鄭 沛，文 敏，劉秋葉，王 瀟，左亞杰,

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙 410208）

半枝蓮為唇形科黃芩屬植物半枝蓮（Scutellaria barbataD.Don）的干燥全草，又名通經(jīng)草、野夏枯草、并頭草等[1]。在世界范圍內(nèi)分布廣泛，喜濕，常生于田邊或濕潤草地上[2]。雖尚未正式納入藥食同源及保健食品可用名錄，但被廣泛開發(fā)用于藥品、保健品、動物喂養(yǎng)飼料等行業(yè)。半枝蓮作為公認的抗癌中藥[3]，味辛、苦，具有清熱解毒、祛瘀止血、利水消腫的作用[4]。目前，從半枝蓮中已分離出萜類[5]、黃酮類[6]、生物堿類、多糖和揮發(fā)油等多種活性成分[7]，此外，還富含人體必需的氨基酸、維生素及微量元素[8]。因其顯著的藥理價值和營養(yǎng)價值可廣泛地用于醫(yī)藥、食品、日用化工等多領(lǐng)域的開發(fā)。

半枝蓮中的黃酮類化合物為主要的活性物質(zhì)，具有強化免疫系統(tǒng)[9]、抗自由基氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能[10]、影響血管的脆性與滲透性[11]、改善血液循環(huán)等[12]諸多生理功能。同時，現(xiàn)已證實黃酮類成分是人體必需的營養(yǎng)成分，可對人體起重要的保健作用[13]。但人體自身不能合成，只能通過外界攝取[14]，故此對黃酮類成分用于食品及保健品的研究與開發(fā)也將具有更高的經(jīng)濟效益與社會效益。

目前對于黃酮的提取方法主要有熱水提取法[15]、超聲波提取法[16]、微波提取法[17]、半仿生-酶法提取[18]等。有研究表明這些方法或多或少存在操作較為復雜，提取雜質(zhì)多，不適用工業(yè)化生產(chǎn)等缺陷，相比較而言溶劑提取法試劑用量少、提取時間短、提取較為完全、雜質(zhì)少[19]。同時，采用乙醇作為溶劑，可降低生產(chǎn)成本及減少對環(huán)境造成的污染。黃酮的測定方法主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等[20-21]。其中紫外分光光度法可快速測定黃酮成分，操作簡便。目前，對于半枝蓮總黃酮的研究主要集中在黃酮的提取與抗氧化層面，對提取純化后的總黃酮在抗氧化、抗腫瘤的研究成果較少，結(jié)合現(xiàn)代科學技術(shù)對半枝蓮總黃酮提取方式及藥理作用的相關(guān)研究是藥材資源合理利用及相關(guān)疾病藥物的開發(fā)應用的重要前提。因此，本文選用半枝蓮為研究對象，采用溶劑提取法探討半枝蓮總黃酮的提取工藝，考察了提取時間、料液比、提取溫度、乙醇體積分數(shù)對半枝蓮總黃酮得率的影響；采用響應面Box-Behnken 設(shè)計優(yōu)化半枝蓮總黃酮提取工藝，并初步評價半枝蓮總黃酮提取物的抗氧化及抗腫瘤活性。以期提高半枝蓮黃酮類化合物的提取效率及對半枝蓮資源的深入開發(fā)具有一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

半枝蓮 購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，經(jīng)該院張裕民主任藥師鑒定為唇形科植物半枝蓮Scutellaria barbataD.Don 的干燥全草；蘆丁對照品（純度≥98%）、維生素C 對照品（純度≥99%）上海源葉生物科技有限公司；AB-8 大孔吸附樹脂 上海麥克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）阿拉丁試劑（上海）有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈雙抗、PBS、0.25%胰酶消化液、人肝癌HepG2 細胞（CL-0103）武漢普諾賽生命科技有限公司；噻唑藍溴化四唑MTT北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜DMSO 美國Sigma 公司；其他有機試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司；人高轉(zhuǎn)移性肝癌MHCC-97H細胞（IM-H045）、人肝癌HuH-7 細胞（CL-0120）、人非小細胞肺癌NCI-H1299 細胞（CRL-5803）均由湖南中醫(yī)藥大學藥學院教研室饋贈。

DK-98-ⅡA 恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；DHG-9123A 電熱鼓風干燥箱、BPN-150CRHCO2培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；AX223ZH電子分析天平 奧豪斯公司；UV-9000S 紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；Enspire 多功能酶標儀 Perkinelmer 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 半枝蓮總黃酮含量測定及得率計算

