張玉春，靳永文，王利軍，張國強(qiáng)，張 帆，魏玉輝

蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科（蘭州 730000）

膽汁淤積性肝損傷是一種常見的肝病，發(fā)病率較高，全球約10%～ 20%的人受膽汁淤積癥的困擾[1-2]。膽汁淤積（cholestasis）是由膽汁合成缺陷和/或排泌異常造成膽酸鹽在肝臟中蓄積，長期蓄積可對肝細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌[3]。目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于治療膽汁淤積的藥物僅有熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）和奧貝膽酸（obeticholic acid，OCA）[4-6]，但其療效不盡如人意[7-8]。因此，面對膽汁淤積癥治療藥物療效欠佳的問題，仍需尋找更加安全有效的治療藥物。

中醫(yī)藥在膽汁淤積性肝損傷的治療中療效顯著[9]，其主要方法為清熱燥濕、保肝利膽[10]。消炎利膽丸方是蘭州大學(xué)第一醫(yī)院院內(nèi)中藥制劑，經(jīng)40 年臨床驗(yàn)證，在治療膽石癥、膽囊炎和膽汁淤積方面療效明確、毒副作用小且患者認(rèn)可度高。該方由柴胡、木香、炒枳實(shí)、青皮等8味中藥組成。然而，消炎利膽丸為大蜜丸劑，吞咽困難者或兒童服用不便，且限制了糖尿病患者的使用。為了促進(jìn)消炎利膽丸由院內(nèi)制劑走向市場，讓更多膽石癥、膽囊炎和膽汁淤積患者受益，有必要將其進(jìn)一步開發(fā)為不含糖、便于服用、攜帶方便的醫(yī)院制劑。本課題組為了將消炎利膽丸劑改進(jìn)為疏肝利膽顆粒劑，采用正交設(shè)計(jì)結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)評價(jià)并優(yōu)選疏肝利膽顆粒的提取工藝，為疏肝利膽顆粒的開發(fā)提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器

Agilent1260 型高效液相色譜儀；LT-224S 電子天平（Sartorios 公司，BS 400S）；Varioskan Flash 多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；脫水機(jī)（TP1020型，德國萊卡公司）；石蠟包埋機(jī)（HBM～200LF 型，上海寰熙醫(yī)療器械有限公司）；全自動生化儀（AU400 型，日本Olympus公司生產(chǎn)）；高速離心機(jī)（3K15型，德國Sgima離心機(jī)公司）；核酸蛋白定量儀（Nano Vue 型，美國通用電器醫(yī)療）；PCR 熱循環(huán)儀（Pro Flex 96-well PCR system 型，美國ABI公司）；熒光定量PCR儀（480-480Ⅱ型，羅氏）。

1.2 試藥與試劑

柴胡、枳實(shí)（炒）、木香、菜菔子、青皮、山楂、大黃、芒硝均購自甘肅冠蘭中藥飲片有限公司，藥品生產(chǎn)許可證號：甘20160006，藥品GMP證書：GS0140122，均符合《中國藥典》2020 年版規(guī)定；大黃素對照品，批號110756-200110，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，中國藥品生物制品檢定所；大黃酚對照品，批號110796-200716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，中國藥品生物制品檢定所；RNA 提取試劑盒，批號DP431，天根生化科技有限公司；快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒，批號KR116-02，天根生化科技有限公司；熒光定量試劑，批號32597600，羅氏公司；BCA 試劑盒，批號SL260217，Thermo；α -異硫氰酸萘酚 (alphanaphthylisothiocyanate，ANIT)，N106389，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%；消炎利膽丸劑由蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科提供；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測定試劑盒、堿性磷酸酶（ALP）測定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測定試劑盒和總膽酸鹽（TBAs）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；色譜級乙腈和甲醇均購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；分析純水為蘭州大學(xué)第一醫(yī)院自制，其他試劑均為國產(chǎn)分析純；去離子水（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院自制）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠（5～ 7 周齡，體重20～25 g）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所提供[許可證編號：SCXK（甘）2015-0021]，于室溫20℃～25℃及濕度40%～60%的條件下飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本研究遵守動物實(shí)驗(yàn)倫理要求，并經(jīng)蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)（審批號：LDYYLL2023-227）。

