘肽作為陽性對(duì)照，結(jié)果表示為 Trolox 當(dāng)量（mmol Trolox/L）。

1.2.10 模擬胃腸道消化 將肽鋅螯合物、硫酸鋅分別溶解于去離子水（1 mg/mL）中，調(diào)節(jié)pH 至2.0，37 ℃孵育5 min 后，按1:35（w/w）的酶底物比加入胃蛋白酶（≥250 units/mg solid）消化2 h。胃消化完成后，用飽和NaHCO3調(diào)pH 至6.8，1:25（w/w）加入胰酶（4×USP），繼續(xù)用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)至pH7.5后消化2 h。分別在體外消化0、15、30、60、120、135、150、180 和240 min 時(shí)取一定量樣品，沸水浴10 min 滅酶后進(jìn)行測(cè)試。抗氧化活性的測(cè)定按照1.2.9的方法進(jìn)行。根據(jù)Xie 等[20]的方法計(jì)算抗氧化活性殘留率，抗氧化活性殘留率表示為：

1.2.11 鋅溶解度測(cè)定 取等量不同消化時(shí)間的胃腸道消化液在8000×g 下離心10 min。收集上清液，根據(jù)血鋅濃度試劑盒的方法測(cè)定鋅含量。肽鋅螯合物總鋅含量測(cè)定，取50 mg 肽鋅螯合物溶解在6 mol/L鹽酸中，120 ℃消化4 h，真空干燥除去其中的鹽酸，用去離子水定容到5 mL，利用血鋅濃度試劑盒的方法測(cè)定鋅含量。鋅的溶解度計(jì)算如下：

1.2.12 圓二色光譜 酪蛋白肽及肽鋅螯合物溶于去離子水（0.25 mg/mL）中，然后用圓二色譜儀（CD）在190～260 nm 之間進(jìn)行掃描，使用以下儀器參數(shù)：帶寬1.0 nm，掃描速度100 nm/min。每個(gè)獲取的光譜代表平均三次連續(xù)掃描。采用CDNN 軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

1.2.13 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[21]報(bào)道的方法，取1.2.10 中的消化樣品溶于含10%血清的DMEM培養(yǎng)基中。待Caco-2 細(xì)胞融合度達(dá)到約80%后，棄去培養(yǎng)基，用PBS 洗滌Caco-2 細(xì)胞兩次后利用胰酶進(jìn)行消化得到細(xì)胞懸液。將細(xì)胞以2.5×104個(gè)/孔的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h 后棄去培養(yǎng)基，每孔分別加入200 μL 不同濃度酪蛋白肽和肽鋅螯合物胃腸消化產(chǎn)物（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 和0.50 mg/mL），每個(gè)樣品設(shè)置6 個(gè)平行孔。繼續(xù)孵育24 h 后棄去樣品，每孔加入100 μL 5 mg/mL MTT。孵育4 h 后棄去MTT，每孔加入200 μL 二甲基亞砜，細(xì)胞培養(yǎng)板低速搖動(dòng)10 min。用酶標(biāo)儀在570 nm 處測(cè)定吸光值。以含培養(yǎng)基而不含細(xì)胞組作為空白組，以等量含10%血清的DMEM 培養(yǎng)基代替樣品組作為對(duì)照組，細(xì)胞存活率計(jì)算如下：

1.2.14 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析

1.2.1 4.1 樣品準(zhǔn)備 將1.2.4 中得到的酪蛋白肽與肽鋅螯合物以1 mg/mL 濃度在去離子水中溶解并進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

1.2.1 4.2 液相色譜條件 分離柱：75 μm×200 mm（C18，1.9 μm 粒徑，120 ?孔徑）；色譜分離時(shí)間：60 min，A：0.1% 甲酸水溶液，B：80%乙腈；流速：200 nL/min，

梯度洗脫梯度：在0～45 min 內(nèi)，B：3%～32%；在45～55 min 內(nèi)，B：32%～100%；在55～60 min 內(nèi)，B：100%～100%。

1.2.1 4.3 質(zhì)譜條件 掃描范圍200～2000 Da；分辨率70000；最大離子注入時(shí)間100 ms；MS/MS 離子注入時(shí)間75 ms。

