陳尚里，于福田，沈圓圓，劉小玲

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004）

Fengycin 是一種由芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)狀脂肽分子，包括10 個氨基酸和一個C14～C18脂肪酸鏈，同時具有親水性和親脂性，這也導(dǎo)致其具有出色的生物表面活性劑活性和多種生物活性[1-2]。Fengycin 的疏水性能與微生物細(xì)胞膜的磷脂雙分子層相互作用，改變其結(jié)構(gòu)和通透性，從而殺死病原類微生物[3]。各種病原體，尤其是真菌病害，正在對全球食品安全構(gòu)成越來越大的風(fēng)險，F(xiàn)engycin 具有抗菌范圍廣、安全降解性高和溶血性低等特點，在食品、醫(yī)藥和生物防治等方面擁有廣闊的應(yīng)用前景[4-5]。

目前，F(xiàn)engycin 昂貴的生產(chǎn)成本，是限制其進(jìn)一步商業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。近年來，許多策略被用來提高微生物脂肽類次級代謝物的產(chǎn)量，包括誘變育種、基因工程（啟動子工程、基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析）和發(fā)酵優(yōu)化[6-8]。紫外誘變、常壓室溫等離子體（ARTP）誘變、化學(xué)誘變是用于提高微生物脂肽類次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量簡單且經(jīng)濟(jì)有效的方法[9-10]。誘變育種中物理、化學(xué)因素導(dǎo)致微生物的DNA 堿基損傷，引起三聯(lián)體突變，這些突變可以通過影響蛋白質(zhì)合成對微生物代謝產(chǎn)生重大影響，最終導(dǎo)致次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提升[6,11-13]。Ameri 等[14]報道，在紫外線誘變后，與野生型相比，萎縮芽孢桿菌FSHM2的嗜熱堿性脂肪酶活性增加了2 倍。在微生物誘變選育過程中，單一誘變往往會產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”，采用多種誘變選育相結(jié)合的復(fù)合誘變通常能夠獲得更加高產(chǎn)的菌株，Beacham 等[15]報告的微擬球藻在經(jīng)過EMS 和紫外線誘變后，脂肪酶產(chǎn)量提升了3 倍。通過響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件，也是提高微生物脂肽類次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的有效方法，李光月等[16]通過響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌FHYB201030 的發(fā)酵工藝，使其表面活性素產(chǎn)量提升480 mg/L，較優(yōu)化前提高34.56%。

本文以本實驗團(tuán)隊前期從北部灣紅樹林篩得的芽孢桿菌YA-215 為基礎(chǔ)，通過復(fù)合誘變育種（紫外誘變、ARTP 誘變、化學(xué)誘變），獲取高產(chǎn)Fengycin突變株。采用高通量測序手段對突變株進(jìn)行進(jìn)行掃描圖測序和完成圖測序（掃描圖利用目前使用最廣泛的二代測序平臺Illumina Hiseq×10 平臺，完成圖采用二代+三代即Illumina Hiseq+PacBio 的測序方式），結(jié)合NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，探究突變株UA397的分類地位。在單因素實驗上，通過基于Box-Behnken 模型的響應(yīng)面試驗設(shè)計獲取最優(yōu)發(fā)酵工藝，以期解決Fengycin 產(chǎn)量低的問題，為Fengycin 在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的研究及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定產(chǎn)量基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芽孢桿菌（Bacillus）YA-215 本課題組實驗室分離保藏；LB 肉湯培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，氯化鈉10.0 g 北京索萊寶科技有限公司；LB 瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，氯化鈉10.0 g，瓊脂15 g 北京索萊寶科技有限公司；血球計數(shù)板、乙腈（色譜純）德國默克公司；Fengycin 標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma 公司；；氯化鈉、無水乙醇、蔗糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母提取物、玉米漿粉、（NH4）2SO4、NH4Cl 或NaNO3等其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

