鄒怡茜，陳海強(qiáng),2，潘卓官，周愛梅,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.陽江職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東陽江 529500）

鳙魚也稱大頭魚，是我國主要的淡水魚之一，其頭部重量約占體重的三分之一，富含不飽和脂肪酸，氨基酸組成均衡合理，是一種低脂肪、高蛋白質(zhì)的優(yōu)質(zhì)食物[1]。然而，消費(fèi)者習(xí)慣食用肉質(zhì)鮮美、口感好的魚肉，偏愛吃鮮美的鳙魚頭，不愛購買土腥味較重、口感差的鳙魚魚身，造成鳙魚魚身低值化[2]。將鳙魚魚肉加工制成魚糜及魚糜制品是利用低值化鳙魚魚身資源的有效途徑[3]。近年來，隨著魚糜制品需求量的上升以及海水魚魚糜產(chǎn)量的下降，將產(chǎn)量較大的淡水魚鳙魚制成魚糜制品是鳙魚深加工的重要途徑，可為淡水魚高值化利用提供借鑒。

凝膠化是魚糜制品生產(chǎn)和品質(zhì)控制的關(guān)鍵工藝，只有經(jīng)過充分凝膠化的魚糜制品才有較好的彈性和良好的口感。蛋白質(zhì)凝膠化是蛋白質(zhì)變性和聚集形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的過程，不同方法誘導(dǎo)魚糜蛋白形成凝膠網(wǎng)絡(luò)的機(jī)制可能不同[4]。魚糜凝膠化的傳統(tǒng)方法常采用二段熱處理方法，但是，采用傳統(tǒng)二段熱處理加工魚糜，因熱量由外向內(nèi)傳遞，存在加熱速度慢、物料溫度梯度大、加熱時(shí)間長的問題，易引起凝膠劣化。因此，近年來國內(nèi)外學(xué)者在魚糜加工的研究上，開始廣泛采用超高壓、微波、歐姆加熱等新型技術(shù)來替代傳統(tǒng)熱處理[5]。超高壓是非熱加工技術(shù)，可改善魚糜中生物大分子的結(jié)構(gòu)及分子間和分子內(nèi)的相互作用，增強(qiáng)魚糜凝膠形成能力[6-7]，但在魚糜凝膠特性的改善方面，普遍需要較高壓力處理，才能獲得凝膠特性顯著優(yōu)于二段熱處理的魚糜凝膠，這不利于超高壓技術(shù)在魚糜制品上的推廣應(yīng)用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，超高壓耦合熱處理能改善魚糜凝膠蛋白分子間的交聯(lián)，顯著改善魚糜凝膠特性[8]，可降低壓力和保壓時(shí)間的需求，然而超高壓耦合熱處理過程中魚糜凝膠特性的改善機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步探討。此外，水分是魚糜中含量最高的成分，水分的存在狀態(tài)和含量隨著魚糜凝膠加工過程的變化而改變，并對(duì)凝膠性能的改善起著重要的作用[9]。目前，超高壓耦合傳統(tǒng)二段熱處理不同過程的淡水魚魚糜凝膠特性變化機(jī)制的報(bào)道鮮見，因此探討超高壓耦合熱處理過程中淡水魚魚糜凝膠特性、凝膠蛋白理化特性及水分遷移的變化規(guī)律，有助于更全面闡明魚糜凝膠特性改善機(jī)制。

本研究旨在探討超高壓耦合熱處理過程對(duì)鳙魚魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度、持水性、質(zhì)構(gòu)和白度的影響，并通過分析鳙魚魚糜凝膠的十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）圖譜、分子間作用力、活性巰基、表面疏水性、水分遷移和微觀結(jié)構(gòu)，深入了解超高壓耦合熱加工對(duì)魚糜凝膠特性的作用機(jī)制，為超高壓耦合熱處理在魚糜制品開發(fā)中的應(yīng)用提供理論參考，也為鳙魚的魚糜加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鳙魚 購于廣州市長湴菜市場；食鹽、蔗糖和山梨糖醇 市售食品級(jí)；無水乙醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；β-巰基乙醇 上海麥克林生化科技有限公司；戊二醛 天津歐博凱化工有限公司；脲廣東光華科技股份有限公司；DTNB 上海麥克林生化科技有限公司；十二烷基硫酸鈉 福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；Tris 上海源葉生物科技有限公司；試劑 均為市售分析純。

UHPF-600 MPa 超高壓設(shè)備 中國包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司；DS-1 高速組織搗拌機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；DM-JRJJ 灌腸器 中國德明旗艦店；CT3 質(zhì)構(gòu)儀 美國博勒飛公司；CR-10 色差儀 日本日立公司；Avanti J-E 落地式離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司；Vertex 70 傅立葉變換紅外光譜儀德國布魯克公司；EVO MA15 掃描電子顯微鏡德國卡爾蔡司公司；MesoMR23-040V-I 低場核磁共振儀 蘇州紐邁分析儀器有限公司；FJ200-SH 數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 魚糜的制備：新鮮鳙魚經(jīng)去鱗、去頭、去內(nèi)臟、清洗、采肉、絞肉、漂洗（用5 倍冰水漂洗2 次/10 min，0.15% NaCl 漂洗1 次/10 min）、脫水后加抗凍劑（4%蔗糖、4%山梨糖醇）制成魚糜。

