鐘婉瀅，苗建銀, ，葉灝鐸，馬 鳳，胡一晨

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東廣州 510642；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點實驗室，四川省雜糧產(chǎn)業(yè)化工程技術研究中心，食品與生物工程學院，成都大學，四川成都 610106）

高脂血癥是全身性代謝綜合征，患者因自身體內(nèi)的低密度脂蛋白清除功能較差和低密度脂蛋白受體表達不活躍，導致體內(nèi)甘油三酯、膽固醇和低密度脂蛋白指標出現(xiàn)異常的升高[1-2]。血脂異常與人類大多數(shù)疾病有關，包括心血管疾病和脂肪肝疾病[3]。據(jù)統(tǒng)計，2018 年中國國民的非高密度脂蛋白膽固醇整體水平超過了多數(shù)西方國家[4]。因此，高脂血癥正逐步危害國民健康，并影響人們的生活質量。常見的降血脂藥物有他汀類藥物和非他汀類藥物，他汀類藥物會刺激血糖升高從而導致糖尿病的危害發(fā)生，而非他汀類藥物的療效不如前者[5]。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)天然提取物能有效抑制高血脂癥，如多糖[6]、蛋白質及其多肽[7]、黃酮[8]、脂肪酸[9]等，其中多肽中特有的氨基酸能影響脂類物質的代謝，阻礙后者與膽酸的作用，從而達到機體吸收脂類物質水平量下降的目的[10]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)食物中蛋白質組分能調節(jié)血脂異常的情況，其降血脂效應來源于它們的肽片段和精氨酸殘基的存在[11-12]。降血脂肽的活性機制主要通過破壞膠束溶解度和膳食膽固醇的吸收從而改變肝腸膽汁酸、促進膽固醇分解代謝以及調節(jié)致脂蛋白和基因的表達[13]。因此，從天然食品原料中開發(fā)安全有效的降血脂活性成分對國民的健康水平起關鍵作用。

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）屬于莧菜科植物，在我國北方地區(qū)大面積推廣栽種[14-15]，其蛋白質含量在13.1%至16.7%之間，超過大米、大麥、玉米和黑麥的蛋白含量，其中藜麥的賴氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸含量高于常規(guī)谷物中的限制性氨基酸水平[16]。從健康角度出發(fā)，藜麥由于具有優(yōu)質的蛋白質而被認為是一種功能性食品[17]。藜麥蛋白經(jīng)酶水解后釋放的多肽酶解物含有較高的生物活性[18-20]，如抗氧化活性[21]、血管緊張素轉換酶（ACE）抑制活性[22]、調節(jié)血糖[23]等。然而，藜麥蛋白肽對于降血脂和降尿酸功效的研究較少?，F(xiàn)階段對植物源蛋白降血脂肽的研究非常豐富[24]，如燕麥多肽[25]、大豆多肽[26]等。此外，多數(shù)植物源蛋白肽具有降尿酸的效果，如茶蛋白肽[27]，核桃多肽[28]。因此，藜麥蛋白肽的降血脂和降尿酸雙重功效值得深入研究。

本研究利用堿提酸沉法從藜麥提取蛋白，以胰脂肪酶抑制率為響應值，根據(jù)單因素和響應面試驗確定藜麥蛋白降血脂肽的最優(yōu)酶解工藝條件，通過體外降血脂、降尿酸活性實驗和氨基酸組成深入分析藜麥多肽的功能活性。本研究為綜合利用藜麥資源，開發(fā)具有降血脂和降尿酸功效的功能性食品提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥原料（采收于2021 年10 月）來自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點實驗室；胰蛋白酶（25 萬 U/g）、木瓜蛋白酶（20 萬 U/g）、堿性蛋白酶（20 萬 U/g）、胃蛋白酶（300 萬 U/g）、中性蛋白酶（10 萬 U/g）廣西南寧龐博生物工程有限公司；黃嘌呤氧化酶（50 U/mg）、別嘌呤醇、黃嘌呤 上海麥克林生化有限公司；月桂酸-4-硝基苯酯 天津市富宇精細化工有限公司；4-硝基苯丁酸酯 西安市晶博生物科技有限公司；?；悄懰徕c（STC）上海源葉生物科技有限公司；胰脂肪酶（來自豬胰腺）（3～9 萬 U/g）上海阿拉丁生物科技公司；100 mmol/L Tris-HCl 溶液 廣州億濤生物科技有限公司；膽固醇酯酶（15 萬 U/g）、Triton X-100 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均屬于分析純。