SW-CJ-2F 潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SUNRISE 酶標(biāo)儀 帝肯（上海）有限公司；UV-6100 紫外可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；ZQZY-85CS 振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；DHP-9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；GI80TW 高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；CR21N 高速冷凍離心機 日立公司；UV-254 暗箱式紫外透射儀 北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心；ARTP-Ⅱ常壓室溫等離子體誘變儀 無錫源清天木生物科技有限公司；E2695/2998PDA 高效液相色譜（包括2998 二極管陣列檢測器，Empower3 Pro 色譜工作站）美國Waters 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化與菌懸液制備 菌株的活化與菌懸液制備參照孟兆麗等[17]的方法改進(jìn)，取-80 ℃保藏菌種采取平板劃線法接種于LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃、70%濕度的條件下倒置培養(yǎng)24 h。挑取單菌落，接種于100 mL 的LB 肉湯培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃、70%濕度振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h（一級活化）。從一級活化的菌懸液中取1 mL（1%接種量）接種至100 ml 的LB 肉湯培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃、70%濕度振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h（二級活化）。采用稀釋涂布平板法測定二級活化的菌懸液中的活菌數(shù)，用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液濃度至108CFU/mL。

1.2.2 誘變方法

1.2.2.1 紫外誘變方法 紫外誘變的方法參照辛磊等[18]的方法改進(jìn)，打開紫外燈（25 W）照射誘變儀內(nèi)部空間20 min 滅菌后，取芽孢桿菌YA-215 菌懸液（1×108CFU/mL）5 mL 和滅菌轉(zhuǎn)子添加至無菌培養(yǎng)皿（90 mm），開啟磁力攪拌器。使用紫外燈（25 W）照射，照射時間分別為 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 s，照射距離20 cm。將照射后的菌懸液用無菌生理鹽水稀釋107倍，取100 μL 均勻涂布于LB 瓊脂培養(yǎng)基，以照射時間0 s 的為空白對照。避光倒置于恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃，70%培養(yǎng)24 h后計菌落，并繪制致死率曲線（公式1）。挑取單菌落發(fā)酵培養(yǎng)24 h 后，取上清液進(jìn)行Fengycin 產(chǎn)量測定，以Fengycin 產(chǎn)量較出發(fā)菌株YA-215 增大10%的菌株為正突變菌株，計算正突變率（公式2）。選擇最佳正突變率的時間進(jìn)行誘變。

1.2.2.2 ARTP-化學(xué)復(fù)合誘變方法 ARTP-化學(xué)復(fù)合誘變的方法參照楊心萍等[19]的方法改進(jìn)，將紫外誘變得到的高產(chǎn)突變株菌懸液（1×108CFU/mL）10 μL添加至滅菌后的玻璃載片，并均勻涂布。將玻璃載片放入ARTP 誘變儀中，誘變處理時間分別為 0、20、40、60、80、100、120、140、160、180 s。將照射后的菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至107倍，取100 μL 均勻涂布于添加濃度為0.3%的LiCl 溶液的LB 瓊脂培養(yǎng)基，以處理時間0 s 的為空白對照。避光倒置于恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃，70%濕度培養(yǎng)24 h 后計數(shù)菌落，并繪制致死率曲線（公式1）。挑取單菌落發(fā)酵培養(yǎng)24 h 后，取上清液進(jìn)行Fengycin 產(chǎn)量測定，以Fengycin 產(chǎn)量較出發(fā)菌株增大10%的菌株為正突變菌株，計算正突變率（公式2）。選擇最佳正突變率的的時間進(jìn)行誘變。

1.2.3 突變菌株的篩選 對誘變后平板中的菌落編號，挑取單菌落依次接種至10 mL LB 肉湯培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃、70%濕度振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵上清液，4 ℃、8000 r/min 的條件下離心10 min，測定Fengycin 產(chǎn)量，挑選發(fā)酵液中Fengycin產(chǎn)量高的菌株。

1.2.4 Fengycin 產(chǎn)量測定 取1 mL 發(fā)酵上清液，4 ℃、8000 r/min 的條件下離心10 min，采取高效液相色譜檢測，在波長200～350 nm 內(nèi)進(jìn)行紫外吸收掃描，按照Gancel 等[20]的方法，采用C18分析柱，流動相為超純水和乙腈，流速為0.6 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL，采用梯度洗脫方式，40 min 內(nèi)乙腈相由45%上升至55%。

1.2.5 菌株鑒定 菌株的全基因組測序及鑒定交給美吉生物進(jìn)行，測序方式為de novo 測序，結(jié)果在Majorbio 云平臺（www.majorbio.com）在線平臺進(jìn)行分析。