1.4 方法

1.4.1 大黃素和大黃酚含量的測定 色譜條件：Ulitmate XB-C18 色譜柱，乙腈-甲醇-0.1%磷酸（42∶23∶35）為流動相，流速1 mL/min，檢測波長為254 nm。對照品溶液的制備：稱取一定量的大黃素和大黃酚對照品，精密

稱定，加甲醇溶解，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的儲備溶液；供試品溶液的制備：稱取水提物干膏（過四號篩）約0.1g，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲40 min，放冷，再加甲醇定容。取供試品溶液，過濾，精密量取續(xù)濾液10 mL，置燒瓶中，加30 mL 的1 mol/L 鹽酸溶液，20 mL 的三氯甲烷，加熱回流1 h，冷卻后分取三氯甲烷，水層再加三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并提取液，蒸干，加入甲醇復(fù)溶，轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，定溶；陰性對照樣品溶液的制備：按處方比例稱取各味藥材（不含大黃），按制劑提取方法提取，稱取干膏適量，按“供試品溶液的制備”方法制得陰性對照樣品溶液。

1.4.2 大黃素和大黃酚測定方法學(xué)評價(jià) 吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照樣品溶液10μL 進(jìn)樣分析；標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取“1.4.1”項(xiàng)對照品溶液梯度稀釋為0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL，測定；精密度試驗(yàn)：取“1.4.1”項(xiàng)對照品溶液，稀釋至0.16μg/mL，重復(fù)測定6 次；穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液分別于0、2、4、6、8、12、24 h 測定；重復(fù)性試驗(yàn)：稱量水提干膏粉末6份，精密稱定，按照“1.4.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，測定；加樣回收率試驗(yàn)：稱量水提干膏粉末6份，精密稱定，分別對照品溶液（0.16μg/mL）10 mL，按照“1.4.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，測定并記錄大黃素和大黃酚的峰面積，并計(jì)算RSD 值。

1.4.3 水提工藝優(yōu)選 水提工藝單因素考察：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11]對水提工藝影響較大的主要因素為加水量、提取時間、提取次數(shù)。提取時間：選擇提取時間0.5、1.0、1.5 h 進(jìn)行正交試驗(yàn)；加水量：選取加水量為10、8、6 倍量進(jìn)行正交試驗(yàn)；提取次數(shù)：選取提取次數(shù)為1、2、3 次進(jìn)行正交試驗(yàn)；正交試驗(yàn)篩選最佳水提工藝：以得膏率、大黃素和大黃酚轉(zhuǎn)移率為評價(jià)指標(biāo)，以提取時間（A）、加水量（B）和提取次數(shù)（C）為考察因素，應(yīng)用L9(34)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，篩選出最佳的提取工藝；并進(jìn)行3 次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.4.4 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 消炎利膽方水提物制備：以上8 味藥，稱取柴胡36 g，枳實(shí)（炒）30 g，木香30 g，菜菔子30 g，青皮30 g，山楂36 g，大黃30 g，芒硝24 g(后下)，按照最優(yōu)水提工藝制備消炎利膽丸方水提物，置4℃冰箱備用；動物分組與給藥：小鼠飼養(yǎng)1 周后，采用隨機(jī)分組法將小鼠分為6 組，每組10 只，對照組灌胃給予溶媒（純化水）；模型組灌胃給予溶媒（純化水）；低劑量組灌胃給予水提物0.22 g·kg-1·d-1；中劑量組灌胃給予水提物0.45 g·kg-1·d-1；高劑量組灌胃給予水提物0.90 g·kg-1·d-1；丸劑組灌胃給予中劑量消炎利膽丸2.0 g·kg-1·d-1，每天兩次，連續(xù)7 d；給藥第5 d，模型組和給藥組小鼠單次灌胃給予ANIT 50 mg/kg，對照組給于等體積的植物油；末次給藥后，禁食4 h，摘眼球采血，二氧化碳致死，觀察膽囊充盈狀態(tài)，采集肝臟組織，部分組織儲存于-80℃中，部分組織固定于10%甲醛溶液，用于肝臟組織病理學(xué)考察。試劑盒測定血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和總膽汁酸（total bile acid，TBAs）的水平；按照TIANGEN RNA prep Pure 動物總RNA 提取試劑盒的方法測定小鼠肝臟炎癥因子mRNA 水平；采用離心柱法對小鼠肝臟進(jìn)行裂解提取總RNA，并進(jìn)行RNA 反轉(zhuǎn)錄和RNA 擴(kuò)增；以GAPDH 作為內(nèi)參基因計(jì)算各基因的mRNA 表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組均數(shù)差異比較采用ttest雙尾檢驗(yàn)法，P<0.05 和P<0.01 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素和大黃酚測定方法學(xué)評價(jià)