SC-3610 低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；HH-1 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；SG-5402A 四聯(lián)磁力加熱攪拌器 上海碩光電子科技有限公司；PHS-3CpH 計 上海力辰邦西儀器科技公司；恒溫培養(yǎng)箱 常州澳華儀器有限公司；2300 EnSpireTM多功能酶標儀 美國PerkinElmer公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藜麥蛋白的提取 參考葉灝鐸等[29]方法并稍作改動。將藜麥打磨后的粉末過20 目篩，以料液比1:20 加入定量的藜麥粉末和95%乙醇用于脫脂，在室溫下用磁力攪拌器以1000 r/min 均勻攪拌12 h，烘干獲得脫脂藜麥粉。以1:40 加入定量的脫脂藜麥粉和0.1 mol/L 的NaOH 溶液，在45 ℃恒溫水浴鍋中用玻璃棒不斷攪拌3 h，離心獲取堿提清液。加入0.1 mol/L 的HCl 溶液將上清液的pH 調為4.5，靜置至再無沉淀生成后離心，收集蛋白沉淀，冷凍干燥后稱重，參考楊麗娥等[30]的方法按下式計算粗蛋白得率。粗蛋白含量分析參照GB 5009.5-2016 中《食品中蛋白質的測定》的凱氏定氮法[31]。凍干蛋白放置于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

式中：A 為粗蛋白粉質量，mg；B 為原料總質量，mg。

1.2.2 藜麥蛋白肽的制備 加入適量水于一定量的藜麥蛋白粗提物中，根據(jù)所添加酶調節(jié)溶液相應的pH，使用恒溫水浴進行酶解反應，3 h 后對反應液進行滅酶，靜置冷卻，以4000 r/min 下離心，20 min 后收集酶解上清液，冷凍干燥于后續(xù)實驗使用。

1.2.3 蛋白酶的篩選 配制3%的藜麥蛋白溶液，以酶底比0.3%分別加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶，調節(jié)各自pH 為8.0、6.5、1.5、9.5 和7.0，酶解溫度分別為37、55、37、55 和45 ℃，酶解時間為3 h。以胰脂肪酶抑制率為指標，挑選效果明顯的蛋白酶。

1.2.4 單因素實驗 參考葉灝鐸等[29]方法并稍作改動。選擇最優(yōu)蛋白酶，考察不同因素對胰脂肪酶抑制率的影響，優(yōu)化條件為：酶解時間（0.5、1、2、3、4、5 h）、pH（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0）、酶解溫度（32、37、42、47、52 ℃）、酶底比（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）和底物濃度（1%、2%、3%、4%、5%）。除考察因素外，初始條件不變：底物濃度3%，酶底比為0.3%，pH1.5，酶解溫度37℃。

1.2.5 響應面優(yōu)化試驗 采用Desigh Expert 8.0.6.1軟件建立響應面試驗。在最優(yōu)酶解時間和酶底比的基礎下，探究不同水平的pH、酶解溫度和底物濃度對胰脂肪酶抑制率的影響。設計見表1。

表1 響應面試驗條件Table 1 Response surface experiment conditions

1.2.6 胰脂肪酶抑制率的測定 參照萬林[32]的方法并作出略微改動。分別制備5 mg/mL 胰脂肪酶溶液、緩沖液（pH8.2，0.1 mol/L Tris 緩沖液）和反應底物（1% Triton X-100、5 mmol/L 醋酸鈉水溶液、1 mg/mL月桂酸-4-硝基苯酯）。樣品組依次加入200 μL 樣品溶液、500 μL 底物溶液、400 μL 緩沖液和300 μL 脂肪酶溶液。于37 ℃培養(yǎng)箱靜置2 h，將反應液離心收集上層清液，測定420 nm 波長下的吸光值。按下式計算并求IC50：