1.2.6 單因素實驗 通過單因素實驗對不同碳源、不同碳源添加量、不同的氮源、不同氮源添加量、不同接種量、不同發(fā)酵溫度、不同發(fā)酵時間等因素進(jìn)行探究，挑選出最優(yōu)發(fā)酵工藝，單因素實驗設(shè)計如表1所示。

1.2.7 Box-Behnken 試驗設(shè)計 在單因素實驗基礎(chǔ)上，以接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）為自變量，以Fengycin 產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken 試驗設(shè)計（BBD），以評估它們對所選突變體產(chǎn)生表面活性素的綜合影響。試驗因素與水平編碼如表2 所示。

表2 Box-Behnken 試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken tests

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS Statistics 26.0 軟件對每一組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），然后進(jìn)行顯著性檢驗，P＜0.05 認(rèn)為具有顯著性差異；采用Mega 6.0 軟件選擇NJ（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；采用Design-Expert 12.0 軟件設(shè)計組合試驗和利用Origin9.8進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變

2.1.1 紫外誘變致死率和正突變率 對芽孢桿菌YA-215 進(jìn)行紫外誘變，紫外誘變致死率和正突變率如圖1 所示?？梢钥闯?，隨著紫外照射時間的延長，芽孢桿菌YA-215 的致死率不斷增加；當(dāng)照射時間達(dá)到110 s 后致死率達(dá)到100%。正突變率隨著紫外照射時間的延長不斷提高，當(dāng)照射時間為90 s 時，正突率變達(dá)到最高點13.2%；當(dāng)紫外照射時間超過90 s后，正突變率迅速下降，這可能是因為為紫外照射劑量過大，對芽孢桿菌的遺傳物質(zhì)造成了不可修復(fù)的損害，這與Yu 等[21]的研究一致，同時致死率迅速增加至100%也證明了這一點。因此本實驗選擇紫外照射時間90 s，致死率90.23%，正突變率13.2%的條件進(jìn)行紫外誘變。

圖1 紫外誘變致死率和正突變率Fig.1 UV mutagenesis lethality and positive mutation rate

2.1.2 紫外誘變篩選 UV 誘變后，共篩選出589 個正突變株，圖2 為Fengycin 產(chǎn)量最高的八個突變株：mutUV99（200.28 mg/L）、mutUV133（204.25 mg/L）、mutUV184（199.35 mg/L）、mutUV197（209.33 mg/L）、mutUV225（215.04 mg/L）、mutUV354（206.77 mg/L）、mutUV472（217.34 mg/L）、mutUV503（221.39 mg/L）與野生型YA-215（113.02 mg/L）的對比。其中突變菌株mutUV503 的Fengycin 產(chǎn)量最高為221.39 mg/L，是野生型YA-215 的1.95 倍；沙見宇等[22]通過紫外誘變選育獲得一株高莫納克林K 菌株，其莫納克林K 產(chǎn)量較紫外誘變前提高了27%。因此選擇突變菌株mutUV503 繼續(xù)進(jìn)行ARTP-LiCl 誘變。

圖2 紫外誘變突變株的Fengycin 產(chǎn)量Fig.2 Fengycin production of UV mutagenesis mutants

2.2 ARTP-化學(xué)誘變

2.2.1 ARTP-化學(xué)誘變致死率和最佳正突變率 對突變株mutUV503 進(jìn)行ARTP-化學(xué)誘變，ARTP-化學(xué)誘變致死率和正突變率如圖3 所示。與紫外誘變相似，隨ARTP 的處理時間的延長，致死率不斷上升，處理時間超過160 s 時，致死率達(dá)100%。ARTP 中的活性能量粒子能夠改變芽孢桿菌的DNA 序列，長時間的ARTP 處理引起基因過度損傷，不能誘發(fā)細(xì)胞的修復(fù)機制[23]。因此本實驗選擇ARTP 處理120 s，致死率91.2%，正突變率11.35%的條件進(jìn)行誘變。

圖3 ARTP-化學(xué)誘變致死率和正突變率Fig.3 ARTP-chemical mutagenesis lethality and positive mutation rate

