鄧 云，梁權瑞，鄧琳琪

（1.茂名市食品藥品檢驗所，廣東茂名 525000；2.廣東石油化工學院，廣東茂名 525000）

膠原蛋白肽不但具有多肽的一些典型特征[1]（包括分子量小、易吸收，無抗原性、不過敏，安全性高、無副作用，生物活性高、作用準確、載體運輸能力強等） 外，還具備其他多肽沒有的一些優(yōu)點（顯著的美容功效、促進骨骼的生長的修復等），被稱為“皮膚的軟黃金”“膚中之膚、骨中之骨”，廣泛用于化妝品[2-3]、功能性食品[4-5]、醫(yī)用材料及醫(yī)藥中[6-7]。膠原蛋白肽的研究對人類來說是一項非常值得研究的內容[8]，羅非魚含有豐富的膠原蛋白，具有很多陸生動物膠原蛋白所沒有的優(yōu)點，是提取可溶性膠原蛋白既豐富又經(jīng)濟的原料[9]。羅非魚加工過程中會舍棄富含膠原蛋白的魚皮，目前只有一小部分用于制作飼料或者肥料，絕大部分當作廢物丟棄，從而污染環(huán)境，造成了巨大資源浪費。希望能夠為羅非魚皮的膠原蛋白肽提取方法和價值提供一定的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 酶的選擇

胰蛋白酶Trypsin（Parenzyme） 是蛋白酶的一種，是從牛、羊、豬的胰臟提取的一種絲氨酸蛋白水解酶。在脊椎動物中，作為消化酶而起作用。在胰臟是胰蛋白酶的前體胰蛋白酶原被合成后，作為胰液的成分而分泌，受腸激酶的限制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內切酶，能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側切斷，其不僅起消化酶的作用，還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前體，起活化作用，是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的氨基酸排列中，成為不可缺少的工具。胰蛋白酶在生活中也較容易得到，性價比較高。同時，胰蛋白酶的最適pH 值為7.0～8.5，最適溫度為40～70 ℃，上述條件在實驗室均比較容易達到，所以此次羅非魚魚皮明膠酶解選取胰蛋白酶。

1.2 材料和試劑

1.2.1 材料

羅非魚皮明膠液體（質量分數(shù)約為6%），廣東百維生物科技有限公司提供；胰蛋白酶（酶活力為265 U/mg），上海源葉生物科技有限公司提供。

1.2.2 試劑

無水硫酸銅（AR），廣東光華科技股份有限公司提供；三氯乙酸（AR），永華化學科技（江蘇） 有限公司提供；磷酸氫二鈉（AR）、磷酸二氫鈉（AR），天津市永大化學試劑有限公司提供；氫氧化鈉（AR）、酒石酸鉀鈉（AR），天津市大茂化學試劑廠提供；鹽酸（AR），西隴化工股份有限公司提供。

1.3 儀器及設備

UV-2600 型紫外可見分光光度計，島津儀器（江蘇） 有限公司產(chǎn)品；HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品；LGJ-10 型冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；BSS224S 型電子分析天平，北京賽爾多斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；80-2 型電動離心機，天津市永常州澳華儀器有限公司產(chǎn)品；pHS-2F 型pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司產(chǎn)品；1515 GPC 型凝膠色譜柱、717plus 型自動進樣器、Agilent 1260 型示差檢測器，美國Waters 產(chǎn)品。

1.4 試驗流程及操作要點

1.4.1 試驗流程

6%的明膠液→放進冰箱急凍層凍結后→凍結后切塊再放進去凍結→凍結后放進冷凍干燥機干燥→電子天平稱質量→加緩沖液溶解→加入胰蛋白酶反應→取樣加入質量分數(shù)為14%的三氯乙酸溶液終止反應→靜置10 min 后離心→上清液取樣加TCA 和雙縮脲試劑→加氫氧化鈉調節(jié)pH 值→在分光光度計測量吸光度→數(shù)據(jù)處理。