魚糜凝膠的制備：參照周愛梅等[10]的方法并略修改。使用高速組織搗拌機(jī)將適當(dāng)切碎的鳙魚魚糜斬拌1 min，然后添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%（w/w）的食鹽，加冰將魚糜水分含量調(diào)節(jié)至79%左右后再斬拌4 min，進(jìn)而將魚糜填充至直徑30 mm 的腸衣中，制成15 cm 左右的魚腸。魚腸經(jīng)以下不同處理，其中包括不經(jīng)任何處理的樣品（記為0.1P，對(duì)照組），樣品分別經(jīng)單獨(dú)壓力處理（300 MPa/5 min，記為300P）、壓力處理后一段熱處理（300 MPa/5 min+40 ℃/30 min，記為300PS）以及壓力處理后二段熱處理（300 MPa/5 min+40 ℃/30 min+90 ℃/20 min，記為300PSH）。熱處理后的所有樣品迅速放入冰中，冷卻后置于4 ℃冰箱冷藏12 h，進(jìn)行分析測定。

1.2.2 凝膠強(qiáng)度的測定 魚糜凝膠平衡至室溫后切成高25 mm 的圓柱體，使用CT3 質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測定[11]。選用直徑為5 mm 的P/5 探頭，測定參數(shù)：目標(biāo)值15 mm，測試速度1.0 mm/s，觸發(fā)力4.0 g，循環(huán)次數(shù)1 次。測定魚糜凝膠的破斷力（g）、凹陷深度（mm），二者乘積為凝膠強(qiáng)度（g·cm）。

1.2.3 持水性的測定 參考Pan 等[12]的方法稍作修改。把魚糜凝膠樣品切成小塊（0.5 cm×0.5 cm×2 cm），使用濾紙包裹兩層后置于50 mL 離心管內(nèi)，10000×g下4 ℃離心10 min，持水性計(jì)算公式為：

式中，CG 為魚糜凝膠離心前的重量，g；CG′為魚糜凝膠離心后的重量，g。

1.2.4 白度的測定 采用色差儀CR-10 對(duì)切成厚3 mm 的魚糜凝膠圓片進(jìn)行測定，記錄L*值（亮度）、a*值（紅度）、b*值（黃度）[13]，白度計(jì)算公式為：

1.2.5 質(zhì)構(gòu)的測定 參考Maqsood 等[14]的方法略作修改。樣品于室溫下平衡2 h 后，切成高20 mm圓柱體，采用CT3 質(zhì)構(gòu)儀測定魚糜凝膠樣品的質(zhì)構(gòu)特性，選用TA/5 圓柱探頭，預(yù)測試速度2 mm/s，測試速度1.5 mm/s，探頭上升速度為1.5 mm/s，形變量為50%，觸發(fā)力為25 g，循環(huán)次數(shù)為2 次。

1.2.6 SDS-PAGE 分析 參考Chen 等[8]的方法測定魚糜凝膠的SDS-PAGE。稱取3 g 切碎后的魚糜凝膠樣品于27 mL 5%十二烷基硫酸鈉溶液，混合后12000 r/min 均質(zhì)2 min，在85 ℃水浴抽提1 h 使蛋白充分溶出，冷卻后5000×g/4 ℃離心20 min，取上清液。利用SDS-PAGE 測定蛋白質(zhì)分子片段的變化。

1.2.7 傅里葉紅外（FT-IR）分析 將冷凍干燥的魚糜凝膠與溴化鉀按質(zhì)量比1:50 研磨均勻，采用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4000 cm-1范圍內(nèi)以4 cm-1分辨率進(jìn)行掃描[15]。利用蛋白質(zhì)的酰胺I 區(qū)（1600～1700 cm-1）定量分析β-折疊、α-螺旋、無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角的含量。

1.2.8 分子間作用力的測定 參考Gómez-Guillén等[16]的方法。準(zhǔn)確稱取2 g 剪碎后的魚糜凝膠樣品，分別添加10 mL SA（0.05 mol/L NaCl）溶液、SB（0.6 mol/L NaCl）溶液、SC（0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L 尿素）溶液、SD（0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素）溶液和SE（0.6 mol/L NaCl+8 mol/L 尿素+1.5 mol/Lβ-巰基乙醇）溶液，在10000 r/min 下均質(zhì)2 min，4 ℃條件下振蕩1 h，將混合物于20000 r/min冷凍離心10 min，采用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液中蛋白質(zhì)的濃度。分子間作用力以組間上清液蛋白質(zhì)濃度差表示，SB 與SA 之差表示離子鍵；SC 與SB之差表示氫鍵；SD 與SC 之差表示疏水相互作用；SE與SD 之差表示二硫鍵。