1.2.1 4.4 數(shù)據(jù)分析 使用ProteinDiscovery 2.4.0（美國Thermo Scientific 公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?；赨ni-Prot 數(shù)據(jù)庫，得到準(zhǔn)確的多肽分子量和氨基酸序列。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)至少測(cè)定三次，計(jì)算平均值和誤差值，并采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，用Origin 2018 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化

利用實(shí)驗(yàn)室篩選的兩株具有高發(fā)酵能力的植物乳桿菌對(duì)酪蛋白進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖1 所示，通過堿性蛋白酶預(yù)處理與植物乳桿菌發(fā)酵相結(jié)合的方式獲取的酪蛋白肽對(duì)鋅離子的螯合率分別為17.63%±0.83%和15.17%±0.81%，均高于其單菌發(fā)酵組（12.07%±0.53%和13.63%±0.13%）或單酶處理組（8.69%±0.53%）。堿性蛋白酶與植物乳桿菌LPA 共同作用制備的酪蛋白肽具有更優(yōu)的鋅螯合能力。在植物乳桿菌的作用下，酪蛋白更容易被水解釋放出大量的生物活性肽[22]；利用堿性蛋白酶預(yù)酶解，有利于縮短發(fā)酵的過程[23]，減少發(fā)酵過程中被污染的可能性。因此，選擇堿性蛋白酶與植物乳桿菌LPA 的發(fā)酵組合對(duì)后續(xù)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 不同制備條件對(duì)酪蛋白肽鋅螯合率及多肽含量的影響Fig.1 Effect of different preparation conditions on zinc chelation rate and peptide content of casein peptides

如圖1B 所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，酪蛋白肽對(duì)鋅的螯合率下降。發(fā)酵初始階段，酪蛋白肽水解程度較低，較長(zhǎng)的肽段可能更有利于鋅離子的結(jié)合。在8～12 h 階段酪蛋白肽的多肽含量和鋅螯合能力逐漸增加，在12 h 時(shí)酪蛋白肽的鋅螯合能力達(dá)到最高，為18.36%±0.55%。在這一階段，多肽在微生物作用下釋放出更多能結(jié)合Zn2+的活性基團(tuán)。隨著水解程度的增加，部分鋅螯合位點(diǎn)被破壞，水解產(chǎn)物的鋅螯合率逐漸降低[24]。對(duì)不同酶添加量下酪蛋白發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析，酶處理組多肽含量與鋅螯合率均高于無酶組，酶的加入促進(jìn)了鋅螯合多肽的形成。在堿性蛋白酶的作用下，酪蛋白肽部分關(guān)鍵位點(diǎn)被暴露出來，無酶組中難以利用的部分變得可以利用[25]。在酶加入量為0.3%時(shí)，酪蛋白肽鋅螯合率達(dá)到最高（25.16%±1.74%）。對(duì)不同酶解初始pH 下酪蛋白發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析，在酶解初始pH 為9 時(shí)，酪蛋白肽具有最高的鋅螯合能力31.41%±0.97%。堿性條件有利于酪蛋白的酶解并為后續(xù)發(fā)酵階段提供更多的水解產(chǎn)物[26]，提高乳酸菌對(duì)酪蛋白的利用率。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，確定最優(yōu)的發(fā)酵組合為乳酸桿菌A 與堿性蛋白酶共同發(fā)酵，最佳的發(fā)酵條件為酶解pH9、堿性蛋白酶添加量為0.3%（w/v）、乳酸菌發(fā)酵時(shí)間為12 h 并以此作為后續(xù)制備酪蛋白肽的發(fā)酵條件。

