王琪琦，黃忠連，王 莉，董 捷，林 珣，張根生

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；3.廣西梧州甜蜜家蜂業(yè)有限公司，廣西梧州 543000；4.江蘇鴻祺生物科技有限公司，江蘇泰州 225300）

蜂蜜是指蜜蜂采集植物花蜜、植物活體分泌物或在植物活體上吮吸的蜜源昆蟲排泄物等生產(chǎn)的天然甜味物質(zhì)，與其自身分泌的特殊物質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)化、沉積、脫水、貯藏并留存于蜂巢中直至成熟的一種物質(zhì)[1]。蜂蜜中主要包含葡萄糖和果糖，此外還含有少量蛋白質(zhì)、酶、多酚、萜烯類等營養(yǎng)物質(zhì)[2-4]。這些成分賦予了蜂蜜多種功能活性[5]，如抗菌[6]、抗炎[7]、抗氧化[8]等。鵝掌柴蜂蜜呈淺琥珀色，味甘略帶有苦味[9]，主產(chǎn)自廣西、廣東等地，是我國南方特有的冬季蜜種。以往關(guān)于鵝掌柴蜂蜜的研究只有其抗氧化活性[10]，而其特征性成分和真實性評價方法的研究幾乎沒有。

據(jù)統(tǒng)計，蜂蜜是目前十大最易摻假食品之一[11]，其摻假方式主要包括向蜂蜜中摻入糖漿[12-13]和向高價蜂蜜中摻入低價蜂蜜。傳統(tǒng)的蜂蜜真實性檢測方法多集中在孢粉學(xué)和糖漿標(biāo)志物檢測上[14]。然而，孢粉學(xué)檢測需要專業(yè)孢粉學(xué)背景，且無法檢測多種蜂蜜混合的摻假[15]。糖漿標(biāo)志物檢測缺點(diǎn)是糖漿的種類繁多，不同種類糖漿的標(biāo)志物不同，特別是有些糖漿通過大孔樹脂等過濾可以有效的去除糖漿標(biāo)志物，這給蜂蜜的真實性檢測帶來了巨大困難。AOAC 碳同位素檢測也只能檢測到C4 植物糖漿摻假，對C3 植物糖漿無效[16-17]。核磁共振法和超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法價格昂貴，且核磁共振需要大量的真蜂蜜樣本建立龐大的數(shù)據(jù)庫作為支撐，無法對超出數(shù)據(jù)庫外的樣本做出評價[18-19]。

近年來，蜂蜜的真實性檢測從對糖漿標(biāo)志物檢測轉(zhuǎn)移到蜂蜜本身化合物檢測上。Qiao 等[20]通過對洋槐蜜、椴樹蜜、油菜蜜中的特征性成分的研究，發(fā)現(xiàn)洋槐蜜中的萜烯類化合物紅花菜豆酸、椴樹蜜中的萜烯類化合物椴樹素、油菜蜜中的酚酸酯類成分丁香酸甲酯可以作為這三種單花蜜的標(biāo)志性成分，結(jié)合標(biāo)志性成分和指紋圖譜，實現(xiàn)這三種單花蜂蜜的真實性評價。林珣等[21]對枸杞蜜中植物化合物分析，發(fā)現(xiàn)其中特有的黃酮類成分花旗松素，并將其作為枸杞蜜的標(biāo)志性成分，以此建立枸杞蜜的真實性評價方法。因此，通過挖掘單花蜜中特征性化合物，通過特征性化合物建立單花蜜的真實性評價方法對單花蜜真實性評價具有重要意義。目前針對鵝掌柴蜂蜜品質(zhì)評價缺乏系統(tǒng)的方法，因此，本研究通過對鵝掌柴蜂蜜中特征性成分進(jìn)行分析，挖掘鵝掌柴蜂蜜中的特征性化合物，通過特征性化合物和指紋圖譜建立鵝掌柴蜂蜜真實性評價方法，為鵝掌柴蜂蜜的真實性評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鵝掌柴蜂蜜樣品 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所提供，采自廣東、廣西、海南等地；甲醇（色譜純）、乙酸（質(zhì)譜純）美國Thermo Fisher 公司；反,反脫落酸、順,反脫落酸 純度≥98%，美國Sigma 公司；4-（1’-環(huán)乙醚-3’-丁二醇）-3,5,5-三甲基-2-環(huán)己烯酮上海源葉生物科技有限公司；3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇 純度≥97%，本實驗室合成。