式中：A 為樣品組吸光值；B 為無脂肪酶組的吸光值；C 為無樣品組吸光值。

1.2.7 藜麥多肽降血脂活性分析

1.2.7.1 藜麥多肽抑制胰脂肪酶分析 使用磷酸緩沖溶液配制不同樣品溶液濃度（10、50、100、200、500 μg/mL），測定胰脂肪酶抑制率，并計算IC50值。

1.2.7.2 藜麥多肽結合膽酸鹽分析 參考李成龍[33]的方法作出略微改動。將0.01 mol/L HCl 溶液和樣品溶液各取1 mL 在37 ℃反應1 h，調節(jié)pH 至6.3，加入1 mmol/L ?；悄懰徕c（STC）標準溶液和磷酸鹽緩沖液各5 mL，37 ℃反應1 h，離心取2 mL 上層清液和6 mL 60%硫酸溶液在70 ℃恒溫水浴中反應30 min，隨后靜置冷卻。于387 nm 波長處測量每組吸光度。?；悄懰徕c溶液在不同濃度下（0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mmol/L）測定吸光度，制定膽酸鹽標準曲線。以下式計算并求EC50：

式中：A 是膽酸鹽加入量，μmol；B 是膽酸鹽剩余量，μmol。

1.2.7.3 藜麥多肽抑制膽固醇酯酶分析 參照蘇建輝等[34]的方法作出略微改動。制備4.2 μg/mL 的豬胰腺膽固醇酶溶液，將0.1 mol/L NaCl、0.2 mmol/L 4-硝基苯丁酸酯、5.16 mmol/L STC 配制成pH7.0的0.1 mol/L 磷酸鈉緩沖液。以1:2.5:5:5 的比例依次加入底物溶液（4-硝基苯丁酸酯）、樣品溶液、緩沖液和膽固醇酯酶溶液，在25 ℃恒溫水浴鍋中反應5 min，于405 nm 波長下測定每組上清液的吸光值。空白組不加樣品，樣品對照組不加酶液，空白對照組不加酶液和樣品。按下式計算，并求IC50：

式中：A 是空白組吸光值；B 是空白對照組吸光值；C 是樣品組吸光值；D 是樣品對照組吸光值。

1.2.7.4 藜麥多肽抑制黃嘌呤氧化酶分析 參考葉灝鐸等[27]的方法檢測黃嘌呤氧化酶抑制率，并作稍微修改。使用緩沖溶液配制不同濃度的樣品溶液（0.5、1、2、4、8 mg/mL）。以比例1:1:1 先后加入樣品溶液、0.04 U/mL 黃嘌呤氧化酶溶液和0.48 mmol/L黃嘌呤溶液，室溫條件下振蕩混勻30 min，隨后測定波長為290 nm 下各組分上清液的吸光值，隨后計算IC50值。使用下式計算黃嘌呤氧化酶抑制作用：

式中：A 是樣品組吸光值；B 是不加酶組吸光值；C 是不加樣品組吸光值；D 是不加酶和樣品組吸光值。

1.2.8 氨基酸組成分析 參照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》[35]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用EXCEL 2019 軟件處理數(shù)據(jù)；使用SPSS 21.0 軟件進行多組間差異的方差分析（單因素ANOVA檢驗中Duncan 法），其中，不同字母表示相同指標下的差異顯著（P＜0.05）；部分數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8 軟件繪制圖表。數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。每組實驗至少重復3 次后求平均值。