2.2.2 ARTP-化學(xué)誘變誘變篩選結(jié)果 ARTP-LiCl誘變后共篩選出893 個正突變菌株，圖4 為Fengycin 產(chǎn)量最高的5 個復(fù)合誘變突變株：mutUA397（388.34 mg/L）、mutUA112（355.34 mg/L）、mutUA244（327.78 mg/L）、mutUA362（362.51 mg/L）、mutUA558（370.92 mg/L）與紫外誘變突變株mutUV503（221.39 mg/L）的對比。其中突變體mutUA397 的Fengycin 產(chǎn)量最高為388.34 mg/L，較未經(jīng)ARTP-化學(xué)誘變前提升了75.4%；童凡等[24]通過ARTP 誘變育種，使得產(chǎn)淀粉酶菌株酶活提升了78%。紫外誘變后的突變體經(jīng)ARTP-化學(xué)誘變后，F(xiàn)engycin 產(chǎn)量再次大幅提升，這是由于同一菌株經(jīng)單一誘變處理，會產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”，從而影響細(xì)胞的生長、代謝等，造成誘變效果不理想，因此采用多種手段對菌株進(jìn)行復(fù)合誘變，更容易獲得高產(chǎn)突變株[25]。因此，選擇突變菌株mutUA397（命名為UA397）進(jìn)行下進(jìn)一步的實驗。

圖4 ARTP-化學(xué)誘變突變株Fengycin 產(chǎn)量Fig.4 Fengycin production of ARTP-chemical mutagenesis mutants

2.3 突變體鑒定和基因簇分析

將突變株UA397 基因序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫對比，16S 比對結(jié)果如表3 所示，結(jié)果顯示突變株UA397 與暹羅芽孢桿菌Bacillus siamensis.GCF_000262045.1 最為接近，序列相似度為99.871%，比對覆蓋率100%。通過Mega 6.0 軟件選擇NJ（Neighbor-Joining）法，基于20 株與突變株UA397 在種屬水平上最接近菌種的核心序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖5 所示。根據(jù)系統(tǒng)臨近進(jìn)化樹，突變株UA397 被歸為暹羅芽孢桿菌。

圖5 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree

暹羅芽孢桿菌UA397 的基因組Clusters of Orthologous Groups of Proteins 注釋分析如圖6 所示，突變株UA397 中共有3086 個基因得到了COG注釋，占基因組中81.10%的基因共具有23 個COG功能分類，其中19.9%的基因沒有功能特征。涉及氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝的基因為第一大類，共注釋304個基因；次級代謝產(chǎn)物基因簇分析中發(fā)現(xiàn)Fengycin合成基因簇，如圖7 所示。

圖6 COG 功能注釋Fig.6 COG functional notes

圖7 Fengycin 合成基因簇線性圖譜Fig.7 Linear map of Fengycin synthetic gene cluster

2.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.4.1 單因素實驗

2.4.1.1 不同碳源對Fengycin 產(chǎn)量的影響 圖8 顯示了不同碳源（蔗糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、可溶性淀粉）對暹羅芽孢桿菌UA397 的Fengycin 產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)蔗糖為單一碳源時，F(xiàn)engycin 產(chǎn)量最高；葡萄糖為單一碳源時，F(xiàn)engycin產(chǎn)量最低。相較于葡萄糖等單糖，雙糖和多糖更有利于促進(jìn)暹羅芽孢桿菌UA397 發(fā)酵過程中脂肽類次級代謝產(chǎn)物Fengycin 產(chǎn)量的提高，這也與冒鑫哲等[26]的研究一致，因此選擇蔗糖為最佳碳源。

圖8 不同碳源種類對Fengycin 產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of different carbon sources on the yield of Fengycin

2.4.1.2 碳源添加量對Fengycin 產(chǎn)量的影響 圖9顯示了最佳單一碳源蔗糖不同添加量（10、15、20、25、30、35 g/L）對Fengycin 產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，隨著蔗糖添加量的不斷增加，F(xiàn)engycin 產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)蔗糖添加量為25 g/L 時，獲得了最高的Fengycin 產(chǎn)量435.75 mg/L。當(dāng)蔗糖添加量較低時，不足以滿足暹羅芽孢桿菌UA397 的生長繁殖，會導(dǎo)致Fengycin 產(chǎn)量下降。韓唱等[27]報道了蔗糖添加量過高時，會導(dǎo)致液體培養(yǎng)基中溶氧量不足與滲透壓增大，影響芽孢桿菌的生長和多肽類次級代謝物的產(chǎn)量。因此選擇25 g/L 為最佳碳源添加量。