SevenEasyS20 型pH 計 瑞士梅特勒公司；ThermoSorvall 離心機(jī) 美國Thermo Fisher 公司；Strata-X-A 固相萃取柱（3 mL）美國Phenomenex 公司；0.22 μm 濾膜 Milipore 公司；安捷倫6500 型QTOF 液質(zhì)聯(lián)用儀，配備Phenomenex Gemini C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）反相色譜柱 美國Agilent 公司；DN-24W 氮吹儀 上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂蜜中化合物富集 參考喬江濤[22]的研究方法，稱取20 g 蜂蜜樣品，加入80 mL 超純水，制備體積分?jǐn)?shù)為5%的氨水，將蜂蜜樣品pH 調(diào)為7，放入離心機(jī)9000 r/min 離心15 min。保留上清液，合并至燒杯，用3 mL 分析級甲醇活化SPE 固相萃取柱，再用3 mL 超純水進(jìn)行平衡，用固相萃取柱進(jìn)行富集，結(jié)束后用2 mL 超純水清洗，再用2 mL 10%的甲酸甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，用氮?dú)獯蹈珊?，加? mL 色譜級甲醇復(fù)溶，0.22 μm 濾膜過濾，裝至棕色進(jìn)樣瓶中于4 ℃下保存，用于分析。

1.2.2 色譜分析條件 流動相A：0.2%乙酸的純水，流動相B：0.2%乙酸的甲醇，柱溫箱溫度35 ℃、反相色譜柱（C18）、樣品進(jìn)樣量20 μL、鵝掌柴蜂蜜的檢測波長270 nm、總流速0.7 mL/min。鵝掌柴蜂蜜的梯度洗脫方法：0～10 min，9%～14% B；10～18 min，14%～15% B；18～28 min，15%～17% B；28～40 min，17～26% B；40～44 min，26～33% B；44～54 min，33～34% B；54～64min，34～35% B；64～69 min，35～37%B；69～74 min，37～38% B；74～84 min，38～41% B；84～89 min，41～44% B；89～96 min，44～54% B；96～126 min，54～65% B；126～135 min，65～80% B。

1.2.3 質(zhì)譜分析條件 電噴霧ESI 離子源，出口電壓為125 V、噴射電壓為4 kV、加熱溫度350 ℃、氮?dú)猓∟2）流速為12 L/min、霧化氣流速為80 kPa、霧化器壓力40 psi、碰撞氣體為氦氣、掃描范圍為100～900 Da[23]。

1.2.4 特征性成分定性分析 首先通過一級質(zhì)譜信息確定化合物的分子量及化學(xué)式，通過二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫比對，并通過二級質(zhì)譜碎片信息得到化合物大致化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)合化合物的極性、最大紫外吸收，推測出化合物結(jié)構(gòu)。通過購買商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗證。

1.2.5 特征性成分定量分析 稱取一定質(zhì)量的苦蜜素B、3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇、反,反式脫落酸、順,反脫落酸，配制成10 ml 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，按照梯度進(jìn)樣方法進(jìn)行HPLC 分析，根據(jù)不同的上樣量和不同的峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中x 為標(biāo)準(zhǔn)品的上樣量（ng），y 為峰面積，如表1 所示。由于苦蜜素C 無商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品，但苦蜜素C 和苦蜜素B 是同分異構(gòu)體，具有相同的分子量、相同的最大紫外吸收，并且其化學(xué)結(jié)構(gòu)也相似。因此苦蜜素C 含量以苦蜜素B 的標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)信息Table 1 Information of standards