2.2 肽鋅螯合物結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 掃描電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡（SEM）是觀察多肽形貌特征的有效工具。圖2A 和圖2B 分別顯示了酪蛋白肽和酪蛋白肽鋅螯合物的表面形態(tài)。酪蛋白肽顯示出表面光滑的片狀，與鋅螯合后呈粗糙疏松顆粒狀結(jié)構(gòu)，與Zhang 等[27]觀察到的現(xiàn)象相似。肽鋅螯合物在形成過程中，微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，鋅的存在破壞了多肽表面原本致密的結(jié)構(gòu)，酪蛋白肽的空間構(gòu)象發(fā)生改變并重新排列[11]，形成更疏松的結(jié)構(gòu)。同時(shí)，多肽氨基酸殘基上部分親水基團(tuán)被Zn2+屏蔽[28]，使多肽趨向于聚集狀態(tài)。因此，鋅離子的螯合顯著改變了酪蛋白肽的微觀結(jié)構(gòu)。

圖2 酪蛋白肽和肽鋅螯合物SEM 圖（×1.0 k）Fig.2 SEM images of casein peptide and peptide-zinc chelate(×1.0 k)

2.2.2 傅里葉變換紅外光譜 酪蛋白肽在1400.66、1556.00、1648.41、2954.03 和3284.54 cm-1的紅外范圍內(nèi)出現(xiàn)了紅外峰，分別對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的酰胺III、II、I 和酰胺B 和A 帶。如圖3 所示，Zn2+加入后，多肽的紅外光譜發(fā)生了顯著變化。肽鋅螯合物的NH 帶出現(xiàn)在3254.50 cm-1處，可能是Zn2+的加入引起-NH 伸縮振動(dòng)和氫鍵的取代[28]。在2939.29 cm-1處有一個(gè)肽鋅螯合物-CH2基團(tuán)的伸縮振動(dòng)。在添加Zn2+之后，酪蛋白肽1648.41 和1556.00 cm-1處的峰移至較低的頻率（1641.04 和1535.59 cm-1），表明Zn2+與NH 發(fā)生了結(jié)合[29]。在1400.66 cm-1處觀察到酰胺III 帶的變化，這是由C-N 伸縮振動(dòng)、NH 變形和-CH2基團(tuán)的振動(dòng)形成的[27,30]。肽鋅螯合物在978.30 cm-1處的峰消失，Zn2+的作用可能會(huì)導(dǎo)致一些較弱的吸收帶被屏蔽[15]。推測(cè)酪蛋白肽主要通過多肽鍵上的羧基氧、羥基氧、氨基參與Zn2+的配位形成多肽鋅螯合物。Zn2+與酪蛋白肽螯合并引起多肽結(jié)構(gòu)的改變。

圖3 酪蛋白肽和肽鋅螯合物FTIR 圖Fig.3 FIRT diagram of casein peptide and peptide-zinc chelate

2.2.3 Zeta 電位分析 酪蛋白肽和肽鋅螯合物的Zeta 電位如圖4 所示。Zeta 電位是反映分散體系中粒子的表面電荷狀態(tài)的重要指標(biāo)。酪蛋白肽的Zeta 電位為-12.76±0.46 mV，在與鋅離子螯合后，肽鋅螯合物的Zeta 電位為-6.84±0.67 mV，發(fā)生了極顯著變化（P＜0.001），Zn2+的加入導(dǎo)致了酪蛋白肽Zeta電位值上升。

2.2.4 熒光光譜分析 如圖5 所示，當(dāng)熒光激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm 時(shí)，觀察到酪蛋白肽在356 nm 處出現(xiàn)吸收峰，隨著Zn2+濃度的增加（1、2、4、6、8、10 mmol/L），酪蛋白肽熒光吸收峰強(qiáng)度逐漸降低且當(dāng)Zn2+濃度超過4 mmol/L 時(shí)，熒光猝滅幅度減弱。在引入Zn2+后，多肽的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊[31]，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降。同時(shí)，隨著Zn2+濃度增加，酪蛋白肽的熒光猝滅幅度逐漸減弱。這可能是在螯合過程中，酪蛋白肽對(duì)Zn2+的螯合逐漸達(dá)到飽和[32]，酪蛋白肽的結(jié)構(gòu)變化減緩。因此，Zn2+能與酪蛋白肽上的活性基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合并形成可溶性肽鋅螯合物。同時(shí)，酪蛋白肽的Zn2+結(jié)合位點(diǎn)是有限的。

圖5 不同濃度的Zn2+肽鋅螯合物的熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of peptide-zinc chelate at different concentrations of Zn2+