1.2.1.1 蘆丁標準曲線的制備 精密稱定蘆丁對照品20 mg，80%乙醇溶解，制成濃度為0.2 mg/mL 的標準儲備液，備用。

1.2.1.2 檢測波長的選擇 參考文獻[22-23]的方法，并稍作修改，吸取蘆丁儲備液1.0 mL 于10 mL的容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL 搖勻，靜置6 min；后加10%硝酸鋁溶液0.4 mL 搖勻，靜置6 min；再加4%氫氧化鈉溶液4 mL，80%乙醇定容，搖勻，靜置15 min。以80%乙醇作為參比溶液，在100～900 nm 進行波長掃描，發(fā)現(xiàn)在506 nm 處有最大吸收波長，故選擇其作為檢測波長。

1.2.1.3 標準曲線的繪制 精密吸取上述儲備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 于10 mL 容量瓶中（不足4.0 mL 的加80%乙醇至4.0 mL），采用1.2.1.2 方法下的操作測定吸光度，繪制以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）的標準曲線，得方程為A=15.738x-0.0628，R2=0.9994，在0.01～0.08 mg/mL 下線性范圍良好。

1.2.1.4 樣品測定 將半枝蓮藥材粉碎，過4 號篩后避光保存，備用。準確稱取半枝蓮粉末5.0 g，置250 mL 具塞錐形瓶中，加入75%的乙醇150 mL，在溫度為75 ℃下回流提取90 min，提取2 次，放冷后用五層紗布過濾，合并兩次濾液，60 ℃減壓濃縮后轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中定容，得樣品溶液。精密吸取樣品溶液1 mL 于10 mL 容量瓶中定容，得樣品待測溶液。精密吸取樣品待測溶液1 mL 于10 mL 容量瓶中，按照1.2.1.2 方法下顯色方法于506 nm 處測定吸光度（A），代入回歸方程中計算總黃酮的質(zhì)量濃度（C），計算半枝蓮總黃酮得率（Y）的公式如下[24]：

式中：Y 為半枝蓮總黃酮得率，mg/g；C 為提取液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；D 為稀釋倍數(shù)；V 為樣品溶液總體積，mL；M 為半枝蓮的質(zhì)量，g。

1.2.2 單因素實驗 精密稱取半枝蓮粉末，每份5.0 g，在設(shè)定的實驗條件下回流提取2 次，過濾，合并濾液，減壓濃縮至25 mL 容量瓶中，得半枝蓮總黃酮提取液。每組實驗平行3 次，按照1.2.1.2 方法下測定吸光度，并根據(jù)公式計算半枝蓮總黃酮得率。

1.2.2.1 不同提取時間對半枝蓮總黃酮得率的影響設(shè)定料液比1:30 g/mL，提取溫度75 ℃，乙醇體積分數(shù)75%，考察提取時間（60、90、120、150、180 min）對總黃酮得率的影響。

1.2.2.2 不同料液比對半枝蓮總黃酮得率的影響設(shè)定提取時間90 min，提取溫度75 ℃，乙醇體積分數(shù)75%，考察料液比（1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 g/mL）對總黃酮得率的影響。

1.2.2.3 不同提取溫度對半枝蓮總黃酮得率的影響設(shè)定提取時間90 min，料液比（1:40 g/mL），乙醇體積分數(shù)75%，考察提取溫度（55、65、75、85、95 ℃）對總黃酮得率的影響。

1.2.2.4 不同乙醇體積分數(shù)對半枝蓮總黃酮得率的影響 設(shè)定提取時間90 min，料液比（1:40 g/mL），提取溫度65 ℃，考察乙醇體積分數(shù)（55%、65%、75%、85%、95%）對總黃酮得率的影響。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，以各顯著影響因素為自變量。利用Design-Expert 8.0.6 軟件和Box-Behnken 設(shè)計進行4 因素3 水平的響應面試驗，實驗選取提取時間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、乙醇體積分數(shù)（D）為自變量，半枝蓮總黃酮得率（Y）為響應值，優(yōu)化半枝蓮總黃酮的提取工藝，因素及水平設(shè)計見表1。

表1 響應面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Design factors and levels of response surface experiment