1.2.6 HPLC 指紋圖譜的建立 將鵝掌柴原料蜜樣品的高效液相色譜圖，通過中藥色譜指紋圖譜軟件進(jìn)行相似度分析，在此過程中對比并記錄各個樣品中的色譜峰相似度，并在允許范圍內(nèi)進(jìn)行多點(diǎn)校正，即可得到鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

1.2.7 真實性評價方法 a.按照1.2.1 方法對蜂蜜中的特征性化合物進(jìn)行富集，在1.2.2 的色譜條件下得到樣品色譜峰。b.將樣品色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比對，差異較大或有明顯異常色譜峰的樣品均不是鵝掌柴蜂蜜。c.色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜較一致的樣品再對其中的特征性成分進(jìn)行定量分析。d.樣品中鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)志性成分3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇的含量應(yīng)大于或等于原料蜜中最低限量，可判定其為真正的鵝掌柴蜂蜜。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗所有數(shù)據(jù)分析基于SPASS 26.0 軟件計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，MassHunter 10.0 分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，ChemBioDraw Ultra 10.4 繪制化合物結(jié)構(gòu)式，使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件建立鵝掌柴蜂蜜的指紋圖譜并且分析其相似度。每組實驗均為3 次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝掌柴蜂蜜中特征性成分鑒定

鵝掌柴蜂蜜樣品的高效液相色譜圖如圖1 所示。

圖1 鵝掌柴蜂蜜樣品的HPLC 圖譜Fig.1 Chromatograms of heptapleurum honey

根據(jù)化合物的保留時間、最大紫外吸收波長、二級質(zhì)譜碎片信息，標(biāo)準(zhǔn)品驗證分析，確定出鵝掌柴蜂蜜中的5 個特征性成分。表2 為鵝掌柴蜂蜜樣品的成分鑒定結(jié)果。

表2 鵝掌柴蜂蜜樣品中化合物信息Table 2 Composition information on heptapleurum honey

化合物1 在正離子模式下有m/z 241.1424[M+H]+、m/z 263.1248[M+Na]+、m/z 481.2785[2M+H]+的 準(zhǔn)分子離子峰（圖2），負(fù)離子模式下有m/z 239.1276[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，因此判斷該化合物的分子量為240。根據(jù)其精確質(zhì)量可計算出化學(xué)組成為C13H20O4。由m/z 241.1439[M+H]+脫水產(chǎn)生碎片離子m/z 223.1308[M+H-H2O]+，說明化合物含有羥基；由 m/z 241.1439 [M+H]+到 m/z 197.1171[M+HCH3CHO]+，說明化合物含有“-CH（OH）CH3”片段；由m/z 137.0956 到m/z 109.1014 是脫CO，說明化合物結(jié)構(gòu)具有羰基，由m/z 179.1171 到m/z 123.0805，分析結(jié)構(gòu)為環(huán)烯，脫去2-甲基丙烯。該化合物在245 nm 處有最大紫外吸收峰，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道初步判定化合物1 是4-(1’-環(huán)乙醚-3’-丁二醇)-3,5,5-2-環(huán)己烯酮[24]。后通過標(biāo)準(zhǔn)品對其進(jìn)行驗證，明確化合物1 是4-（1’-環(huán)乙醚-3’-丁二醇）-3,5,5-2-環(huán)己烯酮。研究表明，環(huán)烯醚萜類物質(zhì)往往帶有苦味[25]，通過Virtual Taste 軟件[26]對化合物1 苦味度進(jìn)行預(yù)測分析，值為0.77 接近于已知的苦味物質(zhì)乙酰氨基酚的苦味度0.81[27]，推測4-(1’-環(huán)乙醚-3’-丁二醇)-3,5,5-2-環(huán)己烯酮是鵝掌柴蜂蜜苦味的來源之一，因此，我們將其命名為苦蜜素B。

圖2 化合物1 在正負(fù)離子模式下的一級和二級質(zhì)譜圖Fig.2 HPLC-MS and HPLC-MSMS spectrum of compound 1 in positive and negative ion mode

