占麗琴,方 磊,畢 武,馬 杰,王銀紅,羅 艷,孫 輝,丁 野*

(1.湖南省藥品檢驗檢測研究院,湖南 長沙 410001;2.湖南省藥品質(zhì)量評價 工程技術(shù)研究中心,湖南 長沙 410001)

厚樸花為厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.和凹葉厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥花蕾,稍蒸后,曬干或低溫干燥[1]。據(jù)考證,厚樸首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,為藥用植物厚樸的皮,厚樸花最早記載于1936年出版的《飲片新參》,為藥用植物厚樸的花蕾[2-3]。山玉蘭花為木蘭科植物山玉蘭MagnoliaedelavayiFranch.的干燥花及花蕾,為市場厚樸花的常見混淆品[4-6]。近年來,對厚樸花與山玉蘭花的研究多針對化學(xué)成分,而性狀顯微的研究較少[7-8]。本研究結(jié)合傳統(tǒng)性狀顯微鑒別與現(xiàn)代DNA條形碼技術(shù),準確、科學(xué)地對厚樸花與山玉蘭花進行鑒定,為厚樸花與山玉蘭花進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

DM2500 熒光顯微鏡(德國Leica),Leica M205C體視顯微鏡(德國Leica),RX100M6數(shù)碼相機(日本SONY),MM400組織研磨儀(德國Retsch),DK-450B電熱恒溫水槽(上海森信),Labcycler型PCR擴增儀(德國senso),水合氯醛溶液(實驗室自制),DNA提取試劑盒(天根公司),引物為psbAF:5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′;trnHR:5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。

1.2 樣品

本研究共收集8份厚樸花樣品,其中4份為市場收集,另4份為自采樣本;12份山玉蘭花樣本均為市場收集,均經(jīng)湖南省藥品檢驗檢測研究院丁野主任中藥師鑒定,樣品標本保存于湖南省藥品檢驗檢測研究院中藥所,典型樣品見圖1、表1。

注:A.厚樸花,B.山玉蘭花。

2 方法

2.1 傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別

2.1.1 性狀鑒別 結(jié)合體視顯微鏡對樣品進行性狀觀察、比較、記錄。結(jié)果顯示,厚樸花與山玉蘭花的性狀在形狀、花被、心皮及花梗方面差異明顯,見圖2、表2。

表2 厚樸花與山玉蘭花的性狀特征

注:A.厚樸花特征;B.山玉蘭花特征;1.花梗(Pedicel);2.花被(Perianth);3.心皮(Carpel);4.雄蕊(Stamens)。

2.1.2 顯微鑒別[5,9-10]分別取厚樸花與山玉蘭花完整花蕾或花數(shù)朵,研細,過篩,粉末備用。取適量粉末置載玻片,滴加水合氯醛數(shù)滴,蓋蓋玻片,加熱透化,至顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示,厚樸花與山玉蘭花的粉末特征表皮細胞、花粉粒、石細胞、油細胞無明顯差異,但山玉蘭花粉末特征草酸鈣簇晶、非腺毛明顯,見圖3、圖4、表3。

注:1.花被表皮細胞(Perianth epidermal cells);2.石細胞(Stone cell);3.油細胞(Oil cell);4.花粉粒(Pollen grain)。

注:1.花被表皮細胞(Perianth epidermal cells);2.石細胞(Stone cell);3.油細胞(Oil cell);4.花粉粒(Pollen grain);5.草酸鈣結(jié)晶(Calcium oxalate crystal)(5a-可見光下,5b-偏光下);6.非腺毛(Non-glandular hairs)。

