汪麗霞,徐志偉,黃 志,周一軍,沈 忱,杜偉鋒

(1.常山縣農(nóng)業(yè)特色產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心,浙江 常山 324200;2.甘肅省中醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000; 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司,浙江 杭州 311401;4.常山天道中藥飲片有限公司, 浙江 常山 324299;5.浙江中醫(yī)藥大學(xué)資產(chǎn)經(jīng)營有限公司,浙江 杭州 311401; 6.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310053;7.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 中藥 炮制技術(shù)研究中心,浙江 杭州 311401)

當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸(Angelicasinensis(Oliv)Diels)的干燥根,是“根分梢理論”的代表藥材[1]?！镀⑽刚摗酚涊d:“當(dāng)歸頭止血上行,當(dāng)歸身補(bǔ)血中守,當(dāng)歸尾破血下流,全當(dāng)歸補(bǔ)血活血。”研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸頭、身、尾兩兩配伍提取后,阿魏酸、綠原酸、歐前胡素、藁本內(nèi)酯等主要化學(xué)成分含量和干浸膏得率均有不同程度降低,進(jìn)一步說明當(dāng)歸不同藥用部位分別應(yīng)用與研究的必要性[2-4]。

目前尚無當(dāng)歸頭系統(tǒng)提取工藝研究,故本研究擬以阿魏酸等4種主要化學(xué)成分含量及干浸膏得率為考察指標(biāo),以提取次數(shù)、加液量、提取時(shí)間為考察因素,運(yùn)用BP-ANN結(jié)合熵權(quán)法優(yōu)選當(dāng)歸頭提取工藝。BP-ANN可較好滿足非線性復(fù)雜問題的處理,符合中藥提取復(fù)雜性、多元性要求[5-8]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PerkinElmer A-10型高效液相色譜儀(美國PerkinElmer公司);普利賽斯LX2200C電子分析天平(0.01g)(普利賽斯國際貿(mào)易有限公司);普利賽斯LX120A電子分析天平(0.0001g)(普利賽斯國際貿(mào)易有限公司);HWS26型電熱恒溫水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);HXGZ-000800電熱恒溫干燥箱(連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠);KQZ3200E型超聲波清洗機(jī)(連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠)。

1.2 材料

1.2.1 當(dāng)歸頭處理 當(dāng)歸藥材采自甘肅隴西,經(jīng)甘肅省中醫(yī)院科研制劑中心李俊江主任中藥師鑒定為正品當(dāng)歸藥材。切下當(dāng)歸根上端膨大、鈍圓,直徑1.5～4cm,且殘留葉鞘及莖基部分,即得當(dāng)歸頭。

1.2.2 對(duì)照品及試劑 阿魏酸對(duì)照品(批號(hào):110773-201614)、綠原酸對(duì)照品(批號(hào):110753-201817)、藁本內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào):111737-201910)均購買自中國食品藥品檢定研究院,純度均 ≥98%;甲醇、乙腈為色譜純;水為純凈水;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分測(cè)定

2.1.1 供試品溶液制備 平行精密稱取當(dāng)歸頭藥粉9份,每份5g,置具塞錐形瓶中,精密加適量純凈水,按表1安排開展正交試驗(yàn)。提取液過濾,蒸干,純甲醇溶解殘?jiān)?定容至25mL容量瓶,搖勻,過0.22μm微孔濾膜,即得供試品溶液。

表1 當(dāng)歸頭L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取對(duì)照品適量,分別置10mL容量瓶中,甲醇定容至刻度,搖勻,得質(zhì)量濃度分別為阿魏酸0.33mg/mL、綠原酸0.73mg/mL、歐前胡素0.25mg/mL和藁本內(nèi)酯2mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 色譜條件 WatersSymmetry Shield RP-C18(250mm×4.6mm,5.0μm)柱,DAD檢測(cè)器,以乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫:0～10min,12%～12% A;10～15min,12%～25% A;15～22min,25%～28% A;22～25min,28%～60% A;25～30min,60%～70% A;30～40min,70%～12% A;流速1mL/min,柱溫25℃,檢測(cè)波長(zhǎng)350nm;進(jìn)樣量10μL。對(duì)照品、樣品色譜見圖1。