化合物2 在正離子模式下有m/z 225.1476[M+H]+、m/z 471.2662[2M+Na]+的準(zhǔn)分子離子峰（圖3），確定其分子量為224。如表1 所示，該化合物的最大紫外吸收波長為268 nm，二級特征離子碎片為m/z 181.1218 [M+H-CH3CHO]+,m/z 151.1104[M+HCH3CHO-OCH3]+,m/z 121.1005[M+H-CH3CHOOCH3-OCH3]+，判斷該化合物的分子式為C12H16O4，計算其環(huán)加雙鍵值為5，可以確定分子結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)。結(jié)合碰撞能量分析，由m/z 225.1465 到m/z 181.1218 相差44，通過元素擬合中性丟失為CH3CHO，m/z 181.1218 到m/z 151.1104 相差30，由m/z 151.1104到m/z 121.1005 相 差30，由m/z 121.1005 到m/z 91.0531 為連續(xù)斷裂3 個甲氧基，根據(jù)以上斷裂規(guī)律，初步推測該化合物為3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇，后通過標(biāo)準(zhǔn)品驗證，確定該化合物為3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇，由于首次在蜂蜜中鑒定出該成分，將其定為鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)志性成分。

化合物3 在正離子模式下有m/z 241.1444[M+H]+、m/z 263.2697[M+Na]+的準(zhǔn)分子離子峰（圖4），負(fù)離子模式下有m/z 239.0523[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，因此判斷該化合物分子量為240。化合物3 和化合物1 互為同分異構(gòu)體。兩個化合物的二級質(zhì)譜斷裂碎片也都接近，表明兩個化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)接近。比較化合物3 和化合物1 的碎片離子m/z 137.0958和m/z 153.0526 的豐度可知，化合物1 中碎片離子m/z 137.0958 是m/z 179.1084 經(jīng)過H 重排后斷裂來的，化合物3 中m/z 137.0958 可以通過m/z 179.1084經(jīng)過H 重排和m/z 153.0526 的RDA 碎裂而來。因此，判斷化合物1 的環(huán)氧共軛在C6 和C7 上，而化合物3 的環(huán)氧共軛在C8 和C9 上。初步斷定化合物3 可能為：4-(1’2’-二羥基-3’環(huán)氧丙烷)-3,5,5-2-環(huán)己烯酮。通過Virtual Taste 軟件對化合物3 苦味度進(jìn)行預(yù)測分析為0.80，推測化合物3 也可能是鵝掌柴蜂蜜的苦味來源之一，因此我們將其命名為苦蜜素C。

圖4 化合物3 在正負(fù)離子模式下的一級和二級質(zhì)譜圖Fig.4 HPLC-MS and HPLC-MSMS spectrum of compound 3 in positive and negative ion mode

化合物4 在正模式下有m/z 265.1414[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰（圖5），負(fù)離子模式下有m/z 263.1259[M+H]-、m/z 527.2657[2M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，因此，判斷其分子量為264。如表1 所示，該化合物在263 nm 下有最大紫外吸收峰，結(jié)合實驗室前期鑒定成果及加入標(biāo)準(zhǔn)品驗證[28]，確定該化合物為反,反式脫落酸。

圖5 化合物4 在正負(fù)離子模式下的一級和二級質(zhì)譜圖Fig.5 HPLC-MS and HPLC-MSMS spectrum of composition 4 in positive and negative ion modes

化合物5 在正離子模式下有m/z 529.2759[2M+H]+準(zhǔn)分子離子峰（圖6），負(fù)離子模式下有m/z 263.1285[M+H]-、m/z 527.2643[2M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，因此，判斷其分子量為264。結(jié)合表1 可知，化合物5 與化合物4 的分子量、最大紫外吸收波長及二級斷裂碎片均相同，保留時間不同，因此推測兩者可能互為同分異構(gòu)體。結(jié)合實驗室前期鑒定成果及加入標(biāo)準(zhǔn)品驗證[29]，確定該化合物為順,反式脫落酸。

