黎琳瑩，林以琳，溫耀升，廖彩虎, ，余以剛,

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640；2.韶關(guān)學(xué)院英東食品學(xué)院，廣東韶關(guān) 512005）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，C.perfringens）是肉類食品中最常見的食源性致病菌之一，能形成芽孢和產(chǎn)生多種毒素，對人類和其它動物具有致病性[1-2]。目前，由C.perfringens引起的食物中毒仍是一個嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題，消費者食用了被C.perfringens污染的食品（一般大于6 log CFU/g）后會引發(fā)腹部絞痛、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時可能導(dǎo)致死亡[3]。因此，有效控制肉制品中的C.perfringens是食品工業(yè)領(lǐng)域中亟待解決的問題。

近年來，植物精油由于具有來源廣泛、廣譜抑菌活性、天然低毒等優(yōu)勢而被逐漸開發(fā)應(yīng)用于食品防腐[4-5]。已有研究表明，從羅勒、迷迭香、百里香和茴香中提取的精油對C.perfringens均具有抑菌效應(yīng)[6]，但植物精油對C.perfringens的抑菌機制尚未深入研究。異硫氰酸烯丙酯（Allyl isothiocyanate，AITC）是芥末精油的主要活性成分，廣泛存在于十字花科植物，對金黃色葡萄球菌[7]、大腸桿菌[7-8]、單增李斯特菌[9-10]和沙門氏菌[8,11]等多種病原微生物均具有很強的抑菌效應(yīng)。Alanazi 等[12]研究了四種植物精油成分（肉桂醛、丁香酚、香芹酚和AITC）對C.perfringens芽孢的萌發(fā)、二次生長以及營養(yǎng)細胞的生長抑制作用，結(jié)果表明：在實驗室培養(yǎng)基體系中，四種精油成分均能抑制C.perfringens芽孢的二次生長和營養(yǎng)細胞的生長，其中香芹酚和AITC 的抑制效果最佳；但將精油應(yīng)用于熟制雞肉基質(zhì)時，只有AITC（添加量為0.5%～2.0%）能抑制C.perfringens的生長，而香芹酚即使添加量達到5%也無法抑制C.perfringens的生長。由此可見，AITC 在抑制肉制品中的C.perfringens方面具有廣闊的應(yīng)用前景，然而其對C.perfringens的抑菌機制尚不清楚。因此，本研究嘗試從細胞膜損傷和蛋白質(zhì)代謝兩個方面來探究AITC 對C.perfringens的抑菌作用方式，為有效利用AITC 作為食品工業(yè)的天然抑菌劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

C.perfringensCICC24751 由華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品安全與檢測實驗室保藏；生鮮豬瘦肉 購于廣州市盒馬鮮生超市；AITC（≥99%）山東西亞化學(xué)有限公司；液體硫乙醇酸鹽（Fluid thiolglycollate，F(xiàn)TG）培養(yǎng)基、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（Tryptose sulfite cycloserine，TSC）瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；吐溫80（食品級）鄭州歐尼嘉商貿(mào)有限公司；戊二醛固定液（2.5%）上海麥克林生化科技有限公司；碘化丙啶（Propidium iodide，PI）染液 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；超微量總ATP 酶試劑盒、總蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程研究所。

Ⅱ級A2 型生物安全柜 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；LRH-250A-Ⅱ生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)泰宏醫(yī)療器械有限公司；Cytation5 型多功能酶標(biāo)儀 美國Bio Tek 公司；Phenom Pro 掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscopy，SEM）荷蘭Phenom 公司；Leica DMi8 倒置熒光顯微鏡 德國Leica 公司；GelDoc XR+凝膠成像分析儀 美國Bio-rad 公司；Scientz-IID 型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1C.perfringens懸液的制備 將保存在-80 ℃瓷珠管中的瓷珠轉(zhuǎn)移至含有10 mL FTG 培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)過夜；將所得培養(yǎng)物用接種環(huán)沾取少量穿刺于含有10 mL TSC 培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)過夜后保存在4 ℃。在每次實驗前，用接種環(huán)挑取穿刺管中少量黑色菌落至含有10 mL FTG 培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)至穩(wěn)定期（～1×108CFU/mL），用無菌FTG 培養(yǎng)基或PBS 溶液進行適當(dāng)稀釋，得到所需菌體濃度并用于后續(xù)實驗。