方法學(xué)考察結(jié)果顯示大黃素保留時間為17.16 min，大黃酚保留時間為26.61 min，且與供試品其他組分分離度良好（R ＞1.5），陰性對照品無干擾（見圖1）。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得大黃素和大黃酚線性回歸方程分別為Y＝272287 X -19675，r2＝0.9987 和Y＝447222 X -36583，r2＝0.9982，大黃素和大黃酚在0.08～10.00μg/mL 線性關(guān)系良好。精密度考察結(jié)果表明，大黃素和大黃酚RSD 分別為0.18%和0.31%；穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，大黃素和大黃酚RSD 分別為1.16%和2.24%；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，干膏中大黃素和大黃酚平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.67 mg/g 和0.83 mg/g，RSD 分別為1.09%和2.16%；加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果大黃素和大黃酚的平均回收率分別為98.77%和101.41%，RSD分別為1.33%和2.19%。

圖1 大黃素和大黃酚色譜圖Figure 1 HPLC of emodin and chrysophanol

2.2 正交試驗(yàn)與重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

由正交試驗(yàn)直觀分析表明，各因素不同水平影響由大到小分別為A3＞A2＞A1、B1＞B2＞B3、C3＞C2＞C1。綜合評分表明最佳水提工藝為A3B1C3（結(jié)果見表1、表2），即稱取處方量藥物，加入10倍量水煎煮3 次，每次1.5 h。重復(fù)實(shí)驗(yàn)測得得膏率平均值為25.44%，RSD 為1.41%；大黃素和大黃酚轉(zhuǎn)移率平均值分別為11.56%和12.03%，RSD 分別為1.18%和0.95%。結(jié)果顯示驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果和正交試驗(yàn)篩選的提取工藝評分最大值相近，說明疏肝利膽顆粒水提工藝穩(wěn)定、可靠（見表3）。

表1 水提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal experiment result of water extraction technologies

表2 水提工藝方差分析Table 2 Variance analysis of water extraction technologies

表3 水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Verification test of water extraction technologies

2.3 對小鼠膽囊的形態(tài)學(xué)評估

如圖2 所示，相較于對照組，模型組小鼠膽囊膨大，且膽汁呈墨綠色；與模型組相比，給予水提物低、中、高劑量和消炎利膽丸干預(yù)7 d 后，小鼠膽囊明顯縮小，膽汁顏色轉(zhuǎn)變?yōu)闇\黃色。