圖6 化合物5 在正負(fù)離子模式下一級和二級質(zhì)譜圖Fig.6 HPLC-MS and HPLC-MSMS spectrum of composition 5 in positive and negative ion modes

2.2 鵝掌柴蜂蜜中特征性成分定量分析

將Y01～Y10 不同產(chǎn)地的鵝掌柴原料蜜中的特征性成分進(jìn)行定量分析，結(jié)果如表3 所示。其中，順,反式脫落酸含量最高，平均含量14.46±0.34 mg/kg，反,反式脫落酸的平均含量為6.85±0.52 mg/kg，苦蜜素B 和苦蜜素C 的平均含量分別為5.97±0.26、11.13±0.45 mg/kg。鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)志性成分3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇的平均含量為2.30±0.25 mg/kg，最低含量為1.73±0.18 mg/kg。

表3 鵝掌柴原料蜜中化合物含量（mg/kg）Table 3 Contents of compounds in heptapleurum raw honey samples (mg/kg)

2.3 鵝掌柴蜂蜜HPLC 指紋圖譜建立

將10 個鵝掌柴原料蜜樣品的高效液相色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，在可允許范圍內(nèi)進(jìn)行多點(diǎn)校正，樣品間相似度均高于0.8。鵝掌柴原料蜜樣品生成的指紋圖譜及鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜見圖7 和圖8。

圖7 鵝掌柴原料蜜樣品生成的指紋圖譜Fig.7 Fingerprints of heptapleurum raw honey samples

圖8 鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜Fig.8 Fingerprints of heptapleurum honey

2.4 市售鵝掌柴商品蜜的真實性評價

根據(jù)上述建立的鵝掌柴蜂蜜真實性評價指標(biāo)，對市售的6 個品牌鵝掌柴蜂蜜進(jìn)行真實性評價。從HPLC 色譜圖（圖9）中可以看到，品牌A、B 和C 樣品的色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜較一致，在三個品牌中，均檢測到了在鵝掌柴蜂蜜中鑒定出的5 個成分（表4），其含量范圍分別為4.12～6.65、1.98～2.72、4.57～11.23、4.96～8.25、10.92～14.68 mg/kg，標(biāo)志性成分含量均大于1.73 mg/kg，與原料蜜樣品中含量較接近。因此，這三個品牌為品質(zhì)較好的鵝掌柴蜂蜜。在品牌D 和E 中，雖然也檢測到在鵝掌柴蜂蜜中鑒定出的5 個成分，但與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相比，存在較明顯差異，且品牌D 中出現(xiàn)含量較高的異常峰。因此，推測品牌D 和E 可能混入了其他單花蜜，純度較低。在品牌F 中，均未檢測到在鵝掌柴蜂蜜中特征性成分，且與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜差異較大。因此，我們推測品牌F 不是鵝掌柴蜂蜜。

表4 鵝掌柴商品蜜中化合物含量（mg/kg）Table 4 Contents of compounds in heptapleurum commercial honey samples (mg/kg)

3 結(jié)論

通過HPLC-Q-TOF-MSMS 在鵝掌柴蜂蜜中共鑒定出5 個特征性成分，分別為苦蜜素B、3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇、苦蜜素C、反,反式脫落酸、順,反式脫落酸。首次在蜂蜜中發(fā)現(xiàn)3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇，將其定為鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)志性成分。通過中藥色譜指紋圖譜軟件，建立鵝掌柴蜂蜜的HPLC 指紋圖譜，通過結(jié)合特征性成分和指紋圖譜，建立了鵝掌柴蜂蜜的真實性評價方法。對市售的6 個鵝掌柴蜂蜜進(jìn)行真實性評價，其中3 個品牌為品質(zhì)較好的鵝掌柴蜂蜜，2 個品牌為鵝掌柴蜂蜜中可能混入其他蜂蜜，1 個品牌中未檢測到鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)志性成分，并且色譜圖與指紋圖譜存在明顯差異，推測其不是鵝掌柴蜂蜜。本研究為鵝掌柴蜂蜜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立，提供了重要的理論依據(jù)。