1.2.2 AITC 對C.perfringens最小抑菌濃度（Minimum inhibition concentration，MIC）的測定 采用二倍稀釋法測定AITC 對C.perfringens的MIC[13]。將AITC 溶于10%（m/v）的吐溫-水溶液中，配制成40 μL/mL 母液；在各無菌試管中加入1 mL FTG 培養(yǎng)基，加入1 mL 稀釋的AITC 溶液，充分混勻后吸取1 mL 混合液移至下一試管，以此類推，得到AITC濃度分別為0.4000、0.2000、0.1000、0.0500、0.0250、0.0125 μL/mL 的系列培養(yǎng)體系（編號為1～6）。對照組不含AITC，以等量的吐溫-80 溶液代替（編號為7）。隨后向各試管中加入1 mL 菌懸液（～1×107CFU/mL），將上述試管混合均勻后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h。使用酶標(biāo)儀測定各組試管中菌液的OD600nm值，無明顯細菌生長的最低AITC 濃度即為MIC。

1.2.3 AITC 對C.perfringens生長曲線的影響 參考Wu 等[14]的方法稍作修改以評估AITC 對C.perfringens生長曲線的影響。將AITC 溶液與菌懸液在試管中混合均勻（菌體終濃度～5×106CFU/mL，AITC的終濃度為1 MIC 和2 MIC），空白對照含相同濃度的無水乙醇。將上述試管置于37 ℃培養(yǎng)箱中厭氧孵育24 h，每2 h 取樣測定OD600nm值以監(jiān)測細菌生長情況。

1.2.4 AITC 對C.perfringens細胞形態(tài)的影響 參考Luo 等[15]的方法探究AITC 對C.perfringens細胞形態(tài)的影響。將過夜培養(yǎng)的菌懸液離心（8000 r/min，4 ℃，5 min，后續(xù)離心條件一致），棄去上清，用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，PBS，pH7.4）洗滌兩次并重懸于試管中，加入AITC溶液使其終濃度分別為1 MIC、2 MIC 和 4 MIC。對照組試管中不添加AITC。將上述試管置于37 ℃培養(yǎng)箱中厭氧孵育8 h 后，將樣品離心，用PBS 洗滌兩次并重懸于2.5%（v/v）戊二醛溶液中，置于4 ℃下過夜固定。對固定過的樣品進行洗滌，隨后用不同體積分?jǐn)?shù)（30%、50%、70%、90%、100%）的乙醇水溶液進一步梯度脫水，每次15 min，最后重懸于無水乙醇中。取2 μL 菌懸液滴于蓋玻片，待其自然風(fēng)干后進行噴金處理，在SEM 下觀察細菌形態(tài)。

1.2.5 AITC 對C.perfringens細胞膜完整性的影響按照1.2.4 所述的方法制備菌懸液并加入AITC溶液，得到AITC 終濃度分別為1 MIC、2 MIC 和 4 MIC 的樣品，在37 ℃條件下厭氧處理8 h 后，用生理鹽水清洗兩次，加入10 μg/mL 的PI 染液，室溫下避光染色30 min 后用生理鹽水清洗、重懸。隨后，在熒光顯微鏡下觀察細菌染色情況，并使用酶標(biāo)儀測定樣品的熒光光譜，設(shè)置激發(fā)波長為495 nm，發(fā)射光譜的掃描范圍為550～700 nm，步幅為5 nm。

1.2.6 AITC 對C.perfringens蛋白質(zhì)代謝的影響根據(jù)Cui 等[16]報道方法并進行適當(dāng)修改，以評估AITC 對C.perfringens蛋白質(zhì)代謝的影響。將過夜培養(yǎng)的菌懸液離心棄去上清，用PBS 洗滌后重懸于含有AITC 的PBS 體系中，得到AITC 終濃度分別為1/2 MIC、1 MIC、2 MIC 和4 MIC 的混合體系。對照組樣品中不添加AITC。37 ℃厭氧孵育6 h后，用PBS 清洗菌體并重懸，取40 μL 菌液與10 μL 5×蛋白上樣緩沖溶液混合均勻，沸水浴加熱5 min，冷卻至室溫后離心，收集上清液。取10 μL 上清液加至預(yù)先制備好的凝膠（12%的分離膠和5%的濃縮膠）孔中進行SDS-PAGE 分析，電泳完成后對凝膠染色、脫色，最后使用凝膠成像儀對分離的蛋白條帶進行拍照。