圖2 小鼠膽囊形態(tài)學(xué)的變化情況Figure 2 Effects on gallbladder morphology in mice

2.4 對血清生化指標(biāo)水平的影響

結(jié)果如圖3所示，與模型組相比，水提物低劑量組小鼠血清中ALT 水平顯著降低（P<0.05），其中TBA、ALP、AST 和ALT 水平分別下降了30%、28%、38%和46%；水提物中劑量組小鼠血清中TBA、AST 和ALT水平顯著降低（P<0.05），其中TBA、ALP、AST 和ALT分別下降了51%、43%、31%和13%；水提物高劑量組小鼠血清中ALP、AST 和ALT 水平顯著降低（P<0.05），其中TBA、ALP、AST 和ALT 分別下降了40%、44%、36%和48%。與模型組相比，消炎利膽丸劑中劑量組小鼠血清中TBA、AST 和ALT 水平顯著降低（P <0.05），其中TBA、ALP、AST 和ALT 分別下降了54%、42%、56%和59%，水提物中劑量和水提物高劑量與消炎利膽丸劑中劑量對膽汁淤積小鼠血清生化指標(biāo)水平的影響作用相近。

2.5 對小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

如圖4 所示，肝臟組織病理學(xué)表明對照組肝臟組織結(jié)構(gòu)及肝細(xì)胞形態(tài)清晰，模型組肝臟組織可見明顯的肝細(xì)胞嗜酸變、炎癥浸潤和肝竇擴(kuò)張。與模型組相比，水提物低、中和高劑量組的炎癥浸潤、肝竇擴(kuò)張程度明顯減輕，其中以中劑量組效果最明顯；消炎利膽丸劑組肝組織炎癥浸潤、肝竇擴(kuò)張程度減輕。

圖3 小鼠血清生化指標(biāo)變化情況（，n=10）Figure 3 Effect on biochemical index in serum of mice（，n=10）

圖4 肝臟組織病理學(xué)圖片（40×）Figure 4 Effects on gallbladder morphology in mice（40×）

2.6 對炎癥因子mRNA表達(dá)水平的影響

RT-PCR反應(yīng)所需引物序列如表4所示，結(jié)果如圖5 所示，與正常組相比，模型組肝臟組織中的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素6、（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素10、（interleukin-10，IL-10）-和一氧化氮合成酶（inductible nitric oxide synthase，iNOS）mRNA水平顯著升高（P<0.001）；與模型組相比，經(jīng)水提物低劑量治療后，肝臟組織中IL-6 的mRNA 水平顯著降低（P<0.05），IL-1β和iNOS mRNA水平降低但無顯著差異；經(jīng)水提物中劑量治療后，肝臟組織中TNFα、IL-1β和iNOS的mRNA水平顯著降低（P<0.05），IL-6的mRNA 水平降低但無顯著差異；經(jīng)水提取物高劑量治療后，肝臟組織中IL-1β 和iNOS 的mRNA 水平顯著降低（P<0.05），TNFα 和IL-6 mRNA 水平降低但無顯著差異；經(jīng)消炎利膽丸中劑量治療后，肝臟組織中IL-1β 和iNOS 的mRNA 水平顯著降低（P<0.05），IL-6 的mRNA 水平降低但無顯著差異，水提物中劑量和水提物高劑量與消炎利膽丸劑中劑量對膽汁淤積小鼠肝臟組織炎癥因子的基因表達(dá)水平影響作用相近。

表4 RT-PCR反應(yīng)所需引物序列Table 4 Primer sequences in real-time PCR analysis

圖5 小鼠肝臟組織中炎癥因子mRNA表達(dá)水平（，n=3）Figure 5 The mRNA expression levels of inflammatory factors in mouse liver tissue（，n=3）

3 討論

中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，需要選擇合理、客觀、科學(xué)的指標(biāo)反映復(fù)方制劑提取工藝的優(yōu)劣，一般以有效成分及干膏得率作為提取工藝評價(jià)指標(biāo)[12]。本研究選用水提法作為提取方法主要基于中藥水提物更能體現(xiàn)傳統(tǒng)中醫(yī)藥特色，且能保障制劑的安全性和有效性。應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選水提工藝，大黃素和大黃酚轉(zhuǎn)移率越高，提取效率越高，可作為考察提取工藝的主要評價(jià)指標(biāo)，同時，以干膏得率為次要指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)對中藥組方水提工藝進(jìn)行了優(yōu)化篩選，綜合評價(jià)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方法的可行性，并通過重復(fù)性的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)最終確定了最佳水提取工藝為用10 倍藥材量水提取3 次，每次1.5 h，該工藝穩(wěn)定。以往制劑工藝研究中，主要考察提取物中某一個或幾個化學(xué)成分和得膏率的變化對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[13-14]，中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，應(yīng)用單個或某幾個化學(xué)成分為主要評價(jià)指標(biāo)，有可能會導(dǎo)致評價(jià)結(jié)果的局限性，因此，本實(shí)驗(yàn)采取指標(biāo)成分結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)對疏肝利膽顆粒的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。