1.2.4 半枝蓮總黃酮的純化 按照最優(yōu)工藝制得半枝蓮總黃酮提取溶液，減壓濃縮至含生藥濃度為0.2 g/mL 的濃縮液，備用。參考前期預實驗結(jié)果及半枝蓮總黃酮純化工藝的文獻[25-26]報道，采用AB-8 大孔吸附樹脂純化，濕法裝柱（層析柱內(nèi)徑2.5 cm，高25 cm），樹脂徑高比1:6。上樣濃度為濃縮液所稀釋后的樣品溶液，濃度為10 mg/mL，樣品體積為3 BV，上樣流速為2 mL/min，水洗量為3 BV 以去除雜質(zhì)，后用40%乙醇4 BV 洗脫，洗脫體積流量為2 mL/min。減壓濃縮后進行冷凍干燥，處理得半枝蓮總黃酮純化物。分別取適量半枝蓮粗黃酮和經(jīng)過純化后的總黃酮凍干粉于25 mL 容量瓶中，加75%的乙醇定容制成濃度為20 mg/mL 的樣品溶液，按照1.2.1.4 方法下方法測得半枝蓮總黃酮純化后的得率。

1.2.5 體外抗氧化活性分析

1.2.5.1 DPPH 自由基清除能力的測定 參考文獻[27-28]方法并稍作修改，精密稱取半枝蓮總黃酮純化物和維生素C 適量，分別加乙醇制成濃度為2.5 mg/mL 的儲備液備用。精密吸取各儲備液后加乙醇稀釋得質(zhì)量濃度為5、10、25、50、100、200、400、600 μg/mL 的樣品溶液。每個質(zhì)量濃度設(shè)6 個復孔，陽性組采用維生素C 代替樣品溶液。吸取100 μL 樣品溶液于96 孔板中，等量加入DPPH 溶液，混勻，避光反應30 min，517 nm 波長下檢測吸光度。根據(jù)吸光度計算樣品對DPPH 自由基的清除能力，實驗重復三次，并利用Graphpad prism 9.5.0 軟件計算半枝蓮總黃酮純化物和維生素C 對DPPH 自由基清除率的IC50值。計算DPPH 自由基清除率公式如下：

式中：A0為乙醇+DPPH 溶液的吸光度；A1為樣品溶液+DPPH 溶液的吸光度；A2為樣品溶液+乙醇的吸光度。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除能力的測定 參考文獻[29-30]并適當優(yōu)化，將制備的ABTS 儲備液用50%乙醇溶液稀釋。調(diào)節(jié)其吸光值在734 nm 波長下為0.7±0.05，即得ABTS 工作液。將半枝蓮總黃酮純化物用50%乙醇稀釋成質(zhì)量濃度為5、10、25、50、100、200、400、600 μg/mL 的樣品溶液，維生素C 作為陽性對照組，每個質(zhì)量濃度設(shè)置6 個復孔。分別吸取10 μL 供試品樣液與200 μL ABTS 工作液加入到96 孔板中，避光孵育8 min，在734 nm 下測定吸光值。根據(jù)吸光度計算樣品對ABTS+自由基清除能力，實驗重復三次，并利用Graphpad prism 9.5.0 軟件計算半枝蓮總黃酮純化物和維生素C 對ABTS+自由基清除率的IC50值。計算ABTS+自由基清除率公式如下：

式中：A0為50%乙醇+ABTS 工作液的吸光度；A1為樣品溶液+ABTS 工作液的吸光度；A2為樣品溶液+50%乙醇的吸光度。

1.2.6 體外抗腫瘤活性的測定

1.2.6.1 細胞培養(yǎng) 將人非小細胞肺癌NCI-H1299細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，人肝癌HepG2 細胞、人高轉(zhuǎn)移性肝癌MHCC-97H 細胞、人肝癌HuH-7 細胞分別培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，均于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.6.2 抗腫瘤活性測定 參考文獻[31-32]方法，取處于對數(shù)生長期的NCI-H1299 細胞、HepG2 細胞、MHCC-97H 細胞、HuH-7 細胞，分別經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化、離心、制成懸液后調(diào)整細胞密度NCI-H1299 細胞為8×104個/mL，其余細胞密度為1×105個/mL，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h 至細胞完全貼壁，棄去原培養(yǎng)液。實驗設(shè)置空白組、對照組和樣品組?？瞻捉M中無細胞只含相應完全培養(yǎng)基，對照組中含細胞與相應培養(yǎng)基，樣品組中依此加入總黃酮純化物濃度為50、100、200、300、400、500、600 μg/mL 的完全培養(yǎng)液。每組設(shè)置5 個復孔，分別培養(yǎng)24 h。