2.2 DNA條形碼鑒別[11]

鑒于本研究項目部分來源為市場收集,無法從原植物考證樣本的準確性。為進一步鑒定樣本,項目組對樣本均進行DNA條形碼鑒別,具體如下。

2.2.1 總DNA的提取及測序[12-13]取樣品粉末50mg,裂解約3h,利用天根植物基因組提取試劑盒進行DNA提取。引物為psbA-trnH(F,R),反應(yīng)總體積為25μL,DNA模板加入量為1μL,擴增,采用凝膠電泳對序列進行檢驗,樣品(1、2、5)檢驗未出條帶,取消測序,其他PCR產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。結(jié)果樣品(18)測序無信號,其他16份樣本均測序成功。

2.2.2 BLAST結(jié)果 將經(jīng)CodenCode Aligner處理后的數(shù)據(jù)在NCBI的BLAST網(wǎng)站上進行比對。結(jié)果顯示,16份測序成功的樣本中4份(4、17、19、20)樣品的psbA-trnH序列與Genbank上厚樸(Magnoliaofficinalis)、凹葉厚樸(Magnoliaofficinalissubsp.biloba)高度匹配(相似度>90%);另12份樣品的psbA-trnH序列與Genbank上山玉蘭(Magnoliadelavayi)高度匹配(相似度≥99%),具體查詢號見表4,典型圖見圖5、圖6、圖7。與傳統(tǒng)性狀顯微鑒別結(jié)果一致。

表4 樣品序列BLAST結(jié)果

圖5 與Genbank數(shù)據(jù)庫(Magnolia officinalis)比對結(jié)果

圖6 與Genbank數(shù)據(jù)庫(Magnolia officinalis subsp.biloba)比對結(jié)果

圖7 與Genbank數(shù)據(jù)庫(Magnolia delavayi)比對結(jié)果

3 討論

3.1 性狀描述

厚樸花現(xiàn)行標準《中華人民共和國藥典》2020年版一部中描述“花梗長0.5～2cm,密被灰黃色絨毛,偶無毛”[1]。本次收集經(jīng)鑒定的厚樸花樣品花梗均無毛,與標準及文獻的描述有差異[4-10]。查閱《中國植物志》厚樸(MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.)項下描述“花梗粗短,被長柔毛”[14]。查閱歷版《中華人民共和國藥典》中厚樸花花梗的描述,均記載“密被灰黃色絨毛”[15-23]。為保證研究的準確性,課題組開展多次調(diào)研,調(diào)研結(jié)果顯示厚樸“花梗長0.5～2cm,偶見稀疏的長柔毛”。

3.2 DNA條形碼鑒別

本研究前期選擇ITS2、psbA-trnH序列進行擴增、測序,但結(jié)果表明,ITS2測序峰圖干擾峰較多;而psbA-trnH測序峰圖質(zhì)量更好。此外,厚樸花的psbA-trnH測序成功率僅50%,山玉蘭花的psbA-trnH測序成功率100%。分析原因,厚樸花采摘后稍蒸,再干燥而得,經(jīng)蒸制、長時間的保存可能會導(dǎo)致DNA降解,導(dǎo)致樣本測序成功率較低[1,11];山玉蘭花采摘后直接干燥,未經(jīng)過高溫蒸制,DNA保存較完整,有利于DNA的提取及后續(xù)測序[11,24-25]。

本研究用樣品采收期厚樸花為花蕾,山玉蘭花為花及花蕾;炮制工藝厚樸花為經(jīng)蒸制再干燥,山玉蘭花為直接干燥。兩者在性狀上表現(xiàn)為厚樸花花蕾完整、顏色較深,而山玉蘭花?？v剖、顏色稍淺。厚樸花性狀中顏色、形態(tài)、花梗與心皮是否被柔毛,是與山玉蘭花區(qū)別的重要鑒別點。厚樸花的顯微鑒別無非腺毛,與性狀鑒別一致。此外,本研究運用DNA條形碼技術(shù)從基因的層面鑒定厚樸花及山玉蘭花,鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)性狀顯微鑒別結(jié)果一致,說明先進科學(xué)技術(shù)可以有效服務(wù)于中藥事業(yè)創(chuàng)新發(fā)展[25]。