膽汁淤積癥是由于膽汁久滯、濕熱熾盛所致[15]。膽汁淤積可激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β、IL-6 等細(xì)胞因子，加重肝臟炎癥和損傷[16]。ANIT 是一種化學(xué)性肝毒性藥物，其誘導(dǎo)的小鼠肝內(nèi)膽汁淤性肝損傷與藥物引起的人膽汁淤積性肝損傷發(fā)病機(jī)制相似[17]。血清AST、ALT、ALP 和TBA 水平是評價(jià)膽汁淤積肝損傷的常規(guī)指標(biāo)[18]。ANIT 可引起小鼠血清ALT、AST 和ALP 水平顯著增高[19]。本研究結(jié)果表明，與空白組相比，模型組血清中TBAs、ALP、AST 和ALT 水平顯著升高，肝臟組織中TNFα、IL-1β、IL-6、IL-10 和iNOS 基因表達(dá)水平顯著升高，肝臟病理學(xué)結(jié)果顯示，肝組織灶性區(qū)域肝竇擴(kuò)張淤血和肝小葉內(nèi)可見橋接狀壞死，表明此時小鼠膽汁淤積型肝損傷模型建立成功。膽汁淤積的中藥治療主要以行氣開郁、疏肝利膽、清熱化濕為主。消炎利膽丸方中柴胡具有疏散風(fēng)熱，疏肝解郁，升舉陽氣，其主要成分柴胡皂能通過降低炎癥因子水平和轉(zhuǎn)氨酶水平發(fā)揮保肝作用[20-21]。青皮具有調(diào)節(jié)奧狄氏括約肌，加快膽汁排泄的作用[22]。大黃具有瀉下利膽、抗菌抗炎和保肝的功效[23]。木香具有明顯的利膽和抗炎作用[24]。芒硝可瀉下通便、清火消腫，適用于胃腸道疾病[25]。本實(shí)驗(yàn)采用ANIT 誘導(dǎo)小鼠膽汁淤積模型進(jìn)一步明確消炎利膽丸方水提物在緩解膽汁淤積性肝損傷中的作用。研究結(jié)果顯示，與模型組相比，給予不同劑量水提物和消炎利膽丸中劑量干預(yù)7 d后，小鼠血清生化指標(biāo)水平和肝組織炎癥因子mRNA 水平顯著降低，肝組織病理學(xué)結(jié)果表明水提物可明顯減輕肝組織病理學(xué)損傷程度，表明采用正交實(shí)驗(yàn)篩選的水提工藝獲得的消炎利膽丸方水提物對ANIT 誘導(dǎo)的小鼠膽汁淤積性肝損傷具有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)膽汁酸外排，減輕肝內(nèi)膽汁酸負(fù)荷，恢復(fù)肝內(nèi)膽汁酸穩(wěn)態(tài)有關(guān)。此外，本研究結(jié)果還顯示出通過抑制肝臟TNFα、IL-1β、IL-6、IL-10和iNOS基因表達(dá)能減輕炎癥反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究通過正交實(shí)驗(yàn)篩選出的水提工藝可作為消炎利膽丸方的最優(yōu)水提工藝，且獲得的水提物對ANIT誘導(dǎo)的小鼠膽汁淤積性肝損傷具有明顯保護(hù)作用。消炎利膽丸方劑水提工藝的優(yōu)化有利于疏肝利膽顆粒的開發(fā)，并為膽汁淤積的臨床治療提供了更優(yōu)的治療藥物選擇。