培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入濃度為5 mg/mL 的MTT溶液（10 μL 每孔），在培養(yǎng)箱中孵育4 h 后吸去上清，每孔加入DMSO 溶液（150 μL 每孔），避光處理，搖床上低速振蕩10 min，酶標儀490 nm 波長下測定吸光度，根據(jù)下式計算細胞存活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗均設(shè)計三次平行實驗，運用Excel 2019、Orign 2021、Design-Expert 13、Graphpad Prism 9.5.0等軟件對數(shù)據(jù)進行處理及統(tǒng)計分析，其中MTT 實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以P＜0.05 視作差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取時間對半枝蓮總黃酮得率的影響 提取時間對半枝蓮總黃酮得率的影響如圖1 所示，提取時間在60～90 min 時，半枝蓮總黃酮得率隨著時間的延長逐漸增加，在提取時間為90 min 時，總黃酮得率達到最大值，得率由22.03±0.10 mg/g 升高到23.35±0.16 mg/g。提取時間超過90 min 后，總黃酮得率隨著時間的増加反而出現(xiàn)下降趨勢，這可能是因為回流時間越長，乙醇的揮發(fā)性越大從而導致乙醇濃度降低，促使黃酮的提取能力減弱，也可能是此時黃酮類化合物已經(jīng)基本溶出[33]，延長回流時間黃酮類成分也變化不大，甚至可能造成部分熱敏性的黃酮成分發(fā)生降解[34]，還會影響其他物質(zhì)的溶出。因此，選擇提取時間60～120 min 進行響應面優(yōu)化試驗。

圖1 提取時間對半枝蓮總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the yield of total flavonoids from Scutellaria barbata

2.1.2 料液比對半枝蓮總黃酮得率的影響 料液比對半枝蓮總黃酮得率的影響如圖2 所示，隨著料液比的增加，半枝蓮總黃酮得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，總黃酮得率在料液比為1:40（g/mL）時達到最大值，得率為23.31±0.07 mg/g。當溶劑體積倍數(shù)超過40 倍時，總黃酮得率明顯降低，至21.60±0.08 mg/g。其原因可能是在一定范圍內(nèi)，隨著料液比的增加會促進黃酮類物質(zhì)的溶出，超過此范圍可能會導致其他成分的溶出以及使某些黃酮類成分的結(jié)構(gòu)被破壞，從而導致黃酮得率降低[35]。因此，選擇料液比1:30～1:50 g/mL 進行響應面優(yōu)化試驗。

2.1.3 提取溫度對半枝蓮總黃酮得率的影響 提取溫度對半枝蓮總黃酮得率的影響如圖3 所示，當溫度在55～65 ℃的時候總黃酮得率隨著溫度升高而升高，并在提取溫度為65 ℃時達到最大值，為27.82±0.14 mg/g，當溫度高于65 ℃時，半枝蓮總黃酮得率明顯下降，這可能是因為隨著溫度的適當增加，分子運動速度及溶解滲透能力增強，故提取效果好[36]。但溫度太高，導致熱敏性的黃酮類成分結(jié)構(gòu)遭受破壞，部分黃酮成分氧化，從而黃酮得率降低。因此選擇提取溫度為55～75 ℃進行響應面優(yōu)化試驗。

圖3 提取溫度對半枝蓮總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the total flavonoid yield from Scutellaria barbata

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對半枝蓮總黃酮得率的影響乙醇體積分數(shù)對半枝蓮總黃酮得率的影響如圖4 所示，當乙醇體積分數(shù)為55%～75%時，半枝蓮總黃酮得率明顯增加，且在乙醇體積分數(shù)為75%時達到最大值，為26.04±0.19 mg/g，當乙醇體積分數(shù)大于75%時，黃酮得率減小，這可能是因為當乙醇濃度超過一定范圍時，會使醇溶性的色素及極性更小的脂溶性成分溶出變多，這些溶劑會與黃酮類化合物競爭溶劑，從而導致黃酮類成分的溶出能力降低[37]。因此選擇乙醇體積分數(shù)為65%～85%進行響應面優(yōu)化試驗。

圖4 乙醇體積分數(shù)對半枝蓮總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of volume fraction of ethanol on the yield of total flavonoids of Scutellaria barbata

2.2 響應面試驗結(jié)果

2.2.1 響應試驗設(shè)計結(jié)果 利用軟件Design-Expert 8.0.6 進行試驗設(shè)計并對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得半枝蓮總黃酮得率（Y）對提取時間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、乙醇體積分數(shù)（D）的二元回歸模擬方程：Y=2.57+0.0664A+0.0685B+0.1291C-0.0866D-0.0722AB+0.0034AC+0.0468AD+0.0592BC+0.0209BD+0.1049CD-0.2524A2-0.2928B2-0.1830C2-0.3434D2。響應試驗結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of response surface experiment