2.2.5 肽鋅螯合物體外抗氧化性 多肽的金屬結(jié)合活性與抗氧化能力相關(guān)[33]，與金屬離子結(jié)合后，多肽的抗氧化活性降低。本研究通過測(cè)定DPPH 的自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和鐵離子還原能力，全面系統(tǒng)地對(duì)肽鋅螯合物的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。如圖6A 所示，酪蛋白肽對(duì)DPPH 自由基的清除能力表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，在濃度為2.5 mg/mL時(shí)增加到69.51%±0.82%。同一濃度下肽鋅螯合物的DPPH 自由基的清除能力為45.55%±0.66%。在與鋅螯合后，酪蛋白肽仍然保留著一定的抗氧化能力。

圖6 酪蛋白肽和肽鋅螯合物抗氧化性測(cè)定Fig.6 Determination of antioxidant properties of casein peptide and peptide-zinc chelate

同時(shí)，酪蛋白肽和肽鋅螯合物都顯示出ABTS+自由基清除能力。如圖6B 所示，在0.02～0.10 mg/mL濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增加，酪蛋白肽和肽鋅螯合物的ABTS+自由基清除能力逐漸提高，且在0.10 mg/mL時(shí)酪蛋白肽對(duì)ABTS+自由基清除能力達(dá)到57.90%±0.78%，肽鋅螯合物對(duì)ABTS+自由基清除能力則為21.68%±1.64%。對(duì)其鐵離子還原能力進(jìn)行對(duì)比，在濃度為5 mg/mL 時(shí)，酪蛋白肽和肽鋅螯合物的鐵離子還原能力分別為0.256±0.003 μmol Trolox/mL 和0.10±0.005 μmol Trolox/mL。相同濃度條件下，酪蛋白肽具有更好的抗氧化活性，鋅的加入導(dǎo)致多肽發(fā)生聚集，在一定程度上阻礙了多肽的活性部位，肽鋅螯合物的抗氧化活性降低。

2.3 肽鋅螯合物體外模擬消化

對(duì)體外模擬消化過程中肽鋅螯合物鋅的溶解度及其抗氧化活性殘留率進(jìn)行研究。結(jié)果如圖7 所示。在胃消化階段，肽鋅螯合物與硫酸鋅的溶解度都在85%以上。進(jìn)入腸道消化階段后，兩者溶解度出現(xiàn)了極顯著（P＜0.001）差異，硫酸鋅的溶解度下降至2.67%±1.50%，這可能是腸消化階段偏弱堿性的pH環(huán)境導(dǎo)致Zn2+解離并形成沉淀[34]。而肽鋅螯合物鋅溶解度在120 min 時(shí)仍然在54.25%±1.20%，并隨著消化的進(jìn)行最終穩(wěn)定在43.06%±2.15%。對(duì)于腸吸收而言，大多數(shù)礦物質(zhì)的生物利用率主要取決于它的溶解度。以肽作為配體的鋅補(bǔ)充劑，有利于維持鋅在胃腸道消化中的溶解度[35]。在本研究中，利用堿性蛋白酶與植物乳桿菌LPA 共同作用制備酪蛋白肽，其肽鋅螯合物在胃腸道消化階段具有很好的溶解性，這對(duì)于人體腸道對(duì)鋅的吸收是有利的。

圖7 消化過程中肽鋅螯合物和硫酸鋅中鋅離子溶解率（A）和酪蛋白肽鋅螯合物抗氧化活性殘留率（B）Fig.7 Rate of zinc dissolution of peptide-zinc chelate and zinc sulfate during digestion (A) and remaining ratios of antioxidant activity of casein peptide-zinc chelate (B)

