李 瑩，鄧吉鋆，姜 雋，李 濤

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院甲狀腺外科（瀘州 646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所·西南醫(yī)科大學(xué)-四川省心血管疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心（瀘州 646000）

膿毒血癥的臨床發(fā)病率和致死率高，發(fā)病年齡范圍廣，是威脅人類健康的重大疾病，一直是急重癥醫(yī)學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)[1-2]。生理環(huán)境下，血管內(nèi)皮細(xì)胞大部分處于靜態(tài)。當(dāng)受到病理性刺激時(shí)，血清中相關(guān)調(diào)節(jié)因子發(fā)生改變，血管內(nèi)皮細(xì)胞活化并參與各種病理生理過程，通過調(diào)節(jié)血管張力、血小板活性、平滑肌細(xì)胞增殖遷移、白細(xì)胞黏附聚集及血栓形成等過程，在各種疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。外泌體能將內(nèi)部的小分子物質(zhì)運(yùn)輸?shù)洁徑蜻h(yuǎn)處細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息通訊。外泌體可能攜帶上千種miRNAs，但在膿毒血癥早期外泌體所分泌的miRNA 方面的研究卻不全面[3-4]。

本研究用細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞，模擬膿毒血癥早期的病理生理環(huán)境。內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體含有多種miRNAs，對(duì)外泌體進(jìn)行小RNA 測序，找出差異性表達(dá)的miRNA，分析miRNA 對(duì)下游靶器官作用的信號(hào)通路，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 雄性大鼠由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，8 周齡，SPF 級(jí)，30 只，每只質(zhì)量約250 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（201903-258）。

1.2 分離和原代培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞

大鼠腹腔注射50 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定在操作臺(tái)上。用75%酒精消毒胸前區(qū)皮膚，用剪刀依次剪開皮膚和肋骨，暴露出胸主動(dòng)脈，剪下動(dòng)脈置于預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，迅速去除動(dòng)脈外膜。沿動(dòng)脈長軸剖開動(dòng)脈，0.1%的膠原酶I 消化動(dòng)脈內(nèi)膜，消化液離心后的沉淀即為內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d后即可獲得原代的內(nèi)皮細(xì)胞，傳4-7代后即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

內(nèi)皮細(xì)胞生長至70%～80%融合度時(shí)，換成無血清的培養(yǎng)基饑餓處理12 h。隨機(jī)將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，更換為完全培養(yǎng)基后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞給予0.5μg/mL的細(xì)菌脂多糖（Millipore Sigma，美國）誘導(dǎo)處理，對(duì)照組給予等體積的PBS，6 h后收集培養(yǎng)基。

1.3 提取外泌體

收集的培養(yǎng)基依次在4℃500×g離心5 min、2 000×g 離心30 min 后，棄沉淀去除細(xì)胞碎片、微泡。用15 mL 離心管收集上清液，在上清中加入8%聚乙二醇6 000，4℃冰箱靜置8 h。4℃10 000×g 離心60 min，棄上清。用PBS輕柔沖洗管壁，重懸外泌體，4℃120 000×g離心60 min，棄上清，去除殘留的聚乙二醇6 000。100μL PBS重懸沉淀即得到外泌體。本研究經(jīng)過差速超速離心后，成功分離了來源于血管內(nèi)皮細(xì)胞的外泌體，在透射電鏡（Hitachi H-9500）下觀察到直徑為40 nm～100 nm的盤狀囊泡[5-6]。

1.4 對(duì)外泌體進(jìn)行測序分析

從內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中提取的外泌體進(jìn)行小RNA 測序（康成生物，上海）。外泌體攜帶miRNA，對(duì)miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用T-test 分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組測序結(jié)果的miRNA 表達(dá)差異。篩選出差異表達(dá)倍數(shù)為>±2 的miRNA，P <0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miRNA 的排序基于P值的大小，以升序排列。

2 結(jié)果

首先體外培養(yǎng)SD大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，給予細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)處理后，收集的培養(yǎng)基經(jīng)過差速超速離心后獲得外泌體。通過高通量測序檢測內(nèi)皮源性外泌體所攜帶的小RNA 表達(dá)，和靜態(tài)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞源性外泌體進(jìn)行比較，找出差異性表達(dá)的miRNA，見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程Figure 1 Experimental procedure

2.1 原代培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞鑒定

免疫熒光顯示培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）。vWF主要是由血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞產(chǎn)生的一種超大分子量的多聚體糖蛋白，是內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)記蛋白。免疫熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果明確了培養(yǎng)的細(xì)胞為原代大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，見圖2A。

2.2 提取外泌體的鑒定

細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞6 h后，收集培養(yǎng)基，通過差速離心法分離獲得外泌體，在透射電鏡下觀察到直徑為40 nm～ 100 nm 的盤狀囊泡，即為細(xì)胞分泌的外泌體，見圖2B。

2.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體測序

將兩組提取的外泌體進(jìn)行測序，和對(duì)照組的內(nèi)皮源性外泌體相比，細(xì)菌脂多糖刺激下產(chǎn)生的內(nèi)皮源性外泌體所攜帶的miRNA 種類和表達(dá)水平均有不同。其中13 個(gè)表達(dá)明顯上調(diào)，5 個(gè)表達(dá)明顯下調(diào)。和正常的內(nèi)皮源性外泌體相比，細(xì)菌脂多糖刺激下產(chǎn)生的內(nèi)皮源性外泌體所攜帶的miRNA 種類和表達(dá)水平均發(fā)生改變。本表列出了差異表達(dá)的miRNA的ID、完整序列、種子（seed）序列、差異表達(dá)情況、差異倍數(shù)和P 值（n=3），見圖3。