2.4.1.3 不同氮源對Fengycin 產(chǎn)量的影響 圖10 顯示了不同氮源（蛋白胨、酵母提取物、玉米漿、（NH4）2SO4、NH4Cl、NaNO3）對Fengycin 產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，氮源的種類對Fengycin 產(chǎn)量有極大的影響，當(dāng)?shù)鞍纂俗鳛榈磿r，獲得了最佳的Fengycin 產(chǎn)量438.44 mg/L。蛋白胨、酵母提取物、玉米漿等有機氮源相較于無機氮源更加有利于芽孢桿菌的生長與多肽類次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[27]。因此選擇蛋白胨作為最佳氮源。

2.4.1.4 不同氮源添加量對Fengycin 產(chǎn)量的影響圖11 顯示了最佳氮源蛋白胨不同添加量（10、15、20、25、30、35 g/L）對Fengycin 產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，隨著蛋白胨添加量的增加，F(xiàn)engycin 產(chǎn)量不斷提升。當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿康竭_(dá)30 g/L 以后，隨著蛋白胨添加量的增加，F(xiàn)engycin 產(chǎn)量達(dá)到450.01 mg/L 后不再提升，這也冒鑫哲等[26]的研究一致。出于節(jié)約成本方面的考慮，選擇最佳蛋白胨添加量為30 g/L。

2.4.1.5 不同接種量對Fengycin 產(chǎn)量的影響 圖12顯示了不同接種量（1%、3%、5%、7%、9%）對Fengycin 產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，隨著接種量的增加，F(xiàn)engycin 產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升，后下降的趨勢，在接種量為5%時，F(xiàn)engycin 產(chǎn)量達(dá)到最大值475.35 mg/L。接種量過大時，導(dǎo)致后期發(fā)酵液中菌體濃度過大，菌體利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)生長發(fā)育，最終導(dǎo)致多肽類次級代謝產(chǎn)物Fengycin 產(chǎn)量下降[28-29]。因此響應(yīng)面Box-Behnken 試驗設(shè)計選取的水平為3%、5%、7%。

2.4.1.6 不同發(fā)酵溫度對Fengycin 產(chǎn)量的影響 圖13顯示了不同發(fā)酵溫度（31、34、37、40、43 ℃）對Fengycin 產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，隨著發(fā)酵溫度的增加，F(xiàn)engycin 產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升，后下降的趨勢，在發(fā)酵溫度為37 ℃時，F(xiàn)engycin 產(chǎn)量達(dá)到最大值475.75 mg/L。過高過低的發(fā)酵溫度溫度都不利于菌體的生長繁殖，從而導(dǎo)致多肽類次級代謝產(chǎn)物Fengycin 的產(chǎn)量下降，冒鑫哲等[26]報道了37 ℃為最適宜芽孢桿菌生產(chǎn)的溫度。因此響應(yīng)面Box-Behnken 試驗設(shè)計選取的水平為34、37、40 ℃。

圖13 不同發(fā)酵溫度對Fengycin 產(chǎn)量的影響Fig.13 Effects of different fermentation temperatures on the yield of Fengycin

2.4.1.7 不同發(fā)酵時間對Fengycin 產(chǎn)量的影響 圖14顯示了不同發(fā)酵時間（12、24、36、48、60 h）對暹羅芽孢桿菌UA397 的Fengycin 產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，F(xiàn)engycin 產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升，后下降的趨勢，在發(fā)酵時間為36 h 時，F(xiàn)engycin產(chǎn)量達(dá)到最大值513.64 mg/L。發(fā)酵時間不到24 h時，菌體還在對數(shù)生長期，未能進(jìn)入平穩(wěn)期，因此，F(xiàn)engycin 產(chǎn)量極低；發(fā)酵時間過長，發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)不足，菌體將次級代謝產(chǎn)生的多肽Fengycin 用于生長繁殖，從而導(dǎo)致Fengycin 產(chǎn)量下降[30-31,20]。因此響應(yīng)面Box-Behnken 試驗設(shè)計選取的水平為24、36、48 h。

圖14 不同發(fā)酵時間對Fengycin 產(chǎn)量的影響Fig.14 Effect of different fermentation time on the yield of Fengycin