如圖7B 所示，在消化過程中，酪蛋白肽和肽鋅螯合物的抗氧化活性逐漸增強(qiáng)。酪蛋白肽的ABTS+自由基清除能力在胃消化階段增加了26.19%±1.68%，在腸消化階段增加了69.05%±6.23%；DPPH 自由基清除能力在胃消化階段時(shí)增加5.35%±3.58%，腸消化階段時(shí)增加21.34%±4.53%，而肽鋅螯合物的DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力在胃消化階段時(shí)分別增加了11.72%±2.95%和39.25%±3.24%，在腸消化階段則增加了26.19%±3.30%和71.96%±7.06%。在胃蛋白酶和胰酶作用下，酪蛋白肽會(huì)進(jìn)一步被水解為更小的片段，抗氧化活性也隨之改變[36]。消化過程中肽鋅螯合物的抗氧化能力極顯著提高（P＜0.001），這可能與肽鋅螯合物結(jié)構(gòu)的變化相關(guān)，胃腸消化環(huán)境有利于其抗氧化能力的重新釋放。

然而，酪蛋白肽和肽鋅螯合物的鐵還原力在消化過程中有所下降，在胃消化階段酪蛋白肽鐵還原力抗氧化活性殘留率為82.76%±1.49%，低于肽鋅螯合物的鐵還原力抗氧化活性殘留率（89.70%±2.69%）。在腸消化階段，兩者的鐵還原力抗氧化活性殘留率分別下降了43.95%±0.59%和36.26%±2.80%。這可能是胃腸消化過程中部分疏水性氨基酸失去活性，導(dǎo)致酪蛋白肽和肽鋅螯合物的鐵還原力下降[27]。

2.4 肽鋅螯合物二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

對(duì)Zn2+螯合前后多肽的圓二特性變化進(jìn)行分析，研究酪蛋白肽與鋅螯合過程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[37]。結(jié)果如圖8 所示，酪蛋白肽和肽鋅螯合物在198 nm處均出現(xiàn)最小值。與鋅螯合后，肽鋅螯合物的圓二光譜峰減弱。通過CDNN 軟件對(duì)肽鋅螯合物二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，計(jì)算出酪蛋白肽的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無規(guī)則卷曲含量分別為5.6%、19.5%、39.9%和34.2%，在螯合后分別變?yōu)?.9%、18.1%、46.3%和31.5%。結(jié)果表明，在Zn2+作用下部分β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)化為β-折疊。Zn2+的加入有利于誘導(dǎo)肽鋅螯合物折疊結(jié)構(gòu)的形成。在消化過程中，酪蛋白肽和肽鋅螯合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。簡(jiǎn)單來說，酪蛋白肽和肽鋅螯合物的β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)減少，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)在消化結(jié)束后分別降低了2.1%和0.9%，這可能與β-轉(zhuǎn)角在消化過程中的降解有關(guān)[36]。在胃消化階段，肽鋅螯合物的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)減少，無規(guī)則卷曲的變化幅度（1.1%）小于酪蛋白肽無規(guī)則卷曲的幅度（2.7%），酪蛋白肽和肽鋅螯合物的β-折疊的含量分別增加到46.4%和49.2%。受胃消化環(huán)境的影響，H+與Zn2+會(huì)競(jìng)爭(zhēng)給電子基，導(dǎo)致肽鋅螯合物中的鋅發(fā)生部分解離[37]，然而本研究中多肽有序的結(jié)構(gòu)卻被保留了下來。在腸道消化階段，β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加，說明消化過程中肽鋅螯合物結(jié)構(gòu)變得更加致密有序。與酪蛋白肽相比，肽鋅螯合物在胃腸道消化過程中的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化幅度較小，Zn2+的加入在一定程度上維持了在消化過程中多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖8 酪蛋白肽和肽鋅螯合物圓二色譜Fig.8 Circular dichroism of casein peptide and peptide zinc chelate

2.5 酪蛋白肽及肽鋅螯合物消化產(chǎn)物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

如圖9 所示，在0.05～0.50 mg/mL 范圍內(nèi)，酪蛋白肽胃腸消化產(chǎn)物對(duì)Caco-2 細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。肽鋅螯合物胃腸消化產(chǎn)物在低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞有增殖活性，在濃度為0.05 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率為130.02%±3.42%；當(dāng)濃度超過0.4 mg/mL 后，Caco-2細(xì)胞活力降低，在0.5 mg/mL 時(shí)僅為40.91%±1.05%。倒置顯微鏡下對(duì)Caco-2 細(xì)胞進(jìn)行觀察（圖10），當(dāng)肽鋅螯合物胃腸消化產(chǎn)物達(dá)到一定濃度后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞數(shù)目減少。許多研究表明，鋅與細(xì)胞的凋亡相關(guān)[38]，當(dāng)外源鋅環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，細(xì)胞氧化應(yīng)激也會(huì)發(fā)生改變、生長(zhǎng)受到抑制[39]。