1.2.9 活性巰基和表面疏水性的測定 取3 g 魚糜凝膠樣品與磷酸鹽緩沖液（27 mL，100 mmol/L，pH7.6）的混合物在12000 r/min 下均質(zhì)2 min，然后在10000×g 下冷凍離心15 min。收集上清液測定魚糜凝膠的活性巰基（R-SH）和表面疏水性，具體參考Chen 等[11]的方法。

1.2.10 水分遷移的分析 將魚糜凝膠樣品切成直徑2.0 cm、高3.0 cm 的圓柱體，用保鮮膜包住后放入核磁管中，采用磁場強(qiáng)度為0.5 T 的低場核磁共振（LF-NMR）分析儀測定魚糜凝膠的水分遷移率和分布，具體參考Wang 等[17]的方法進(jìn)行測量分析。

1.2.11 微觀結(jié)構(gòu)的觀察 參考Chen 等[8]的方法稍作修改。將魚糜凝膠切成4 mm×4 mm×2 mm 的薄片，在室溫下用2.5%（v/v）戊二醛固定12 h 后，在0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.0）中浸泡10 min，依次用濃度為30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行梯度脫水10 min，冷凍干燥后的樣品進(jìn)行噴金處理，在掃描電鏡（SEM）下觀察（放大倍數(shù)10000 倍）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0 軟件和Origin-pro 9.1 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理及制圖，用Omnic 和Peak Fit 軟件計(jì)算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量，利用TB tools 軟件進(jìn)行聚類熱圖分析。差異顯著性為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同處理過程對(duì)鳙魚魚糜凝膠破斷力、凹陷深度、凝膠強(qiáng)度的影響

凝膠強(qiáng)度是評(píng)價(jià)魚糜制品質(zhì)量的重要參數(shù)，由破斷力與破斷距離乘積得到。由圖1（A）和圖1（B）可知，隨著超高壓耦合熱處理過程的進(jìn)行，鳙魚魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度和破斷力顯著提升（P＜0.05），而凹陷深度則呈下降的趨勢。相對(duì)于0.1P 樣品，300P 樣品的凝膠強(qiáng)度顯著增加（P＜0.05），凝膠強(qiáng)度由72.86 g·cm增加到224.18 g·cm；相對(duì)于300P 樣品，300PS 樣品的凝膠強(qiáng)度也呈現(xiàn)顯著增加（P＜0.05）的趨勢，凝膠強(qiáng)度由224.18 g·cm 到367.61 g·cm。300PSH 樣品的凝膠強(qiáng)度最大，為420.95 g·cm，相對(duì)于0.1P 樣品增加了477.75%。不同處理過程對(duì)鳙魚魚糜的凝膠強(qiáng)度的改善都有貢獻(xiàn)，并且以超高壓耦合熱處理階段對(duì)魚糜凝膠強(qiáng)度的改善效果最好。魚糜凝膠強(qiáng)度的變化與凝膠網(wǎng)絡(luò)微觀結(jié)構(gòu)等因素的變化密切相關(guān)。Liang 等[6]研究表明，超高壓可以顯著提高鳙魚魚糜的凝膠強(qiáng)度，凝膠強(qiáng)度高的魚糜凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)細(xì)密有序，而凝膠強(qiáng)度低的魚糜凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散且空隙大。壓力處理可增強(qiáng)魚糜后續(xù)的熱凝膠化，這與Tan 等[18]的研究結(jié)果一致，300PSH 凝膠強(qiáng)度的增加可能是熱處理誘導(dǎo)凝膠蛋白展開，產(chǎn)生了新的蛋白質(zhì)相互作用力。

圖1 超高壓耦合熱處理過程對(duì)鳙魚魚糜凝膠破斷力、凹陷深度（A）、凝膠強(qiáng)度（B）、持水性（C）和白度（D）的影響Fig.1 Effects of ultra-high pressure coupled heat treatment on the breaking force,deformation (A),gel strength (B),water holding capacity (C) and whiteness (D) of bighead carp surimi gel

2.2 不同處理過程對(duì)鳙魚魚糜凝膠持水性的影響

持水性是蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)截留水分的定量指標(biāo)，可以反映蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的空間結(jié)構(gòu)[19]。超高壓耦合熱處理不同過程對(duì)鳙魚魚糜凝膠持水性的影響如圖1（C）所示，超高壓及超高壓耦合熱處理能顯著提高鳙魚魚糜凝膠的持水性（P＜0.05），300P、300PS、300PSH 魚糜凝膠樣品的持水性分別較0.1P樣品顯著提高13.34%、17.50%、9.00%（P＜0.05）。在不同處理過程中，300PS 處理階段樣品的持水性最好，這與前人[11,20]的研究結(jié)果類似，超高壓耦合熱處理顯著提高魚糜凝膠的持水性。Cando 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，超高壓處理誘導(dǎo)魚糜凝膠蛋白展開，疏水相互作用的增強(qiáng)使蛋白質(zhì)與水結(jié)合更穩(wěn)定，從而提高凝膠與水結(jié)合的能力。加壓后的后續(xù)熱處理可誘導(dǎo)形成持水能力強(qiáng)的有序魚糜凝膠[20]，均勻有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能加強(qiáng)對(duì)水分的束縛，從而提高凝膠強(qiáng)度和持水性[22]。因此，超高壓耦合熱處理有利于魚糜凝膠水分的保持。