2 結果與分析

2.1 藜麥蛋白的提取

根據(jù)堿提酸沉的原理，經(jīng)過95%乙醇浸沒的藜麥原料除去脂肪后，在堿液中提取藜麥水溶蛋白，將pH 調節(jié)到等電點4.5 后獲得藜麥蛋白沉淀，冷凍干燥后的粗蛋白得率為23.90%，提取過程基本除去多糖等成分[27]。經(jīng)凱氏定氮法測得粗蛋白的質量分數(shù)為55.74%，說明大部分蛋白得到有效提取。根據(jù)以上條件提取的粗蛋白用于后續(xù)實驗。

2.2 單因素實驗

2.2.1 最優(yōu)酶選擇 蛋白酶的底物專一性決定了酶解反應的作用位點，導致不同蛋白酶作用下酶解產(chǎn)物產(chǎn)生不一樣的組成和特性[36]。以胰脂肪酶抑制率作為蛋白酶酶解藜麥蛋白的活性指標，選用五種不同的蛋白酶制備藜麥蛋白水解物。結果由圖1 所示，與其他四種酶相比，胃蛋白酶所得藜麥蛋白多肽的胰脂肪酶抑制率最高，其胰脂肪酶抑制率可達到81.64%±0.46%，說明胃蛋白酶酶解藜麥蛋白所得肽段有較強的抑制胰脂肪酶作用。藜麥蛋白與胃消化酶系進行反應得到的酶解物，隨后酶解物作用于體內(nèi)靶目標才能達到降血脂的作用，因此選擇胃蛋白酶體系可以模擬藜麥蛋白與胃消化酶系的反應[37-38]。后續(xù)將使用胃蛋白酶作為工具酶進行酶解工藝優(yōu)化試驗。

圖1 不同蛋白酶對胰脂肪酶抑制率影響Fig.1 Effect of different proteases on the inhibition rate of pancreatic lipase

2.2.2 酶解時間對藜麥蛋白酶解物抑制效果的影響由圖2 可知，酶解時間的增加會導致酶解物的胰脂肪酶抑制率先上升后下降，酶解1 h 的抑制率達到最大值85.13%±0.83%，反應1 h 后酶活性逐步降低。這可能是因為酶在反應初始階段酶活力較高，與藜麥蛋白的酶切位點較多，獲得的多肽對脂肪酶的抑制效果最佳，而酶解時間越長會導致多肽的活性結構逐步被破壞水解成游離的氨基酸，降低抑制脂肪酶的活性[39]。因此，選擇酶解時間為1 h 進行下一步酶解工藝優(yōu)化試驗。

圖2 酶解時間對胰脂肪酶抑制率影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the inhibition rate of pancreatic lipase

2.2.3 pH 對藜麥蛋白酶解物抑制效果的影響 由圖3 所示，胰脂肪酶抑制率隨pH 的增加呈先升高后降低的趨勢，當pH 為1～1.5 時胰脂肪酶抑制率緩慢增加（P＞0.05），增加至pH2 呈現(xiàn)顯著性下降（P＜0.05），隨后繼續(xù)增大pH 呈現(xiàn)緩慢下降（P＞0.05），其中，在pH1.5 時得到最大值為81.29%±2.02%。胃蛋白酶的最佳酶活力在1.0～2.0 之間，低于或超出該范圍下的pH 會影響酶的三維結構，導致抑制胰脂肪酶的活性下降[40]。因此，后續(xù)將選擇pH1、1.5 和2 進行響應面優(yōu)化。

圖3 pH 對胰脂肪酶抑制率影響Fig.3 Effect of pH on the inhibition rate of pancreatic lipase

2.2.4 酶解溫度對藜麥蛋白酶解物抑制效果的影響如圖4 所示，隨著酶解溫度的變化，多肽酶解物抑制胰脂肪酶的活性先上升后下降（P＜0.05）。當酶解溫度達到42 ℃時，酶解物的胰脂肪酶抑制率為87.77%±1.73%并達到最高值。胃蛋白酶在最適合的溫度下發(fā)揮最大的活性效果，加速分子熱運動使溶劑滲透和溶質擴散，因此藜麥蛋白得到充分的酶解，獲得的酶解物多肽的活性更好[41]。此外，超過最適酶解溫度的范圍時蛋白酶可能因變性而失去了酶活力，酶解得到多肽的數(shù)量下降，導致酶解物抑制胰脂肪酶抑制率的活性也下降[42]。高佩佩[43]的研究中有類似報道，牛乳酪蛋白在不同溫度下進行酶解，當酶解溫度達到40 ℃時胰脂肪酶抑制率達到最大值。因此，選擇37、42 和47 ℃進行下一步的響應面優(yōu)化。