1.4.2 操作要點

（1） 明膠稱質量。選取完全干燥的明膠固體置于干凈的100 mL 燒杯中，準確稱取所需質量的明膠，誤差不要超過0.01 g。

（2） 加緩沖液溶解。以30 mL 作為體系，向稱好干燥明膠的小燒杯中加入緩沖溶液，用保鮮膜蓋住燒杯口，放置于水浴鍋中完全溶解。

（3） 加胰蛋白酶進行反應。加入酶液的第一時間開始計時，在確定的時間點準確對反應溶液進行取樣，并且在第一時間加質量分數(shù)為14%的TCA（三氯乙酸） 終止反應，靜置10 min 沉淀。

（4） 離心。離心后取上清液3 mL 置于一次性杯子中，加入15 mL 的質量分數(shù)14%的TCA 溶液（再次加入TCA 是為了保證體系內沒有受到胰蛋白酶的影響） 和12 mL 現(xiàn)配的雙縮脲試劑。

（5） 測量。用氫氧化鈉溶液把該體系的pH 值調至12.5，并盡快對其進行吸光值測量，要求平行測量3 次后取平均值。

1.5 魚皮明膠酶解條件優(yōu)化

采取單因素試驗，在其他條件不變的情況下，分別研究明膠質量分數(shù)、胰蛋白酶用量、反應環(huán)境pH 值和反應環(huán)境溫度4 個因素對胰蛋白酶酶解羅非魚魚皮酶解的影響。在單因素試驗結果的基礎上，每個因素中選取5 個水平進行響應面法設計。根據(jù)響應面法試驗結果來分析，并找出胰蛋白酶酶解羅非魚魚皮明膠的最優(yōu)條件。

1.5.1 單因素試驗

（1） 最適明膠質量分數(shù)。根據(jù)文獻[10]的方法，取1.5 g 干燥后的明膠置于1 號、2 號燒杯中，2 個燒杯中各加入28 mL pH 值7.4 緩沖液。溶解后向2 號燒杯加入2.0 mg/mL 胰蛋白酶液0.5 mL（對應的就是體系中用量0.033 0 mg/g），混勻后置于60 ℃的溫度水浴鍋中反應，立即計時。反應至10，20，30，40，60，90，120 min 時取樣測量，測量方法參考改良雙縮脲法測量多肽含量。其余明膠質量分數(shù)分別是6%，7%，8%，9%，10%，分別對應的明膠用量為1.8，2.1，2.4，2.7，3.0 g，對應的緩沖液分別是27.7，27.4，27.1，26.8，26.5 mL，測定方法與質量分數(shù)5%明膠一致。

（2） 最適酶用量。明膠質量分數(shù)選取7%，體系確定是30 mL，取2.1 g 干燥后的明膠置于1 號，2 號燒杯中，酶液用量換成液0.1，0.3，0.4，1.2，2.0 mg/mL的胰蛋白酶液0.50 mL（對應體系中的酶用量是0.001 7，0.005 0，0.006 7，0.020 0，0.033 0 mg/g），于60 ℃的溫度水浴鍋中反應，立即計時。反應至10，20，30，40，60，90，120，150，180，210 min時取樣測量，測量方法參考改良雙縮脲法測量多肽含量。

（3） 最適反應溫度。明膠質量分數(shù)選取7%，酶用量選取2.0 mg/mL 胰蛋白酶液0.5 mL，在40 ℃的恒溫水浴鍋中反應，立即計時，反應至10，20，30，40，60，90，120，150，190 min 時取樣測量，測量方法參考2.6.3 的改良雙縮脲法測量多肽含量。其余反應溫度分別是50，60，70，80 ℃，測定方法同測40 ℃的方法一致。

（4） 最適反應pH 值。明膠質量分數(shù)選取7%，酶用量選取2.0 mg/mL 胰蛋白酶液0.5 mL，反應溫度選取40 ℃，換用pH 值（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）緩沖液，于最適溫度下反應，立即計時，反應至10，20，30，40，60，90，120，150，190，230 min 時取樣測量，測量方法參考改良雙縮脲法測量多肽含量。

1.5.2 響應面法優(yōu)化試驗

由于單因素試驗數(shù)據(jù)分析得到，明膠質量分數(shù)、反應溫度、酶用量和緩沖溶液pH 值這4 個因素對明膠酶解后的肽得率的影響較明顯。故選取明膠質量分數(shù)、反應溫度、酶用量、緩沖溶液pH 值及不同反應時間這5 個因素，利用Design Expert 10.0 這個軟件進行五因素五水平的響應面法設計。