圖9 不同濃度的酪蛋白肽和肽鋅螯合物胃腸消化產(chǎn)物對(duì)Caco-2 細(xì)胞存活率的影響Fig.9 Effects of casein peptides gastrointestinal digestion and zinc-peptide chelates gastrointestinal digestion products at different concentrations on the viability of Caco-2 cells

圖10 不同濃度肽鋅螯合物胃腸消化產(chǎn)物對(duì)Caco-2 細(xì)胞的影響Fig.10 Effects of zinc-peptide chelates gastrointestinal digestion products with different concentration on Caco-2 cells

2.6 鋅螯合肽的鑒定

利用質(zhì)譜對(duì)酪蛋白水解物和肽鋅螯合物進(jìn)行鑒定，鑒定出來自牛源的多肽分別為15 種和13 種，氨基酸序列如表1 所示，鑒定得到的肽分子量均小于3000 Da。有研究報(bào)道[40]，低分子量肽（＜3000 Da）和高分子量肽（＞10000 Da）的金屬螯合能力相對(duì)較高。此外，也有研究表明，Zn2+與食源性多肽C 端羧基、N 端氨基、羰基、酰胺鍵以及氨基酸Asp、Glu、Cys 和His 等通過共價(jià)鍵或靜電作用進(jìn)行螯合物[41]，Gln 和Lys 是促進(jìn)金屬螯合的重要部位。Ser 的側(cè)鏈羥基被認(rèn)為在多肽鋅的螯合中起著重要的作用[42]，Cys 的巰基，Lys 的羧酸基、多肽亞氨基（NH）和羰基（C=O）可以參與鋅的配位[43]。Glu 殘基的側(cè)鏈羧酸基也是鋅結(jié)合的重要位點(diǎn)[11]。本研究中鑒定的多肽序列中包含許多能對(duì)鋅螯合起重要貢獻(xiàn)的氨基酸。

表1 酪蛋白水解物和肽鋅螯合物的多肽序列Table 1 Sequences of peptides identified by casein hydrolysate and peptide-zinc chelates

另一方面，部分氨基酸對(duì)鋅的螯合能力較弱，但是在肽鋅螯合物的穩(wěn)定性、溶解性和空間構(gòu)象等方面具有重要作用，需要進(jìn)一步確定其對(duì)肽鋅螯合物在胃腸道內(nèi)的消化穩(wěn)定性及經(jīng)腸道吸收后肽鋅螯合物生物利用率的貢獻(xiàn)。后續(xù)工作將對(duì)鑒定出來的多肽序列進(jìn)行篩選，探究肽鋅螯合物在消化過程中的穩(wěn)定性和跨小腸吸收機(jī)制。

3 結(jié)論

本研究利用堿性蛋白酶對(duì)酪蛋白進(jìn)行預(yù)處理，通過乳酸菌發(fā)酵獲得鋅螯合多肽并與硫酸鋅反應(yīng)制備肽鋅螯合物，獲得多肽的鋅螯合率為31.41%±0.97%。酪蛋白肽中的羧基氧、羥基氧、氨基參與了Zn2+的配位。在模擬胃腸消化過程中，肽鋅螯合物的抗氧化能力隨消化時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，其中鋅離子溶解性優(yōu)于硫酸鋅。隨著消化過程進(jìn)行，肽鋅螯合物變得更為有序，Zn2+在一定程度上維持了酪蛋白肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。然而，當(dāng)濃度達(dá)到0.4 mg/mL 以上時(shí)，肽鋅螯合物會(huì)改變細(xì)胞形態(tài)，影響細(xì)胞增殖并表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性。研究結(jié)果為高效安全的酪蛋白肽鋅補(bǔ)充劑的制備和應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。