圖4 酶解溫度對胰脂肪酶抑制率影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the inhibition rate of pancreatic lipase

2.2.5 酶底比對藜麥蛋白酶解物抑制效果的影響由圖5 可得知，酶底比含量越高，酶解物抑制胰脂肪酶抑制率水平先增大后減少（P＜0.05），其中酶底比為0.2%時的抑制率達到最大值85.85%±2.89%，與李瑞霞等[44]的實驗結果一致。當酶底比少于0.2%時，酶解反應未飽和，藜麥蛋白得不到充分的酶解；當酶底比大于0.2%后，胃蛋白酶和藜麥蛋白酶解反應過飽和，多余的酶和底物形成物料浪費[45]。因此，將選0.2%的酶底比作為后續(xù)的酶解工藝優(yōu)化試驗。

圖5 酶底比對胰脂肪酶抑制率影響Fig.5 Effect of enzyme to substrate ratio on inhibition rate of pancreatic lipase

2.2.6 底物濃度對藜麥蛋白酶解物抑制效果的影響如圖6 所示，胰脂肪酶抑制率隨底物濃度的增加呈顯著上升趨勢（P＜0.05），在3%達到最大值81.53%±1.53%后逐漸下降，在4%后趨于平衡（P＞0.05）。隨著底物濃度的增加，酶促反應速率先提升后下降，這可能是因為當?shù)孜餄舛瘸^最適合的范圍，會導致多肽的反應位點受阻，并且底物之間發(fā)生相互作用從而降低抑制活性。此外，底物與胃蛋白酶已經(jīng)發(fā)生完全反應，酶促反應受到限制[46]。因此，后續(xù)將選擇底物濃度為2%、3%和4%進行響應面優(yōu)化。

圖6 底物濃度對胰脂肪酶抑制率影響Fig.6 Effect of substrate concentration on the inhibition rate of pancreatic lipase

2.3 響應面優(yōu)化試驗

通過單因素實驗確定因素水平的范圍，響應面擬合方程只在狹窄區(qū)域內(nèi)近似真實情況，因此需先從單因素實驗結果獲取最佳值區(qū)域后才能建立有效的響應面擬合方程[47]。根據(jù)單因素實驗結果，選擇最佳水平中有顯著性差異的因素進行優(yōu)化，自變量分別為酶解溫度、pH 和底物濃度，以胰脂肪酶抑制率為評價指數(shù)，設計3 因素3 水平實驗表（見表2）。