1.6 羅非魚魚皮明膠分子量分布的檢測

1.6.1 測定方法

采用凝膠滲透色譜（GPC） 測定。流動相為0.1 mol/L 的KNO3水溶液，凝膠柱為WATERS Ultrahydrogel 500 column（7.8 mm×300 mm）、WATERS Ultrahydrogel 250 column（7.8 mm×300 mm） 和WATERS Ultrahydrogel 120 column（7.8 mm×300 mm）串聯(lián)合用，流速為1.0 mL/min，Agilent 1260 示差檢測器，柱溫40 ℃。

標準品：已知分子量（Mw） 的聚乙二醇，分子量分別為152 000，78 300，44 000，32 600，25 300，20 600，12 600，7 130，4 290，1 960，1 400，430，202 Da。

1.6.2 標準曲線的制備

以流動相為溶劑將其溶解為2 mg/mL 的標準溶液，用0.45 μm 的膜過濾后，用高效凝膠色譜（GPC） 系統(tǒng)進行檢驗分析，OPEN LAB CDS 數(shù)據(jù)處理軟件處理數(shù)據(jù)。以標準品相對分子質量的對數(shù)（LogMw） 對洗脫體積（V） 建立回歸方程，即得到標準曲線。

1.6.3 樣品測試

將明膠樣品用流動相溶解，終質量濃度為2～3 mg/mL，0.45 μm 的膜過濾后，進樣量40 μL，運行時間40 min，記錄圖譜，在OPEN LAB CDS 數(shù)據(jù)處理軟件中用標準曲線對樣品進行積分，可得明膠樣品的分子量大小及分布。

1.7 肽得率的計算

1.7.1 雙縮脲溶液的配制

取10%氫氧化鈉溶液300 mL，另取3.0 g 無水硫酸銅和6.4 g 酒石酸鉀鈉加蒸餾水溶解定容至500 mL，在攪拌中加入氫氧化鈉，后定容至1 000 mL。現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.7.2 明膠酶解肽的標準曲線的繪制

用標稱分子量為3 kDa 的羅非魚魚皮膠原蛋白肽配置成5 mg/mL 的肽液，分別取1.2，2.4，3.6，4.8，6.0 mL 于50 mL 的燒杯中，再分別加入8.8，7.6，6.4，5.2，4.0 mL 質量分數(shù)14%的TCA 溶液，然后加入8 mL 雙縮脲試劑，使體系肽的質量濃度為0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 mg/mL（控制多肽和TCA 溶液的總體積與雙縮脲溶液體積比為3∶2）。將溶液的酸堿度調至pH 值至10.5，立即于波長545 nm 處測定吸光度，以肽的質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

參比液為空白溶液，做3 組平行試驗。按照同樣的方法分別測出溶液pH 值為11.0，11.5，12.0，12.5，13.0，13.5 的對應溶液的回歸方程。

根據(jù)回歸方程的相關系數(shù)的平方和試驗測得數(shù)據(jù)來選取最后的溶液pH 值，通過試驗數(shù)據(jù)和相關系數(shù)R2的大小，最后選取的是溶液pH 值是12.5，回歸方程是：

式中：A——樣品吸光度。

1.7.3 改良雙縮脲法測量多肽含量[11]

干燥的明膠經(jīng)過加入緩沖液溶解，再加入指定的胰蛋白酶液經(jīng)過一定的時間反應后，取出的1 mL樣液于離心管中，加入質量分數(shù)為14%的三氯乙酸溶液10 mL 后，靜置10 min 后以轉速3 250 r/min離心15 min，直至沉淀完全。取上清液3 mL 加入100 mL 燒杯中，加入TCA 溶液15 mL，加入雙縮脲試劑10 mL，在這時要提前半個小時去預熱分光光度計，然后對溶液進行調pH 值至12.50，并立即于波長545 處測吸光度。要求每次都要重復試驗3 次，取平均值。