2.4.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素實驗的結(jié)果的基礎(chǔ)上，以A（接種量）、B（發(fā)酵溫度）、C（發(fā)酵時間）3 個對Fengycin 產(chǎn)量有重要影響的因素為自變量，以Y（Fengycin 產(chǎn)量）為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.6 軟件設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面試驗，Box-Behnken 試驗設(shè)計與結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken experimental design

對A（接種量）、B（發(fā)酵溫度）、C（發(fā)酵時間）3 個單因素進(jìn)行二次多項式回歸擬合，構(gòu)建響應(yīng)值Y（Fengycin 產(chǎn)量）的回歸模型方程表示為：

Y=513.92+2.66A+6.99B+7.07C-2.22AB-12.45AC-0.02BC-33.79A2-14.40B2-22.56C2

對回歸模型進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗如表5 所示，回歸模型F值為43.39（P＜0.0001），極其顯著；失擬項的F值為3（P=0.1583），不顯著，表明該模型擬合良好。確定系數(shù)R2為0.9824，表明Fengycin 產(chǎn)量的預(yù)測值與真實值具有較高的一致性。此外，R2Pre=0.7965 和R2Adj=0.9598，表明該模型具有較好的擬合度和可信度，能夠準(zhǔn)確地預(yù)測響應(yīng)值Fengycin 產(chǎn)量與模型中各個因素之間的關(guān)系。其中接種量（A）對Fengycin 產(chǎn)量影響不顯著（P＞0.05），發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時間（C）對Fengycin 產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01）；交互項AB、BC 對Fengycin 產(chǎn)量影響不顯著（P＞0.05），AC 對Fengycin 產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01）；二次項A2、B2、C2對Fengycin 產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01）。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model

響應(yīng)面三維曲面圖（圖15）可直觀反映A（接種量）、B（發(fā)酵溫度）、C（發(fā)酵時間）各個因素之間的交互作用對Fengycin 產(chǎn)量的影響。通過3D 曲面坡度的變化趨勢，可以直觀地看出各個因素對響應(yīng)值Fengycin 產(chǎn)量的影響，等高線中的最小橢圓的中心點即是Fengycin 產(chǎn)量的最高點。由圖可以看出，3 個因素對Fengycin 產(chǎn)量影響的顯著性順序為C（發(fā)酵時間）＞B（發(fā)酵溫度）＞A（接種量）。

圖15 因素間交互作用對Fengycin 產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.15 Response surface and contour lines of the interaction of various factors on Fengycin production

2.4.3 最佳發(fā)酵條件的確定及驗證 從回歸模型中，預(yù)測到的最佳發(fā)酵條件為，蔗糖25 g/L、蛋白胨30 g/L、接種量5.006%、發(fā)酵溫度37.727 ℃、發(fā)酵時間37.873 h，預(yù)測的Fengycin 產(chǎn)量為515.32 mg/L。為了驗證響應(yīng)面試驗所確定的回歸模型結(jié)果的準(zhǔn)確性，并考慮到實際實驗條件的限制，設(shè)置發(fā)酵條件為：蔗糖25 g/L、蛋白胨30 g/L、接種量5.01%、發(fā)酵溫度37.7 ℃、發(fā)酵時間37.8 h，進(jìn)行驗證試驗。驗證實驗所得Fengycin 產(chǎn)量為517.09±1.78 mg/L。

3 結(jié)論

本研究通過UV 和ARTP-化學(xué)誘變選育相結(jié)合的方法獲得了一株高產(chǎn)的Fengycin 的暹羅芽孢桿菌UA397，其Fengycin 產(chǎn)量是野生型芽孢桿菌YA-215 的3.436 倍。此外通過基于Box-Behnken 模型的響應(yīng)面試驗設(shè)計確定了暹羅芽孢桿菌UA397 的最佳發(fā)酵條件：蔗糖25 g/L、蛋白胨30 g/L、接種量5.01%、發(fā)酵溫度37.7 ℃、發(fā)酵時間37.8 h，在此條件下，F(xiàn)engycin 產(chǎn)量為517.09 mg/L，是出發(fā)菌株在未優(yōu)化發(fā)酵工藝時產(chǎn)量的4.57 倍。本實驗為通過復(fù)合誘變育種和發(fā)酵工藝優(yōu)化提高芽孢桿菌脂肽類次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提供一定的理論基礎(chǔ)，同時也為Fengycin 在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定產(chǎn)量基礎(chǔ)。