根據(jù)表2 的響應面結果進行多元回歸擬合，獲得酶解溫度（A）、pH（B）和底物濃度（C）與胰脂肪酶抑制率（Y）三個因素的二次多項回歸方程：

Y=90.2+1.23A+1.63B+0.41C+1.31AB-0.16AC-0.98BC-4A2-6.13B2-4.66C2

顯著性檢驗表3 中的F值和P值可以反映胰脂肪酶抑制率與每個因素之間的關聯(lián)性和顯著性，F(xiàn)值的高低反映各因素對實驗模型的影響效果[48]。驗證回歸模型及方程的顯著性，結果顯示F值=25.65，P值=0.0002＜0.01，表明設計模型具有極顯著差異，試驗辦法可信賴度高[49]。在回歸方程中，一次項B 和二次項A2、B2和C2表明差異極顯著（P＜0.01），一次項A 表明差異顯著（P＜0.05），一次項C 和交互項的差異不顯著（P＞0.05），說明酶解溫度和pH 對酶解反應有顯著影響，但底物濃度和交互作用的酶解作用不明顯。回歸模型中F（A）=6.97，F(xiàn)（B）=12.39，F(xiàn)（C）=0.77，據(jù)此表明影響胰脂肪酶抑制率的三種因素順序為pH＞酶解溫度＞底物濃度。其中模型的失擬項F值為3.38，P值為0.1353＞0.05，差異不顯著表明建立的回歸模型受到實驗操作等偶然因素的影響較小，變異系數(shù)CV 值=1.58%＜10%，實驗結果可信賴度高[41]。以上結果表明所建立的響應面實驗具有可靠性，模型的擬合度較高[50]，符合藜麥蛋白酶解物在不同實驗條件下的變化規(guī)律，從而獲得胰脂肪酶抑制率較高下的最優(yōu)藜麥蛋白酶解條件。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

相應等高線圖與曲面圖能反映A、B 或C 三者中的兩個因素之間的相互作用效果[51]。如圖7 所示，酶解溫度、pH 和底物濃度的交互作用對胰脂肪酶抑制率的影響先上升后下降，存在一定范圍內(nèi)的最大值。在一定的底物濃度下，隨著pH 和酶解溫度的變化，途中響應面中部曲線聚集效果明顯，說明藜麥蛋白酶解物抑制胰脂肪酶實驗模型主要由pH和酶解溫度的影響，與表3 中方差分析結果一致。

圖7 酶解溫度、pH 和底物濃度對胰脂肪酶抑制率影響的響應面Fig.7 Response surface of the effect of temperature,pH,and substrate concentration on the inhibition rate of pancreatic lipase

綜合考慮酶解溫度、pH 和底物濃度對胰脂肪酶抑制率的影響，獲得藜麥降血脂肽的最佳制備工藝為酶解溫度42.88 ℃、pH1.57、底物濃度3.03%、酶解時間1 h 和酶底比0.2%，考慮到實際操作，酶解工藝優(yōu)化為：酶解溫度42.9 ℃、pH1.6、底物濃度3.03%、時間1 h 和酶底比0.2%。此時藜麥多肽對胰脂肪酶抑制率為90.43%。對預測的最佳條件進行實驗驗證，得到的藜麥降血脂肽與胰脂肪酶的實際抑制率為90.93%±0.10%，與預測結果值相當接近。

2.4 藜麥多肽活性分析

2.4.1 藜麥多肽對胰脂肪酶的抑制作用 當機體攝入高脂肪食物后，脂肪不能直接吸收，而是通過胰脂肪酶的作用水解得到脂肪酸和3-單?；视王ィM而與膽汁鹽類混合，以膠粒狀進入腸道的脂質細胞和上皮細胞膜的頂部[52]。降低脂肪酶的水解效果可影響腸道對脂肪的同化[53]。如圖8 所示，隨著藜麥多肽濃度的增加，對胰脂肪酶的抑制作用呈上升趨勢。500 μg/mL 時獲得最高值62.53%±0.11%（P＜0.05），并且IC50是7.49 μg/mL（表4）。劉曉靜[54]用響應面優(yōu)化亞麻籽蛋白的酶解工藝并進行分級制備，測得≤1 kDa 的亞麻籽肽的胰脂肪酶抑制作用的IC50為6.20 mg/mL?；羰佬赖萚55]使用聚酰胺柱色譜分離法獲得荷葉的黃酮提取物，檢測提取物的胰脂肪酶抑制作用IC50為0.0076 mg/mL。王建成等[56]將紅松仁蛋白酶解物超濾得到5 種分子質量不同的組分，其中1～5 kDa 組分的胰脂肪酶抑制作用最強（IC50=194.43 μg/mL）。此外，藜麥多肽能抑制胰脂肪酶的活性，推測藜麥多肽影響胰脂肪酶的結構變化，導致胰脂肪酶對底物的分解作用受阻，達到降血脂功效[57]。綜上所述，藜麥多肽還沒有經(jīng)過進一步分離純化就具有較強的胰脂肪酶抑制作用，后續(xù)實驗通過篩選將獲得胰脂肪酶抑制作用更好的單體。