2.3 不同處理過程對(duì)鳙魚魚糜凝膠白度的影響

由圖1（D）可知，隨著超高壓耦合熱處理的進(jìn)行，鳙魚魚糜凝膠的白度呈上升的趨勢，各階段魚糜凝膠的白度具有顯著性差異（P＜0.05）。相較于0.1P 樣品，300P、300PS 和300PSH 三個(gè)處理階段分別使魚糜凝膠的白度增加了17.02%、25.99%、43.38%，表明超高壓及后續(xù)的加熱處理都對(duì)鳙魚魚糜凝膠的白度有貢獻(xiàn)，且相較于超高壓處理（300P），熱處理（300PS 和300PSH）對(duì)白度的貢獻(xiàn)更大。這可能是因?yàn)槌邏禾幚碚T導(dǎo)魚糜已形成凝膠，形成致密的微觀結(jié)構(gòu)，這會(huì)影響光散射，導(dǎo)致白度值的變化[11]。此外，加熱導(dǎo)致肌紅蛋白變性，而影響魚糜凝膠色度[23]。300P、300PS 和300PSH 三個(gè)處理過程對(duì)魚糜凝膠白度改善的貢獻(xiàn)度分別為39.23%、20.68%和40.09%，與壓力處理相比（300P），后續(xù)的熱處理對(duì)魚糜白度貢獻(xiàn)占比為60.77%，表明熱處理相對(duì)于超高壓處理會(huì)引起魚糜凝膠更劇烈的變化（例如變性、色素氧化），因此使魚糜凝膠的白度值進(jìn)一步增大[6]，300PSH樣品的白度值（83.60）最大。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Transglutaminase，TGase）的存在也會(huì)影響超高壓處理的魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)。魚糜凝膠的內(nèi)源性TGase經(jīng)超高壓處理后保持較高的活性，隨后的熱處理促進(jìn)內(nèi)源性TGase 誘導(dǎo)的交聯(lián)，有助于魚糜凝膠形成穩(wěn)定有序、保水的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而水分子往往會(huì)截留在較小的孔隙中，細(xì)密緊湊的網(wǎng)絡(luò)能有效地保持凝膠體系中的水分，使魚糜凝膠的水分狀態(tài)變化，進(jìn)而影響魚糜凝膠的折光性和透明度，提高魚糜凝膠的白度[11,23-24]。綜上，超高壓耦合熱處理不同階段對(duì)魚糜凝膠白度的提高均有貢獻(xiàn)。

2.4 不同處理過程對(duì)鳙魚魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

在質(zhì)構(gòu)指標(biāo)中，硬度和彈性一般被用來描述凝膠的質(zhì)量，內(nèi)聚性是分解內(nèi)部結(jié)構(gòu)的能力，膠著性是咀嚼半固體食品至可吞咽狀態(tài)時(shí)所需的能量，而咀嚼性是咀嚼樣本到能夠吞下它所消耗的能量[20,25]，質(zhì)構(gòu)指標(biāo)一定程度上可反映魚糜凝膠的組織結(jié)構(gòu)性質(zhì)。由表1 可知，與0.1P 樣品相比，超高壓及超高壓耦合熱處理可以顯著提高鳙魚魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)特性（P＜0.05）。0.1P 樣品的各項(xiàng)質(zhì)構(gòu)參數(shù)均較低，經(jīng)壓力處理后，300P 樣品的硬度、內(nèi)聚性、彈性、膠著性和咀嚼性均顯著得到提高（P＜0.05），后續(xù)的熱處理則進(jìn)一步提高了鳙魚魚糜凝膠的硬度、膠著性和咀嚼性，其中300PSH 樣品的硬度、彈性、膠著性和咀嚼性獲得最大值，分別較0.1P 樣品提高了765.04%、9.21%、930.76%、1021.86%，而超高壓耦合熱處理對(duì)鳙魚魚糜凝膠內(nèi)聚性、彈性的影響相對(duì)較小。300PSH 樣品的質(zhì)構(gòu)特性遠(yuǎn)優(yōu)于300P 樣品，其中300P、300PS和300PSH 三個(gè)處理過程對(duì)魚糜凝膠硬度改善的貢獻(xiàn)度分別為27.74%、18.76%和53.51%，說明熱處理對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)的影響大于超高壓處理。Buamard 等[20]報(bào)告也指出，超高壓耦合熱處理可顯著提高沙丁魚魚糜凝膠的硬度、內(nèi)聚性、膠著性和咀嚼性。由此可以認(rèn)為，超高壓和熱處理均可改善魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)。

表1 超高壓耦合熱處理不同過程對(duì)鳙魚魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Table 1 Effects of different ultra-high pressure coupled heat treatment processes on the gel texture of bighead carp surimi gel