1.7.4 明膠酶解后肽得率的計算

式中：A——樣品吸光度；

31.8——體系溶液30 mL 中經(jīng)過調完pH 值后的體積，mL；

11——1 mL 樣液+10 mL 的14%的TCA，mL；

M——干燥明膠的質量，g。

2 結果與分析

2.1 明膠分子量分布結果

羅非魚皮明膠凝膠色譜圖見圖1，羅非魚魚皮明膠GPC 結果參數(shù)見表1。

圖1 羅非魚皮明膠凝膠色譜圖

由圖1 和表1 可知，羅非魚皮明膠的凝膠色譜圖的Mw（重均分子量） = 27 759 Da，Mn（數(shù)均分子量） =16 578 Da，Mp（質均分子量） =36 524 Da，Mw/Mn（多分散系數(shù)） =1.674 5。由此可得，羅非魚皮明膠的分子量比較集中，羅非魚皮明膠不是一個均一的分子量聚合物，分子量寬度還可接受，分散程度不是很大。

2.2 羅非魚明膠水解工藝單因素結果及分析

2.2.1 酶解明膠質量分數(shù)對膠原蛋白肽得率的影響

酶解明膠質量分數(shù)對膠原蛋白肽得率的影響見圖2。

圖2 酶解明膠質量分數(shù)對膠原蛋白肽得率的影響

由圖2 可知，羅非魚魚皮明膠同一質量分數(shù)下隨酶解時間的延長，肽得率隨之增大，最后會趨于穩(wěn)定。而在相同時間內，明膠質量分數(shù)的增大，肽得率先增大后減小，在明膠質量分數(shù)超過7%后，肽得率下降可能是膠原蛋白質量分數(shù)較高，導致溶液黏稠度增大、流動性降低，減少了酶與明膠底物的接觸，導致明膠酶解率降低，肽得率下降，與Motero P 等人[12]的研究結果相似。

2.2.2 酶解酶用量對膠原蛋白肽得率的影響

酶解酶用量對膠原蛋白肽得率的影響見圖3。

圖3 酶解酶用量對膠原蛋白肽得率的影響

由圖3 可知，羅非魚魚皮明膠在不同酶用量、相同時間下通過酶解提取的蛋白肽含量不同。同一酶用量下隨著酶解時間延長，肽得率增大，最后趨于穩(wěn)定，并且在20.0 μg/g 時得到最大肽得率，在繼續(xù)增加酶用量的情況下，肽得率不會增加，可能20.0 μg/g 的用酶量就是這個反應體系中酶的最大用量，即在最大用酶量之前，明膠的酶解速率由胰蛋白酶的數(shù)量來控制明膠酶解后的肽得率；當超過最大酶用量，由明膠底物質量分數(shù)來決定明膠酶解肽得率。

2.2.3 酶解溫度對膠原蛋白肽得率的影響

酶解溫度對膠原蛋白肽得率的影響見圖4。

由圖4 可知，羅非魚魚皮明膠在溫度一定時，隨著酶解時間增大，肽得率也隨之增大，最后趨于穩(wěn)定，其中在70 ℃時膠原蛋白肽得率可達到最大，但超過70 ℃后，肽得率反而降低。這是因為當溫度超過了一定范圍后胰蛋白酶的酶活性會降低，相同時間內酶解效率有所降低，導致肽得率下降。

2.2.4 酶解pH 值對膠原蛋白肽得率的影響酶解pH 值對膠原蛋白肽得率的影響見圖5。

圖5 酶解pH 值對膠原蛋白肽得率的影響

由圖5 可知，羅非魚魚皮明膠在同一pH 值下均隨酶解時間的增加，肽得率增大，后趨于穩(wěn)定。相同時間下，隨著pH 值的增大，肽得率是先增大后減小，在pH 值為7.0 時魚皮明膠酶解后蛋白肽得率達到最大。

2.3 響應面法優(yōu)化酶解提取羅非魚皮膠原蛋白的試驗結果

根據(jù)單因素的試驗結果可知，酶用量、酶解溫度、時間、體系中pH 值及明膠質量分數(shù)對肽得率的影響十分顯著。采用Design Expert 10.0 軟件Central composite 設計五因素五水平的響應面試驗，以多肽得率作為響應值，應用五因素五水平處理，共有32 個處理試驗，其中中心點重復6 次。

響應面中心設計試驗因素與水平設計見表2，響應面試驗設計與結果見表3。

表2 響應面中心設計試驗因素與水平設計

表3 響應面試驗設計與結果

2.3.1 試驗數(shù)據(jù)處理及數(shù)值分析

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)，通過Design Expert 10.0 軟件能夠得到一個三維的響應面，以此分析整體誤差水平，再經(jīng)過響應面優(yōu)化能得到酶解提取羅非魚皮膠原蛋白肽的最佳工藝條件。以肽得率為響應值得到二階多項方程為：

Y=75.14+1.18A+3.11B-3.70C+6.0D+6.91E+3.72AB-2.95AC+2.01AD+1.16AE-1.55BC-1.90BD+2.71BE+2.91CD-0.21CE-0.43DE-12.35A2-7.81B2-2.52C2-2.79D2-4.80E2.