圖8 最佳酶解物對胰脂肪酶抑制率的影響Fig.8 Effect of optimal enzymatic hydrolysate on the inhibition rate of pancreatic lipase

表4 藜麥多肽活性評價Table 4 Evaluation of peptides activity in quinoa

2.4.2 藜麥多肽對膽酸鹽的結合能力 膽固醇經(jīng)過體內(nèi)代謝分解成膽酸鹽，肝腸中膽酸鹽含量下降可促進膽固醇的分解代謝，腸道吸收膽固醇的能力下降，進而促進降血脂的功效[58-59]。如圖9 所示，在0.1～2 mg/mL 范圍內(nèi)，?；悄懰徕c結合率隨濃度的增加而呈現(xiàn)遞增的趨勢。藜麥多肽濃度為2 mg/mL 時，牛磺膽酸鈉結合率達到最大值76.95%±0.37%（P＜0.05），通過SPSS 軟件分析EC50值為0.53 mg/mL（表4）。姜欣洋等[60]用50%的乙醇提取補骨脂，測定提取物的?；悄懰徕c結合作用，EC50達到1.26 mg/mL。宋玲鈺[61]對花生蛋白的酶解工藝進行優(yōu)化，花生蛋白酶解物在10 mg/mL 下?；悄懰猁}抑制率為55.47%。結合相關研究可知，藜麥多肽的膽酸鹽結合能力較強，這可能是因為藜麥多肽與膽酸鹽結合能力顯示藜麥多肽可以發(fā)揮降血脂的可能性，通過阻礙膽酸鹽進入腸道，使膽酸鹽隨排泄物排出，使膽固醇分解成膽酸鹽的水平下降，實現(xiàn)降血脂的效果[58]。

圖9 最佳酶解物對牛磺膽酸鈉結合率的影響Fig.9 Effect of optimal enzymatic hydrolysate on the binding rate of sodium taurocholate

2.4.3 藜麥多肽抑制膽固醇酯酶分析 膽固醇酯酶水解膽固醇酯從而獲得兩種生成物（膽固醇和脂肪酸），膽固醇溶于膽固醇膠束后才會被人體吸收，因此抑制膽固醇酯酶的活性是降低膽固醇的吸收的有效方法[54]。如圖10 所示，一定濃度范圍內(nèi)，藜麥多肽對抑制膽固醇酯酶作用呈現(xiàn)顯著上升的趨勢。在2 μg/mL 時膽固醇酯酶抑制率達到最高值41.18%±0.20%（P＜0.05），活性比香菇多酚[62]（5 mg/mL 下達到40.11%）明顯。其中，藜麥多肽對膽固醇酯酶抑制作用的IC50為4.73 mg/mL（表4），與六堡茶茶褐素[53]（IC50=57.2 mg/mL）和石榴皮多糖[63]（IC50=25.00 mg/mL）相比，藜麥多肽的膽固醇酯酶抑制作用更強。這說明藜麥多肽具有良好的抑制膽固醇酯酶活性，推測藜麥蛋白經(jīng)胃蛋白酶作用獲得的酸性多肽和膽固醇酯酶結合從而降低對底物的催化作用[64-65]。綜上所述，藜麥多肽是具有降血脂功能的潛在天然活性肽。

圖10 最佳酶解物對膽固醇酯酶抑制率的影響Fig.10 Effect of the optimal enzymatic solution on the inhibition rate of cholesterol esterase