2.5 不同處理過程對(duì)鳙魚魚糜凝膠SDS-PAGE 的影響

肌球蛋白是肉類食品中最重要的蛋白質(zhì)，具有形成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)的能力，其物理化學(xué)性質(zhì)的改變會(huì)影響凝膠的功能性[26]。圖2 顯示，超高壓耦合熱處理的不同處理階段對(duì)肌球蛋白重鏈（MHC，220 kDa）和肌球蛋白輕鏈（MLC）條帶密度影響較明顯，說明肌球蛋白參與了凝膠的形成。隨著熱處理的進(jìn)行，樣品MHC 條帶密度下降，其中300PSH 樣品的MHC條帶最淺。結(jié)果表明，超高壓耦合熱處理過程可使魚糜樣品內(nèi)部較多的肌球蛋白發(fā)生分子內(nèi)或者分子間交聯(lián)或聚集，而這種交聯(lián)的大分子聚集體無法穿透電泳凝膠，導(dǎo)致MHC 的條帶密度下降，MHC 帶強(qiáng)度減弱伴隨著機(jī)械性能的增加[11,27]。這可能是超高壓處理后，內(nèi)源性TGase 仍保持較高活性，內(nèi)源性TGase誘導(dǎo)MHC 通過ε-（γ-谷氨酰）-賴氨酸鍵發(fā)生共價(jià)交聯(lián)[28]。超高壓有利于蛋白質(zhì)溶解和展開，通過蛋白質(zhì)聚集的方式來誘導(dǎo)凝膠化[29]。壓力和熱處理都會(huì)導(dǎo)致二硫鍵的形成[6]，后續(xù)的熱處理可能通過二硫鍵促進(jìn)蛋白分子內(nèi)及分子間的交聯(lián)，進(jìn)一步促進(jìn)凝膠中發(fā)生分子構(gòu)象變化較大的蛋白質(zhì)聚集，使得300PS 和300PSH 樣品的MHC 條帶強(qiáng)度減弱。超高壓耦合熱處理導(dǎo)致MHC 條帶密度的下降，這與前人的研究結(jié)果相似[11,20,30-31]。魚糜凝膠性能的改善與魚糜凝膠蛋白的變性和聚集有關(guān)，大分子聚集體的形成有助于彈性凝膠體的形成[6]。超高壓耦合熱處理使魚糜肌球蛋白發(fā)生變性，從而改善魚糜凝膠特性。

圖2 魚糜凝膠的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of surimi gel

2.6 不同處理過程對(duì)魚糜凝膠蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)在較強(qiáng)的高壓（300～700 MPa）下發(fā)生變化，包括通過多肽鏈的羰基氧（-CO）和氨基氫（NH-）之間的分子內(nèi)氫鍵穩(wěn)定的α-螺旋結(jié)構(gòu)、由分子間氫鍵組織的β-折疊結(jié)構(gòu)、通常分布在蛋白質(zhì)分子的表面的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[32]。由表2 可知，鳙魚魚糜凝膠蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是β-轉(zhuǎn)角，其次是β-折疊。隨著超高壓耦合熱處理不同階段的進(jìn)行，300P 和300PS 組的α-螺旋結(jié)構(gòu)減少明顯（P＜0.05），較0.1P 樣品分別降低了1.72%、4.18%。β-折疊結(jié)構(gòu)整體呈現(xiàn)增加的趨勢，其中300PSH 組的β-折疊含量獲得最大值，較0.1P 樣品增加了8.87%，這與凝膠強(qiáng)度的變化一致，說明β-折疊對(duì)凝膠強(qiáng)度的提高具有貢獻(xiàn)。超高壓處理有利于誘導(dǎo)β-折疊結(jié)構(gòu)的增加，這與前人研究結(jié)果相似[29,33]。300P 的β-折疊含量較0.1P 樣品增加了3.25%，說明超高壓可誘導(dǎo)較弱的分子內(nèi)氫鍵并增強(qiáng)分子間氫鍵[25]。超高壓處理可導(dǎo)致聚合物鏈之間分子間距的縮短，破壞維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定的化學(xué)鍵的相互作用，暴露埋藏在疏水區(qū)域的氨基酸側(cè)鏈，使蛋白質(zhì)分子重新展開、弱非共價(jià)鍵破壞以及新鍵形成[24]。后續(xù)的熱處理使β-折疊含量的增加，Liu 等[34]研究表明，鰱魚肌球蛋白凝膠的α-螺旋會(huì)隨著熱處理的溫度升高而降低，轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊，這種轉(zhuǎn)變在凝膠化中起重要作用。Bouraoui等[35]在太平洋鱈魚魚糜的熱凝膠過程也觀察到類似的現(xiàn)象（α-螺旋減少與β-折疊的增加）。綜上，超高壓耦合熱處理過程伴隨著魚糜凝膠的β-折疊含量的增加。

表2 超高壓耦合熱處理不同過程對(duì)鳙魚魚糜凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effects of different ultra-high pressure coupled heat treatment processes on the secondary structure of bighead carp surimi gel