1.2.7 AITC 對C.perfringensATP 酶活性的影響參考Guo 等[17]的方法稍加修改，取過夜培養(yǎng)物離心棄去上清，用生理鹽水洗滌、重懸，加入AITC 溶液使混合體系中AITC 的終濃度分別為1 MIC、2 MIC和4 MIC，置于37 ℃厭氧孵育6 h。隨后，用生理鹽水洗滌菌體兩次并重懸，在冰水浴中進行超聲處理（功率25%，每個循環(huán)超聲4 s，間隔5 s，重復(fù)20 個循環(huán)），隨后按照ATP 酶試劑盒的說明書進行定磷，通過計算得出不同處理組中C.perfringens的ATP酶活性。

1.2.8 AITC 對熟豬肉糜中C.perfringens的抑制效果 參考Zhu 等[13]的方法探究AITC 對熟豬肉糜中C.perfringens的抑制效果。將絞碎的豬肉糜進行高壓滅菌以除去本體菌，分裝成10 g/袋，分別接種C.perfringens并加入AITC 溶液，得到初始菌量約為1×104CFU/g，AITC 終濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%（v/m）的熟肉樣品。對照組不含AITC，以等量的吐溫-水溶液代替。將所有樣品充分混勻之后進行真空包裝，置于37 ℃條件下培養(yǎng)18 h。將肉糜與無菌生理鹽水充分混勻，隨后進行梯度稀釋。取1 mL 合適梯度的樣品與10 mL 無菌TSC 瓊脂混合均勻，待其凝固后，再在平板表面傾注一層TSC 瓊脂以覆蓋下層瓊脂，平板凝固后將培養(yǎng)皿的蓋子敞開，在超凈工作臺中吹干1 h。將制備好的平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)18～24 h，可見C.perfringens在TSC 瓊脂平板上呈典型的黑色菌落，對平板進行菌落計數(shù)和結(jié)果計算[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究實驗均重復(fù)三次取平均值。使用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析，確定均值之間的顯著性差異（P＜0.05），采用Origin 2017 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AITC 對C.perfringens 的MIC 及其對生長曲線的影響

AITC 對C.perfringens的MIC 測定結(jié)果如表1和圖1A 所示。從圖1A 可知，對照組及含有0.0500、0.0250、0.0125 μL/mL 的AITC 的FTG 試管呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，并有氣泡產(chǎn)生，表明有C.perfringens生長；而含有0.4000、0.2000、0.1000 μL/mL 的試管仍保持澄清，表明無C.perfringens生長。同時測定各試管對應(yīng)的OD600nm值（表1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用0.1000 μL/mL AITC 處理時，菌液的OD600nm值與更低濃度的AITC 處理組相比開始發(fā)生顯著變化，表明AITC對C.perfringens的MIC 為0.1000 μL/mL。該結(jié)果與鄧群等[19]報道AITC 對C.perfringens的MIC（800 μL/L）存在一定差異，可能是由于菌株、抑菌劑和培養(yǎng)條件等因素不同。為進一步研究AITC 對C.perfringens的抑菌效果，測定了不同濃度AITC 對C.perfringens生長曲線的影響。如圖1B 所示，空白對照組中的C.perfringens在2～10 h 期間呈指數(shù)型增長，在12 h 時OD600nm值達到最大值，隨后進入細菌生長的穩(wěn)定期。然而，1 MIC 和2 MIC 處理組中C.perfringens的OD600nm值基本不變，表明AITC 能夠有效抑制菌體的增殖。

圖1 AITC 對C.perfringens 的MIC（A）及其對生長曲線（B）的影響Fig.1 MIC of AITC against C.perfringens (A) and the effect of AITC on the growth curve of C.perfringens (B)

表1 不同濃度AITC 處理C.perfringens 24 h 后的OD600nm 值Table 1 OD600nm values of C.perfringens after 24 h treatment with different concentrations of AITC