2.2.2 響應面回歸模型方差分析 響應回歸模型方差見表3，由表3 可知：該模型的F=15.25，P＜0.0001，表明所得模型極顯著，失擬項為P值為0.5390＞0.05，不顯著，表明實驗結(jié)果主要受所選因素影響受其他因素影響很小，方程式成立，方法可靠。模型的復合相關(guān)系數(shù)R2=0.9385，說明該模型擬合程度良好，可以用該模型優(yōu)化半枝蓮中總黃酮的提取工藝。根據(jù)F值可知所考察的因素對響應值影響力的大小順序為提取溫度（C）＞乙醇體積分數(shù)（D）＞料液比（B）＞提取時間（A），其中一次項中提取溫度與乙醇體積分數(shù)交互作用對結(jié)果影響顯著，其他交互作用影響不顯著，二次項中四個因素對結(jié)果均有極顯著影響。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equations

2.2.3 響應面試驗交互作用分析 根據(jù)回歸方程，繪制出提取溫度（C）和乙醇體積分數(shù)（D）交互項的響應面和等高線圖，如圖5 所示。響應面越陡峭且傾斜程度越大則說明該圖中兩因素間的交互作用越顯著；等高線呈現(xiàn)橢圓形且線之間越密集則說明交互作用越明顯[38]。從圖5 中可看出提取溫度與乙醇體積分數(shù)的響應面圖呈陡峭狀且等高線圖呈橢圓形，說明提取溫度與乙醇體積分數(shù)之間的交互作用顯著，直觀分析結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖5 提取溫度和乙醇體積分數(shù)交互作用對半枝蓮總黃酮得率影響的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of the interaction between extraction temperature and ethanol volume fraction on the yield of total flavonoids from Scutellaria barbata

2.2.4 最佳提取工藝的確定與驗證 響應面模型優(yōu)化的最優(yōu)提取工藝為提取時間93.2443 min，料液比1:41.3804（g/mL），提取溫度68.5852 ℃，乙醇體積分數(shù)74.4041%，預測此條件下總黃酮得率為26.05 mg/g。為便于工業(yè)生產(chǎn)及實際操作的可行性，確定最終工藝為提取時間93 min，料液比1:41（g/mL），提取溫度68 ℃，乙醇體積分數(shù)75%。采用該提取方法進行3 次平行實驗，總黃酮得率的均值為26.46 mg/g，與預測值的相對誤差為1.56%，表明經(jīng)優(yōu)化的提取工藝可行且穩(wěn)定，可用于半枝蓮總黃酮的提取。

半枝蓮總黃酮經(jīng)大孔樹脂純化后的得率為60.13 mg/g，純度為49.32%，比粗提?。?7.35%）純度增大2.84 倍左右。

2.3 半枝蓮總黃酮抗氧化活性測定

2.3.1 半枝蓮總黃酮純化物對DPPH 自由基的清除作用 半枝蓮總黃酮純化物對DPPH 自由基的清除作用如圖6 所示，當半枝蓮總黃酮純化物質(zhì)量濃度在5～600 μg/mL 的范圍內(nèi)，對DPPH 自由基的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，呈現(xiàn)量效關(guān)系。當質(zhì)量濃度在400 μg/mL 時對DPPH 自由基的清除能力開始接近陽性藥物維生素C，當質(zhì)量濃度為600 μg/mL時，自由基清除率達到96.75%，幾乎與陽性藥維生素C 的自由基清除率（98.86%）相當。此外根據(jù)文獻[39-40]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近年來對半枝蓮黃酮的抗氧化能力大多是評價粗提物的自由基清除能力，對純化后的總黃酮未見研究。因此在此次實驗中發(fā)現(xiàn)在相同濃度時，經(jīng)純化后的半枝蓮總黃酮比粗提物的自由基清除能力更強。則進一步說明該提取方式可行且純化后的總黃酮比粗提取的自由基清除能力更強，因此，對半枝蓮粗提取進行純化試驗可減少藥物資源的浪費，同時增強該成分的抗氧化活性。利用Graphpad prism 軟件計算半枝蓮總黃酮純化物和維生素C 對DPPH 自由基清除率的IC50分別為25.41、5.07 μg/mL。可見，與維生素C 相比，半枝蓮總黃酮純化物對DPPH自由基清除率略弱。