2.7 不同處理過程對(duì)魚糜凝膠分子間作用力的影響

離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵等分子力對(duì)魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)的維持起重要作用。由圖3（A）可知，氫鍵是0.1P 樣品的主要分子間作用力，疏水相互作用在300P、300PS、300PSH 凝膠中占主導(dǎo)地位。在超高壓耦合熱處理不同過程中，隨著處理過程的推進(jìn)，魚糜凝膠的離子鍵呈現(xiàn)顯著下降的趨勢（P＜0.05），說明超高壓和熱處理均顯著影響離子鍵的數(shù)量。魚糜凝膠的氫鍵呈先下降后上升的趨勢，疏水相互作用呈整體上升的趨勢，這可能是加熱會(huì)破壞支持α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的鏈內(nèi)氫鍵，同時(shí)增強(qiáng)在β-折疊和天然無序（非周期性）結(jié)構(gòu)中的疏水相互作用[29]。疏水相互作用與凝膠強(qiáng)度的變化大致相同，推測疏水相互作用對(duì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成發(fā)揮重要的作用。二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)特定的分子結(jié)構(gòu)起相關(guān)作用，超高壓耦合熱處理過程中，魚糜凝膠的二硫鍵呈整體上升的趨勢，這與凝膠強(qiáng)度、白度的變化趨勢一致，表明超高壓和熱處理都會(huì)導(dǎo)致二硫鍵的形成。高比例的疏水相互作用往往導(dǎo)致形成牢固的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而二硫鍵的形成有利于凝膠形成有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[32]。300P 樣品的二硫鍵增加可能是由于加壓作用使巰基的間距減小，促進(jìn)凝膠形成二硫鍵[31]。此外，300P、300PS 和300PSH 凝膠的二硫鍵呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，這可能是魚糜蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的展開，β-折疊結(jié)構(gòu)的增加，有利于暴露更多的活性巰基，從而導(dǎo)致巰基氧化為分子間或分子內(nèi)新的二硫鍵。Lu 等[22]研究表明，鳙魚肌原纖維蛋白凝膠蛋白分子之間的離子鍵和氫鍵在加熱后含量顯著下降，加熱使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)適度展開，導(dǎo)致疏水基團(tuán)暴露，并且熱處理有助于魚糜凝膠中二硫鍵的形成。此外，疏水相互作用和二硫鍵含量的變化與凝膠強(qiáng)度的變化相似，說明二者是穩(wěn)定魚糜凝膠結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)作用力，300PSH 組的斷裂力和凝膠強(qiáng)度達(dá)到最高水平，這可能是較高的疏水相互作用和分子間二硫鍵導(dǎo)致的。

圖3 超高壓耦合熱處理不同過程對(duì)魚糜凝膠分子間作用力（A）、活性巰基（B）和表面疏水性（C）的影響Fig.3 Effects of different ultra-high pressure coupled heat treatment processes on the intermolecular forces (A),active sulfhydryl group (B) and surface hydrophobicity (C)of surimi gel

2.8 不同處理過程對(duì)魚糜凝膠活性巰基和表面疏水性的影響

巰基（SH）含量和表面疏水性（S0-ANS）的變化可以反映蛋白質(zhì)分子的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的變化程度[36]。由圖3（B）可知，隨著處理過程的推進(jìn)，鳙魚魚糜凝膠的活性巰基的含量呈現(xiàn)顯著下降的趨勢（P＜0.05），這與二硫鍵含量的變化相反。300P 樣品的活性巰基下降，可能是由于魚糜凝膠蛋白在超高壓的作用下發(fā)生了變性，蛋白構(gòu)象的變化導(dǎo)致內(nèi)部巰基基團(tuán)暴露，而表面活性巰基基團(tuán)易脫氫形成二硫鍵[11]。與300P 樣品相比，300PS 與300PSH 樣品的活性巰基顯著下降，可能是熱處理誘導(dǎo)活性巰基向二硫鍵轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致壓力耦合熱處理的魚糜凝膠中巰基的含量比單獨(dú)壓力處理降低更明顯，這與前人的發(fā)現(xiàn)相似[21,29]。此外，超高壓耦合熱處理可能使魚糜凝膠蛋白變性后重新聚集，活性巰基可能會(huì)迅速重排并嵌入新的聚集體中[24]，活性巰基含量下降。

表面疏水性與分布在蛋白質(zhì)表面的疏水性氨基酸殘基數(shù)量有關(guān)，并顯著影響肌球蛋白的聚集。由圖3（C）可以看出，與0.1P 樣品相比，300P、300PS、300PSH 樣品的表面疏水性（S0-ANS）顯著下降（P＜0.05），且呈依次下降的趨勢，以300PSH 組的S0-ANS最小。研究表明，超高壓會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，使凝膠蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，凝膠蛋白在超高壓作用下進(jìn)一步折疊，使暴露的疏水基團(tuán)通過疏水相互作用更多地埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部，300P 樣品的S0-ANS 減少[19,37]。在超高壓和加熱處理過程中暴露的疏水殘基可能相互靠近并形成聚集體[32]，使魚糜凝膠的表面疏水性隨著超高壓處理、一段熱處理、二段熱處理的推進(jìn)逐漸減少。