2.2 AITC 對C.perfringens 細胞微觀形貌的影響

AITC 處理前后的C.perfringens的細胞形態(tài)如圖2 所示?？瞻讓φ战M的菌體呈完整、飽滿的桿狀結(jié)構(gòu)，表面光滑圓潤（圖2A）。當(dāng)用1 MIC 的AITC處理時，部分菌體的細胞膜出現(xiàn)褶皺和凹陷，甚至破裂（圖2B）；在2 MIC 處理組中，菌體的形態(tài)受損更為嚴(yán)重，其表面不再光滑，部分菌體被溶解（圖2C）；隨著AITC 的濃度增至4 MIC，菌體的周圍出現(xiàn)大量粘連物質(zhì)，表明細胞膜完全受損，細胞內(nèi)容物泄出（圖2D）。Turgis 等[11]也觀察到類似的現(xiàn)象，經(jīng)芥末精油處理的大腸桿菌O157:H7 和傷寒沙門氏菌的細胞膜均受損，形態(tài)也發(fā)生改變；Wang 等[20]通過SEM發(fā)現(xiàn)異硫氰酸芐酯可以破壞蠟樣芽孢桿菌和阪崎克羅諾腸桿菌的細胞膜。目前普遍認(rèn)為，造成膜損傷的主要原因是植物精油的疏水性使其更易于與細胞膜相互作用，從而破壞細胞膜原有的結(jié)構(gòu)[21-23]。因此，AITC 處理后細胞微觀形態(tài)的變化，可能是與C.perfringens細胞膜損傷有關(guān)，且損傷程度與AITC 濃度具有高度的依賴性。

圖2 AITC 對C.perfringens 細胞微觀形貌的影響Fig.2 Effect of AITC on cell morphology of C.perfringens

2.3 AITC 對C.perfringens 細胞膜完整性的影響

當(dāng)細胞膜被破壞時，PI 分子可以進入細胞并與核酸結(jié)合，在特定激發(fā)波長下能夠發(fā)出紅色熒光[24]，故通過熒光顯微鏡觀察和熒光光譜掃描研究AITC對C.perfringens細胞膜完整性的影響。圖3A 顯示對照組的C.perfringens幾乎沒有出現(xiàn)紅色熒光，表明細胞膜完整性良好；經(jīng)過AITC 處理后，觀察到明顯的紅色熒光，且呈紅光的細菌數(shù)量隨著AITC 濃度的升高而增加（圖3B～圖3D）。通過測定各組熒光強度值，發(fā)現(xiàn)對照組和AITC 處理組（1 MIC、2 MIC和4 MIC）在620 nm 處的熒光強度分別為9952、10794、14046 和16309（圖3E），與熒光顯微鏡觀察到的結(jié)果相一致。以上結(jié)果表明，AITC 能夠以劑量依賴性的方式破壞C.perfringens細胞膜完整性，該實驗現(xiàn)象與Borges 等[25]的研究結(jié)果相似，這主要歸因于異硫氰酸酯類化合物與細胞膜的相互作用，使得細胞膜通透性增強和完整性破壞，最終導(dǎo)致菌體死亡。

圖3 AITC 對C.perfringens 細胞膜完整性的影響Fig.3 Effect of AITC treatment on the cell membrane integrity of C.perfringens

2.4 AITC 對C.perfringens 蛋白質(zhì)代謝的影響

蛋白質(zhì)是維持活細胞結(jié)構(gòu)及其生存的基本物質(zhì)，參與細菌代謝、物質(zhì)合成等重要生化過程。采用SDS-PAGE 分析AITC 處理后C.perfringens蛋白條帶的變化，結(jié)果如圖4 所示。1/2 MIC 處理組的蛋白條帶與對照組相比顏色變淺，而在1 MIC、2 MIC和4 MIC 處理組中部分條帶幾乎消失，表明AITC能夠影響C.perfringens的蛋白質(zhì)代謝過程。Wang等[26]使用生姜精油處理大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的SDS-PAGE 圖譜中也觀察到類似的實驗現(xiàn)象，其推測可能是精油處理增強了細胞膜的通透性，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)泄漏。結(jié)合上述SEM 和PI 染色實驗結(jié)果，推測AITC 對蛋白質(zhì)的影響可能是兩種作用機制：a.AITC 對細胞膜造成破壞可能促進蛋白外滲，進而降低細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)含量；b.細菌本身蛋白質(zhì)合成受到抑制或降解[27]。這些變化均對細胞的正常代謝活動造成影響。