2.4.4 藜麥多肽的降尿酸活性分析 黃嘌呤酶會促進體內(nèi)嘌呤代謝，使次黃嘌呤變成黃嘌呤，從而氧化得到尿酸、嘧啶和嘌呤等代謝物質，尿酸在體內(nèi)累積過多會導致通風或腎結石等癥狀[27]。因此，抑制黃嘌呤氧化酶的催化作用，可以降低尿酸積累[66]。如圖11所示，當藜麥蛋白酶解物的濃度處于8 mg/mL 時，黃嘌呤氧化酶抑制效果高達67.96%±0.90%（P＜0.05）。利用SPSS 軟件分析IC50值為5.97 mg/mL，比鰹魚合成肽（ACECD）（IC50=7.23 mg/mL）的抑制效果更好[67]。此外，詹蘇泓等[68]將遠東擬沙丁魚蛋白經(jīng)超濾得到分子質量小于1000 kDa 的酶解物組分，其IC50達到15.89 g/L。實驗結果表明，在最優(yōu)酶解條件下的藜麥降血脂肽也兼具潛在的降尿酸活性。

圖11 最佳酶解物對黃嘌呤氧化酶抑制率的影響Fig.11 Effect of optimal enzymatic hydrolyzates on xanthine oxidase inhibition rate

2.5 氨基酸組成分析

藜麥多肽的氨基酸組成如表5 所示，多肽混合物中谷氨酸占比最高（19.85%），其次為精氨酸和天冬氨酸，含量分別為10.80%和9.58%，研究表明精氨酸在體內(nèi)促進一氧化氮生產(chǎn)增加血流量，從而降低體內(nèi)低密度脂蛋白膽固醇水平[69]。必需氨基酸的含量占總氨基酸的34.23%，接近WHO/FAO 所倡議的36%必需氨基酸值，必需氨基酸的占比越高，說明藜麥蛋白的營養(yǎng)價值越高[70]。酸性氨基酸含量的比例為31.66%，對降血脂活性有積極的作用[71]。疏水性氨基酸的比例為34.11%，研究表明活性肽中含有高比例的疏水性氨基酸有助于降血脂作用[72]。宋淑敏等[73]發(fā)現(xiàn)漢麻降脂肽的5 個肽段都有較高含量的疏水性氨基酸，與結合膽酸鹽的活性可能有密切關系。高含量的疏水性氨基酸對膽汁酸結合的效果發(fā)揮重要的作用，疏水性氨基酸通過疏水相互作用與膽汁酸結合，生成不溶物排出[33,74]。此外，鄭睿[75]從亞麻籽中獲得膽固醇溶解度抑制率最高的4 個肽，其氨基酸序列都具有大量疏水性氨基酸。還有研究指出疏水性氨基酸的含量越大，更有利于侵入脂質膠束中[76]。在降尿酸活性上，李宇娟[77]將鰹魚分離純化得到降尿酸肽，推測多肽發(fā)揮降尿酸作用是因為高比例的疏水性氨基酸能和黃嘌呤氧化酶結合，從而抑制酶活性。結合以上研究，經(jīng)過最優(yōu)酶解工藝的藜麥蛋白活性肽含有豐富的氨基酸，有降血脂和降尿酸的能力。

表5 藜麥多肽的氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of quinoa peptides

3 結論

本研究以藜麥為原料，堿提酸沉法獲取藜麥蛋白，利用胰脂肪酶抑制率評價藜麥蛋白酶解物單因素和響應面試驗中的最優(yōu)工藝參數(shù)：酶解溫度42.9 ℃、pH1.6、底物濃度3.03%、酶解時間1 h 和酶底比0.2%，此條件下獲得的胰脂肪酶抑制率為90.93%±0.10%。初步驗證了藜麥多肽的降血脂和降尿酸活性，結果表明藜麥多肽具有很強的胰脂肪酶抑制作用、?；悄懰徕c結合作用、膽固醇酯酶抑制作用和黃嘌呤氧化酶抑制作用。氨基酸分析表明，藜麥蛋白肽中高比例的必需氨基酸、疏水性氨基酸和酸性氨基酸對活性有一定影響。本研究可提高藜麥的利用價值，同時為藜麥蛋白肽的研究提供新思路。實驗僅從體外實驗研究藜麥多肽的降血脂和降尿酸活性，后續(xù)將會對高活性肽組分進行純化鑒定，測定體內(nèi)降血脂和降血壓活性，并深入探究具體的作用機制。