2.9 不同處理過程對(duì)鳙魚魚糜水分遷移的影響

凝膠中不同狀態(tài)水分子相對(duì)含量或遷移率發(fā)生變化為水分遷移，水分遷移對(duì)凝膠特性的改善起重要作用，可用低場核磁共振表征樣品中的水分分布及遷移率變化[8]。質(zhì)子橫向弛豫時(shí)間（T2）可以反映水分與凝膠結(jié)合的程度。弛豫時(shí)間越大，表明水與大分子的結(jié)合越松散，水分子的流動(dòng)性越大；反之，弛豫時(shí)間越小，表明水與大分子的結(jié)合越緊密，水分子受到的束縛力越強(qiáng)、流動(dòng)性越弱。其中弛豫時(shí)間T21、T22和T23分別表示魚糜凝膠中的結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水受到的束縛力，三種狀態(tài)水對(duì)應(yīng)的單位質(zhì)量峰面積為A21、A22和A23[33]，兩者揭示了三組水分狀態(tài)的變化。結(jié)合水主要與離子基團(tuán)結(jié)合，不易流動(dòng)水是截留在凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的水，自由水是存于魚糜凝膠結(jié)構(gòu)外的流動(dòng)性較大的水[34,36]。

通過圖4 可知，鳙魚魚糜不同過程中都檢出結(jié)合水和不易流動(dòng)水的弛豫峰，但只有300PSH 檢出自由水的弛豫峰，不同鳙魚魚糜凝膠樣品的水分形態(tài)和水分分布存在一定差異（表3）。與0.1P 樣品對(duì)比，300P 樣品的T21和T22顯著增加，說明超高壓處理可導(dǎo)致結(jié)合水和不易流動(dòng)水受到的束縛力減弱。隨著熱處理過程的進(jìn)行，T21和T22逐漸減小，其中300PSH 的T22顯著降低（P＜0.05），表明熱處理增強(qiáng)了魚糜凝膠對(duì)不易流動(dòng)水的束縛，不易流動(dòng)水的流動(dòng)性減弱。未檢測到0.1P、300P 和300PS 樣品的T23，可能是由于樣品未形成剛性的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，仍然以偏粘性狀態(tài)存在，而粘性糊狀體系中水分子的流動(dòng)性很弱[12]。

表3 超高壓耦合熱處理不同過程對(duì)鳙魚魚糜凝膠水分遷移率和水分分布的影響Table 3 Effects of different ultra-high pressure coupled heat treatment processes on water mobility and water distribution of bighead carp surimi gel

圖4 超高壓耦合熱處理不同過程對(duì)鳙魚魚糜凝膠T2 弛豫時(shí)間的分布的影響Fig.4 Effects of different ultra-high pressure coupled heat treatment processes on the distribution of T2 relaxation time of bighead carp surimi gel

單位質(zhì)量峰面積可用于量化水的相對(duì)含量。由表3 和圖4 可知，相較于0.1P 樣品，300P 和300PS樣品的A21和A22均變化不顯著（P＞0.05），300PSH樣品的A21顯著增加、A22顯著減少（P＜0.05），且300PSH 樣品測出A23，說明超高壓耦合熱處理有助于魚糜凝膠中的不易流動(dòng)水向結(jié)合水和自由水遷移。300PSH 樣品自由水的出現(xiàn)，可能是由于高溫處理在一定程度上破壞了蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)性，導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的部分?jǐn)嗔?，進(jìn)而導(dǎo)致部分水從凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部轉(zhuǎn)移到外部，造成不易流動(dòng)水朝自由水遷移。秦影等[13]研究也表明，超高壓處理的大黃魚魚糜未檢測到自由水組分，而熱處理的魚糜可檢測出自由水，這與本研究結(jié)果類似。

2.10 不同處理過程對(duì)鳙魚魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)凝膠可被視為一種高水分的三維聚合物網(wǎng)絡(luò)，可捕獲或固定水分子[25]。采用SEM 觀察魚糜凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，不同處理過程魚糜凝膠的掃描電鏡圖如圖5 所示。由圖5 可見，未處理（0.1P）的魚糜結(jié)構(gòu)聚集成團(tuán)，孔洞粗大、結(jié)構(gòu)松散且分布不均勻。與0.1P 樣品相比，經(jīng)壓力處理后的魚糜凝膠（300P）結(jié)構(gòu)更緊實(shí)，表面更光滑平整；隨著加熱處理的進(jìn)行，300PS 的凝膠結(jié)構(gòu)進(jìn)一步交聯(lián)，凝膠孔洞增多，形成較均勻有序的凝膠結(jié)構(gòu)；而300PSH 組的魚糜凝膠蛋白充分變性并交聯(lián)，形成密實(shí)均勻有序的結(jié)構(gòu)。超高壓遵循Le Chatelier 原理，魚糜經(jīng)壓力處理后，其化學(xué)反應(yīng)平衡、分子構(gòu)象改變等都將朝著體積減小的方向進(jìn)行，并且超高壓誘導(dǎo)蛋白質(zhì)展開暴露反應(yīng)基團(tuán)，促進(jìn)疏水相互作用，因此300P 魚糜凝膠結(jié)構(gòu)變得更緊實(shí)[32]。Li 等[24]認(rèn)為適度的超高壓處理誘導(dǎo)凝膠網(wǎng)絡(luò)通過蛋白質(zhì)間的相互作用而緊密交聯(lián)，凝膠空隙變小。超高壓耦合熱處理后，300PS 與300PSH 的凝膠結(jié)構(gòu)進(jìn)一步改善，可能是熱處理誘導(dǎo)魚糜凝膠蛋白二硫鍵的適度交聯(lián)以及疏水相互作用的增強(qiáng)，進(jìn)而形成穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)[22]，此外，魚糜熱凝膠化與蛋白質(zhì)的展開和聚集的速度密切相關(guān)，熱處理階段可能誘使魚糜凝膠蛋白質(zhì)展開速度快于聚集速度，則凝膠形成相對(duì)均勻有序的結(jié)構(gòu)[25]，均勻有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能加強(qiáng)對(duì)水分的束縛，從而提高凝膠強(qiáng)度和持水性。