圖4 AITC 對C.perfringens 蛋白質(zhì)代謝的影響Fig.4 Effect of AITC on protein metabolism of C.perfringens

2.5 AITC 對C.perfringens ATP 酶活性的影響

ATP 酶是一種能夠催化ATP 水解產(chǎn)生能量的蛋白酶，在細胞能量代謝中發(fā)揮著重要作用[28]，當(dāng)生物體受到外界環(huán)境脅迫時，其活性可能隨之發(fā)生改變。本研究測定了不同處理組中C.perfringens的ATP 酶活力變化，結(jié)果表明，1 MIC（1.57±0.01 U/mg prot）和2 MIC（1.48±0.02 U/mg prot）處理組中C.perfringens的 ATP 酶活力與對照組（1.96±0.04 U/mg prot）相比顯著下降（P＜0.05），而在4 MIC 處理組中ATP 酶活性（1.38±0.10 U/mg prot）進一步降低（圖5）。ATP 酶活性的降低會影響細胞的呼吸代謝，進而阻礙細胞生長，甚至導(dǎo)致死亡。根據(jù)SDS-PAGE 的結(jié)果分析，可以推測AITC 通過抑制C.perfringens細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，使得胞內(nèi)酶合成受阻[29]。Wen等[30]研究發(fā)現(xiàn)從辣木種子中提取的異硫氰酸酯顯著降低了單增李斯特菌的ATP 酶活性，并導(dǎo)致胞內(nèi)ATP 含量降低，可能是由于異硫氰酸酯通過影響細胞的糖代謝干擾能量代謝，進而影響細胞分解代謝產(chǎn)物的自身修復(fù)的過程，從而抑制細菌生長。因此，推測AITC 可能通過降低C.perfringens的ATP 酶活力對菌體能量代謝造成干擾，進而發(fā)揮抑菌效果。

圖5 AITC 對C.perfringens 的ATP 酶活力的影響Fig.5 Effect of AITC on ATPase activity of C.perfringens

2.6 AITC 對熟豬肉糜中C.perfringens 的抑制效果

由于肉類體系中成分復(fù)雜，抑菌劑添加量通常需要比在實驗室培養(yǎng)基體系更高才有可能展現(xiàn)出良好的顯示出抑菌效果[21]。圖6 為不同添加量AITC的熟豬肉糜中C.perfringens的增長情況?？梢钥吹?，對照組（不含AITC）中C.perfringens數(shù)量生長繁殖至8.63±0.18 log CFU/g，而添加了0.1%、0.2%、0.3%、0.4%AITC 的熟肉樣品中的C.perfringens數(shù)量顯著減少（P＜0.05），分別為8.03±0.23、7.18±0.24、6.10±0.04、5.28±0.03 log CFU/g。本實驗結(jié)果與其它植物精油對雞胸肉中C.perfringens[13,31]的抑制效果相似，表明AITC 對熟豬肉糜中的C.perfringens具有良好的抑制效果。

圖6 AITC 對熟豬肉糜中C.perfringens 的抑制效果Fig.6 Effect of AITC on the inhibition of C.perfringens in cooked ground pork

3 結(jié)論

本文中生長曲線的實驗結(jié)果表明AITC 對C.perfringens的生長繁殖具有良好的抑制作用。隨后利用SEM、熒光顯微鏡、SDS-PAGE 等手段初步探討其對C.perfringens的抑菌作用方式，結(jié)果表明，AITC 主要作用于C.perfringens的細胞膜結(jié)構(gòu)，使菌體發(fā)生形變，導(dǎo)致細胞膜完整性喪失、通透性增強，進而引起蛋白質(zhì)泄漏，同時能夠顯著降低ATP 酶活性，影響細胞的正常代謝活動，最終抑制菌體生長甚至導(dǎo)致其死亡。在熟豬肉糜體系中，添加低劑量的AITC 就能夠有效抑制C.perfringens的生長?？傊狙芯繛槔肁ITC 抑制肉類食品中的C.perfringens提供了一種可行性方案，后續(xù)應(yīng)針對性研究精油類抑菌劑對肉制品品質(zhì)的影響。