注:1-綠原酸;2-阿魏酸;3-歐前胡素;4-藁本內(nèi)酯。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量,配制成6種不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液,純甲醇定容至刻度,搖勻,以“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。設(shè)橫坐標(biāo)(X)表示質(zhì)量濃度,縱坐標(biāo)(Y)表示峰面積開展線性回歸,分別得回歸方程:阿魏酸Y=2×107X-5 695.8,綠原酸Y=510 668X-1 335.2,歐前胡素Y=2×106X-7 013.4,藁本內(nèi)酯Y=500 543X-5 717.4,即阿魏酸等在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取某一供試品溶液10μL,以“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)針6次,測(cè)得各成分的峰面積RSD分別為阿魏酸1.03%、綠原酸1.01%、歐前胡素1.02%、藁本內(nèi)酯1.05%,即儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取當(dāng)歸頭藥粉,以“2.1.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,依“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,得各成分含量RSD分別為阿魏酸1.33%、綠原酸0.51%、歐前胡素1.37%、藁本內(nèi)酯0.69%,即方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取某一供試品溶液,于0、2、4、8、12、24h按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,得各成分峰面積RSD分別為阿魏酸1.38%、綠原酸1.04%、歐前胡素0.22%、藁本內(nèi)酯1.41%,即供試品溶液24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 平行精密稱取已知含量的當(dāng)歸頭藥粉9份,每份2g,隨機(jī)分為3組,分別精密加入供試品中各成分量80%、100%、120%的各對(duì)照品溶液,以“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,計(jì)算回收率。得平均加樣回收率分別為阿魏酸101.14%、綠原酸98.92%、歐前胡素101.15%、藁本內(nèi)酯99.51%,RSD依次為0.12%、0.76%、1.10%、1.02%。即此含量測(cè)定方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.9 樣品含量測(cè)定 以“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定當(dāng)歸頭9組正交提取樣品中各成分的峰面積,外標(biāo)法計(jì)算含量,依次設(shè)為阿魏酸Y1、綠原酸Y2、歐前胡素Y3、藁本內(nèi)酯Y4,結(jié)果見表1。

2.2 干浸膏得率測(cè)定

精密稱取當(dāng)歸頭藥粉5g,置150mL錐形瓶中,精密加適量水,密塞,稱重,按表1試驗(yàn)安排加熱回流,稱質(zhì)量,補(bǔ)足失重,搖勻,濾過,精密量取25mL濾液,置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,于105℃干燥3h,干燥器中冷卻30min,精密稱定質(zhì)量,計(jì)算數(shù)值,設(shè)為YG,結(jié)果見表1。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化當(dāng)歸頭的提取工藝

以單因素考察結(jié)果為依據(jù),設(shè)提取次數(shù)(A)、加液量(B)、提取時(shí)間(C)為考查因素,并分設(shè)3個(gè)水平,見表1;以阿魏酸等4種化學(xué)成分含量和干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),按L9(34)設(shè)計(jì)試驗(yàn),試驗(yàn)安排及結(jié)果見表1、表2。

表2 方差分析

2.4 阿魏酸等4種化學(xué)成分含量及干浸膏得率結(jié)果綜合評(píng)價(jià)值計(jì)算

運(yùn)用MATLAB R2012a軟件編輯阿魏酸、綠原酸、歐前胡素、藁本內(nèi)酯及干浸膏得率的正交試驗(yàn)結(jié)果,聯(lián)合熵權(quán)法計(jì)算權(quán)重,即:

(1)計(jì)算Pij(概率)。

Pij即第j次試驗(yàn)在第i個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)下的概率,0≤Pi≤1。

(2)計(jì)算Hi(信息熵)。

(3)計(jì)算Wi(權(quán)重系數(shù))。

得各成分權(quán)重分別為阿魏酸0.282 7,綠原酸0.202 6,歐前胡素0.145 6,藁本內(nèi)酯0.225 8,干浸膏得率0.143 1。綜合評(píng)分= (Y1/Y1MAX)×0.282 7+(Y2/Y2MAX)×0.202 7+(Y3/Y3MAX)×0.145 6+(Y4/Y4MAX)×0.225 8+(YG/YGMAX)×0.143 1×100。結(jié)果見表1,即正交試驗(yàn)結(jié)合熵權(quán)法優(yōu)選當(dāng)歸頭最優(yōu)提取工藝為加入當(dāng)歸藥材(粉末)質(zhì)量的10倍量體積提取液,提取3次,每次90min。