圖5 超高壓耦合熱處理不同過程鳙魚魚糜凝膠的掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscopy of bighead carp surimi gel in different processes of ultra-high pressure coupled heat treatment

2.11 相關(guān)性分析

對(duì)魚糜凝膠特性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及水分分布的指標(biāo)進(jìn)行聚類熱圖和Pearson 相關(guān)性分析，以4 水平24 個(gè)指標(biāo)為變量，結(jié)果如圖6 所示。由圖6 可知，魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度和質(zhì)構(gòu)特性與A21、持水性、二硫鍵、β-折疊為一大聚類，表明這些指標(biāo)具有較大的相關(guān)性。通過表4 可以看出，超高壓耦合熱處理不同過程中，鳙魚魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度與β-折疊極顯著相關(guān)（P＜0.01），與破斷力、彈性、膠著性、咀嚼性、白度、A21顯著正相關(guān)（P＜0.05），與硬度、二硫鍵具有較強(qiáng)的正相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)＞0.8）。其中魚糜凝膠的A21的變化趨勢與凝膠強(qiáng)度結(jié)果一致，二者的相關(guān)系數(shù)為0.957，表明凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中結(jié)合水含量的增加，有助于提高魚糜凝膠強(qiáng)度。凝膠強(qiáng)度與A22、氫鍵、活性巰基、表面疏水性呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），與凹陷深度、離子鍵、β-轉(zhuǎn)角具有較大的負(fù)相關(guān)性（|相關(guān)系數(shù)|＞0.8）。綜上，魚糜凝膠特性的變化受凝膠蛋白理化特性以及水分遷移的影響。推測超高壓耦合熱處理過程使魚糜凝膠蛋白展開，引起β-折疊含量的增加，促進(jìn)魚糜凝膠蛋白及水分子與活性基團(tuán)的相互作用，通過形成均勻有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增強(qiáng)對(duì)水分的束縛，最終改善魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)特性與持水性。

表4 超高壓耦合熱處理不同過程鳙魚魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度和其他指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of gel strength and other indexes of bighead carp surimi gel in different processes of ultra-high pressure coupled heat treatment

圖6 超高壓耦合熱處理不同過程鳙魚凝膠特性與各指標(biāo)之間的聚類熱圖Fig.6 Heat map clustering of bighead carp gel characteristics and indexes in different processes of ultra-high pressure coupled heat treatment

3 結(jié)論

超高壓耦合熱處理不同過程（300 MPa/5 min、300 MPa/5 min+40 ℃/30 min、300 MPa/5 min+40 ℃/30 min+90 ℃/20 min）對(duì)鳙魚魚糜凝膠性能的改善均具有貢獻(xiàn)作用，其中超高壓結(jié)合二段熱處理誘導(dǎo)魚糜凝膠化的效果最佳。研究結(jié)果表明，超高壓耦合熱處理過程中鳙魚魚糜凝膠特性變化的機(jī)制為：超高壓耦合熱處理過程修飾了魚糜凝膠蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，促使α-螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊轉(zhuǎn)變，β-折疊含量增加，暴露活性基團(tuán)，并通過二硫鍵的形成、疏水相互作用以及氫鍵等凝膠蛋白分子間作用力促進(jìn)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與水的相互作用以及MHC 的交聯(lián)，形成致密有序的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可截留更多的不易流動(dòng)水，其中超高壓處理使魚糜凝膠中不易流動(dòng)水向結(jié)合水遷移，熱處理過程增強(qiáng)了凝膠對(duì)結(jié)合水和不易流動(dòng)水束縛，進(jìn)而顯著提升魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度、質(zhì)構(gòu)特性、白度、持水性。并且相關(guān)性分析表明鳙魚魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性的改善與魚糜凝膠蛋白結(jié)構(gòu)的改變、水分存在狀態(tài)顯著相關(guān)。本研究初步闡明超高壓耦合熱處理過程的魚糜凝膠特性改善機(jī)制，而在分子水平或更微觀層面的超高壓耦合熱處理過程魚糜凝膠特性改善的作用機(jī)制，有待進(jìn)一步探討。