試驗設計與結果見表4。

由表4 可知，5 個因素對羅非魚魚皮明膠酶解后膠原蛋白含量影響順序為E＞D＞C＞B＞A，在5 個因素中，酶用量（D） 和時間（E） 的p 值（p＜0.000 1），說明這2 個因素對魚皮明膠酶解肽得率中具有極其顯著的影響。失擬項p=0.063 4＞0.05 不顯著，沒有失擬因素存在，對模型是有利的。校正決定系數(shù)R2Adj=0.928 2＞0.80 和CV=9.11%＜10%，擬合的回歸方程符合實際要求，適應性較好，可以代替試驗真實點對試驗分析。

2.3.2 模型的響應曲面與等高線

根據(jù)Design Expert 10.0 軟件可以得到根據(jù)二次方程模型分別做出的試驗因素間交互作用的三維立體響應曲面和等高線圖，2 種圖能夠考查在某個因素固定中心值不變的情況下，其他2 個因素的交互作用對肽得率的影響。

酶解溫度和體系pH 值對肽得率的交互影響3D圖和交互影響等高線圖見圖6，酶解溫度和明膠底物濃度對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖見圖7。

圖7 酶解溫度和明膠質量分數(shù)對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖

響應曲面的傾斜度確定兩者對響應值的影響程度，傾斜度越高，即坡度越陡，說明兩者交互作用越顯著；等高線的形狀為橢圓形表示因素的交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著[29]。由圖6 可知，酶解溫度和pH 值交互作用顯著，但酶解溫度的等高線更為緊密，故反應體系溫度對肽得率的影響更大。由圖7 可知，酶解溫度和明膠底物質量分數(shù)對肽得率的交互作用顯著，但明膠底物質量分數(shù)的等高線更為緊密，即明膠底物質量分數(shù)對肽得率的影響更大。等高線中最小橢圓的中心點為響應面最高點。

酶解溫度和酶用量對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖見圖8，反應體系pH 值和反應時間對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖見圖9。

圖8 酶解溫度和酶用量對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖

圖9 反應體系pH 值和反應時間對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖

由圖8 可知，酶解溫度和酶用量對肽得率的交互影響顯著，其中酶用量的等高線更為緊密，即反應酶用量對肽得率的影響更大。由圖9 可知，pH 值和時間對肽得率的交互影響較顯著，其中反應時間的等高線更為緊密，即反應時間對肽得率的影響更大。

明膠底物質量分數(shù)和酶用量對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖見圖10。

圖10 明膠質量分數(shù)和酶用量對肽得率的交互影響3D 圖和交互影響等高線圖

由圖10 可知，底物質量分數(shù)和酶用量對肽得率的交互影響顯著，其中酶用量的等高線更為緊密，即酶用量對肽得率的影響更大。

3 結論

通過五因素五水平的中心組合設計，分析響應面的曲面和等高線的分布圖得出各因素對肽得率的影響大小為時間＞酶用量＞明膠質量分數(shù)＞酶解pH值＞溫度。由響應面的優(yōu)化分析可以得到最佳酶解工藝條件為明膠膠質量分數(shù)6%，酶用量15.1 μg/g，酶解溫度70.0 ℃，pH 值7.63 和時間69.99 min，在此最佳工藝條件下酶解羅非魚皮明膠肽得率76.54%。考慮到實際操作的方便性和可操作性，將提取工藝條件改為酶解溫度70.0 ℃，明膠質量分數(shù)6.0%，反應pH 值8.00，時間70.0 min，酶用量為20.0 μg/g時，明膠酶解的實際肽得率是77.72%。通過比較，實際得出的結果和理論值十分吻合，該模型的可靠性較高。