大多數(shù)LPS 刺激下內(nèi)皮源性外泌體所攜帶的miRNA 都是對(duì)心肌細(xì)胞生存和修復(fù)有效的，這就可以解釋在膿毒血癥早期，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體可以增加心肌的活性和減少心肌凋亡，見表1。

3 討論

膿毒血癥整體的死亡率為30%，重癥膿毒血癥的死亡率可達(dá)50%，膿毒血癥休克的死亡率則高達(dá)80%，一直以來都是重癥醫(yī)學(xué)的難點(diǎn)和熱點(diǎn)[7]。

內(nèi)皮細(xì)胞是排列在血管、淋巴管和心內(nèi)膜上的單層扁平細(xì)胞，在循環(huán)血液、淋巴液和組織之間形成屏障，控制液體、小分子和白細(xì)胞的流動(dòng)。它們具有調(diào)控血管張力、血液凝固、吞噬異物、血管新生以及參與炎癥反應(yīng)等功能[8-9]。在膿毒血癥中，當(dāng)病原體進(jìn)入機(jī)體循環(huán)后，內(nèi)皮細(xì)胞是最早和病原體及其代謝物接觸的宿主細(xì)胞。

外泌體是一種產(chǎn)生自真核細(xì)胞內(nèi)體的細(xì)胞外囊泡，直徑30～150 nm，在生物體血液、尿液、腦脊液、乳汁和唾液中均有發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞也可將外泌體釋放到培養(yǎng)基中。它們含有起源細(xì)胞的各種分子成分，包括蛋白質(zhì)和RNA（mRNA 和miRNA）。外泌體的含量和攜帶的分子隨起源細(xì)胞變化，從而反應(yīng)起源細(xì)胞的狀態(tài)。檢測外泌體的動(dòng)態(tài)變化可以為疾病的檢測提供很有效的窗口[10-11]。

外泌體具有良好的穩(wěn)定性、靶向性和高效轉(zhuǎn)運(yùn)等優(yōu)勢,其攜帶的mRNA成分可以進(jìn)入靶細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì).外泌體也可以將攜帶的miRNA 運(yùn)送到靶細(xì)胞，靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞中mRNA 及其下游蛋白表達(dá)的水平，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞之間的信息通訊，進(jìn)一步參與多種病理生理學(xué)過程[12]。外泌體參與細(xì)胞間通訊和信號(hào)傳導(dǎo)，但有關(guān)外泌體分泌、攝取、組成以及運(yùn)輸?shù)认嚓P(guān)分子機(jī)制的研究還不夠深入。目前對(duì)外泌體的研究興趣日益增長，無論是研究其功能還是了解對(duì)靶器官的作用信號(hào)通路儼然成為熱點(diǎn)。

miRNA 是一類由19～27 個(gè)核糖核苷酸組成的高度保守的內(nèi)源性非編碼的單鏈RNA，通過抑制mRNA翻譯或者促進(jìn)其降解，從而負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡等過程均發(fā)揮作用[13-14]。在心血管領(lǐng)域，miRNA 的相關(guān)機(jī)制研究也有報(bào)道，miRNA 不僅參與胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的成熟分化，而且在諸多心血管疾病的病理生理過程也發(fā)揮重要作用[15-18]。

本研究利用細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞，分離其產(chǎn)生的外泌體并進(jìn)行miRNA 測序。研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體攜帶的miRNA 表達(dá)發(fā)生明顯改變。其中，miR-221-3p，miR-222-3p，miR-221-5p，miR-155-5p，miR-1247-3p，miR-129-5p，miR-148a-5p，miR-222-5p 的表達(dá)明顯上調(diào)，位于表達(dá)變化顯著的前8 位。通過生物信息學(xué)分析可以推測作用靶基因、預(yù)測功能富集以及可能發(fā)揮作用的信號(hào)通路等。

既往有關(guān)于根據(jù)miRNA 的表達(dá)來判斷臨床相關(guān)疾病發(fā)生的研究報(bào)道[19-20]，但在膿毒血癥早期外泌體所分泌的miRNA 的研究卻不全面[3-4]。本研究推測內(nèi)皮細(xì)胞分泌外泌體攜帶的miRNA 作用靶細(xì)胞是心肌細(xì)胞，顯著高表達(dá)的多個(gè)miRNA 對(duì)心肌有抗凋亡的功能。比如miR-221/222 有提高心肌細(xì)胞的存活，并且也有助于胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化成熟。在缺氧的環(huán)境下，miR-221-5p可以抑制心肌細(xì)胞凋亡減輕心臟受損[21]。大鼠心梗術(shù)后，miR-221-5p 可以增加心肌的存活率和改善心功能[22]。在病毒心肌病的小鼠模型中，miR-148a 可以抑制心肌惡性擴(kuò)張，提高小鼠生存率[23]。在擴(kuò)張性心肌病，miR-148a 可以增強(qiáng)小鼠的心功能，提高動(dòng)物生存率[24]。而miR-155-5p對(duì)心臟有正反兩面的作用效應(yīng)[25-26]。

4 結(jié)論與啟示

本研究結(jié)果顯示，在膿毒癥早期，細(xì)菌脂多糖刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)特異的miRNA，并推測這些miRNA 作用靶點(diǎn)是心肌細(xì)胞。因此我們提出這些差異表達(dá)的miRNA可能對(duì)膿毒癥早期的心血管病理生理學(xué)發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果為下一步臨床防治敗血癥提供了新的靶點(diǎn)和方向。