2.5 BP-ANN

2.5.1 建立模型 以3層結(jié)構(gòu)BP-ANN構(gòu)建模型,以提取次數(shù)(A)、加液量(B)、提取時(shí)間(C)為輸入節(jié)點(diǎn)數(shù),綜合評(píng)分為輸出節(jié)點(diǎn)數(shù)[9]。

2.5.2 網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練及參數(shù) 運(yùn)用MATLAB R2012a軟件,構(gòu)建“2.5.1”項(xiàng)下模型并訓(xùn)練,得3-10-1網(wǎng)絡(luò)模型。賦值提取次數(shù)、加液量、提取時(shí)間,以上述模型開展仿真模擬,得網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練均方差曲線見圖2,優(yōu)化提取工藝參數(shù),回歸分析網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值,的兩值相關(guān)系數(shù)r=0.998 64,即網(wǎng)絡(luò)模型性能良好。

注:A.均方誤差圖;B.訓(xùn)練回歸曲線;C.驗(yàn)證回歸曲線;D.總回歸曲線。

2.5.3 BP-ANN預(yù)測(cè) 固定提取次數(shù)、加液量、提取時(shí)間中任意兩因素水平值,并適當(dāng)改變剩余因素水平值,運(yùn)用y=sim (net,x)(y為預(yù)測(cè)值,x為提取次數(shù)、加液量、提取時(shí)間不同水平值組合)預(yù)測(cè),考察最優(yōu)提取工藝參數(shù)。得相應(yīng)當(dāng)歸頭提取工藝為:加入當(dāng)歸藥材(粉末)質(zhì)量的9.6倍量體積提取液,提取3次,每次提取67min。該條件下的綜合評(píng)分最大為98.86。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

平行精密稱取6份當(dāng)歸頭藥粉,每份5g,按正交試驗(yàn)及BP-ANN優(yōu)化工藝分別開展3批驗(yàn)證試驗(yàn),得綜合評(píng)分均值分別為98.37和98.94,見表3;表明以BP-ANN優(yōu)化工藝提取綜合提取率更優(yōu),即當(dāng)歸頭的最優(yōu)提取工藝為加入藥材(粉末)質(zhì)量的9.6倍量體積提取液,提取3次,每次提取67min。

表3 BP-ANN、正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝驗(yàn)證結(jié)果及對(duì)比

3 討論

3.1 考察指標(biāo)的選擇

文獻(xiàn)研究表明,阿魏酸、綠原酸、歐前胡素、藁本內(nèi)酯等是目前當(dāng)歸研究中出現(xiàn)頻次較多的成分[9-11]。同時(shí)前期研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸不同藥用部位兩兩配伍,會(huì)引起阿魏酸等的含量及干浸膏得率呈現(xiàn)不同程度的下降。因此,以上述4種化學(xué)成分含量和干浸膏得率作為考察指標(biāo),既可使當(dāng)歸頭提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果更具科學(xué)性和精準(zhǔn)性,又可滿足中藥多靶點(diǎn)、多層次、多渠道、整體作用的臨床特點(diǎn)。

3.2 研究方法的選擇

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是分式析因設(shè)計(jì)的主要方法,既能分析各因素內(nèi)部不同水平間的差異性,也能分析各因素、水平組合的交互作用,運(yùn)用有限次數(shù)試驗(yàn)從大量因素中找出存在顯著意義的因素。但由于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的因素、水平數(shù)量與試驗(yàn)次數(shù)存在顯著的線性關(guān)系,因此在解決實(shí)際問題過程中較難滿足存在非線性關(guān)系的相關(guān)問題。BP-ANN則可通過對(duì)已有數(shù)據(jù)的訓(xùn)練與學(xué)習(xí),構(gòu)建數(shù)學(xué)模型以及更加穩(wěn)定、科學(xué)的多因素和水平間關(guān)系,促進(jìn)復(fù)雜非線性系統(tǒng)問題的研究,即能有效彌補(bǔ)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)解決非線性關(guān)系問題的不足。兩法結(jié)合開展相關(guān)研究,可使試驗(yàn)結(jié)果更具科學(xué)性、嚴(yán)謹(jǐn)性,更便于在實(shí)際工作中推廣應(yīng)用。