圖6 半枝蓮總黃酮純化物對DPPH 自由基清除能力Fig.6 Scavenging rate of DPPH radicals by total flavonoids purified from Scutellaria barbata

2.3.2 半枝蓮總黃酮純化物對ABTS+自由基的清除作用 半枝蓮總黃酮純化物對ABTS+自由基的清除作用如圖7 所示，ABTS+自由基的清除能力隨半枝蓮總黃酮純化物的濃度升高而加強，且呈現(xiàn)量效關(guān)系。當質(zhì)量濃度為600 μg/mL 時，清除率達到91.75%，此時ABTS+自由基的清除能力接近于維生素C 的自由基清除率（94.96%）。同時根據(jù)Graphpad prism 軟件分析，得出半枝蓮總黃酮純化物IC50=70.41 μg/mL和維生素C 的IC50=8.56 μg/mL，這說明，在相同濃度下，半枝蓮總黃酮純化物對ABTS+的自由基清除率比維生素C 相對較弱。

圖7 半枝蓮總黃酮純化物對ABTS+自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of ABTS+ radicals by total flavonoids purified from Scutellaria barbata

2.4 半枝蓮總黃酮純化物抗腫瘤活性測定結(jié)果

半枝蓮總黃酮純化物對肺癌NCI-H1299 細胞、肝癌HepG2 細胞、MHCC-97H 細胞、HuH-7 細胞活性試驗結(jié)果如圖8 所示，由圖可知，對于人肝癌HuH-7細胞，除質(zhì)量濃度為50 μg/mL 組外，其余各藥物濃度組對肝癌細胞的存活率與對照組相比較均有顯著抑制作用（P＜0.0001）。此外，半枝蓮總黃酮純化物對以下4 種腫瘤細胞均能產(chǎn)生不同程度的抑制作用，當半枝蓮總黃酮的質(zhì)量濃度增加時，細胞存活率出現(xiàn)顯著降低趨勢，且呈現(xiàn)劑量-效應關(guān)系，其中以NCIH1299 細胞更明顯，IC50分別為168.6、330.5、269.2、335.8 μg/mL。

圖8 半枝蓮總黃酮純化物作用于腫瘤細胞的活性測定結(jié)果（n=3）Fig.8 Results of the activity assay of total flavonoids purified from Scutellaria barbata acting on tumor cells (n=3)

3 結(jié)論

本研究采用溶劑提取法，經(jīng)單因素實驗結(jié)合響應曲面試驗，最終確定半枝蓮總黃酮最優(yōu)提取條件為提取時間93 min，料液比1:41（g/mL），提取溫度68 ℃，乙醇體積分數(shù)75%，總黃酮得率為26.46 mg/g。所獲得的半枝蓮總黃酮提取工藝穩(wěn)定、可靠，能夠為半枝蓮總黃酮的新藥研發(fā)、產(chǎn)品開發(fā)等提供理論依據(jù)。

本實驗利用AB-8 型大孔吸附樹脂對最佳提取工藝提取后的總黃酮進行富集純化，并對純化后得到的總黃酮進行體外抗氧化及抗腫瘤活性評價。其中抗氧化實驗結(jié)果表明純化后的半枝蓮總黃酮與同樣采用溶劑提取法的半枝蓮總黃酮粗提物相比在同一濃度上有更強的抗氧化能力，且純化后的總黃酮抗氧化能力與該質(zhì)量濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，清除DPPH 自由基的能力較清除ABTS+自由基強，但其機理尚不明確，仍需進一步探究。相較維生素C 對照組，在較高濃度時表現(xiàn)出與陽性組相當?shù)目寡趸钚裕軌驗榘胫ι徔傸S酮在食品、藥品等產(chǎn)品研發(fā)、新型抗氧劑研發(fā)等領(lǐng)域提供新的研究方向?？鼓[瘤實驗中，采用MTT 法檢測細胞活性，結(jié)果表明純化后的總黃酮提取物對4 種腫瘤細胞均有一定抑制作用，其中對NCI-H1299 細胞的抑制作用更明顯，其增殖抑制能力依次為肺癌NCI-H1299 細胞＞MHCC-97H 細胞＞HepG2 細胞＞HuH-7 細胞，這提示半枝蓮總黃酮在治療肺癌和肝癌方面有較好的應用前景，可為開發(fā)以半枝蓮尤其是半枝蓮總黃酮為原料的，具有廣泛臨床應用價值和商業(yè)開發(fā)價值的抗腫瘤新藥提供理論和實驗依據(jù)。