丁 青,王利偉,梁月儀,劉曉霞,黃小丹,陳向東,孫冬梅

(廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 佛山 528244)

密蒙花為馬錢科植物密蒙花BuddlejaofficinalisMaxim.的干燥花蕾和花序,是中醫(yī)處方和成藥中的常用中藥,具有清熱瀉火、養(yǎng)肝明目、退翳的功效,用于治療目赤腫痛、多淚羞明、目生翳膜、肝虛目暗、視物昏花[1],現(xiàn)代藥理作用有抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化、治療帕金森和對(duì)抗眼部疾病等[2]。密蒙花主要分布于我國(guó)陜西、云南、貴州等地[3]。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),密蒙花中主要成分為黃酮類和苯乙醇苷類[4],從密蒙花中分離鑒定出的黃酮類化合物有木犀草素、蒙花苷、芹菜素、秋英苷等[5],苯乙醇類化合物有毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷等[6]。

由于中藥的藥效常常是多個(gè)活性成分的綜合作用,用多指標(biāo)進(jìn)行中藥的質(zhì)量控制已得到整個(gè)行業(yè)的共識(shí)[7]。中藥指紋圖譜著重體現(xiàn)中藥整體特性,但無法表征有效成分的絕對(duì)量,無法精準(zhǔn)表述中藥質(zhì)量,為深入挖掘指紋圖譜的內(nèi)在數(shù)據(jù)與變量,采用化學(xué)模式識(shí)別特征性地識(shí)別指紋圖譜尤為關(guān)鍵[8]。因此,本次研究將建立指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)的密蒙花質(zhì)量控制方法,并在此基礎(chǔ)上對(duì)共有指紋峰進(jìn)行成分鑒別,有利于實(shí)現(xiàn)中藥質(zhì)量的全面控制[9],為深入研究密蒙花藥材質(zhì)量控制方法提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

儀器:Thermo Vanquish 超高效液相色譜儀,Thermo 二極管陣列檢測(cè)器(DAD),Waters ACQUITY HSS T3色譜柱(2.1mm×100mm,1.8μm),Waters ACQUITY HSS T3色譜柱(2.1mm×150mm,1.8μm),ME204E型萬分之一天平(梅特勒-托利多公司),HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司),KQ-500DE型超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司),Thermo 超高效液相色譜-四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS)。

1.2 試劑

色譜級(jí)乙腈和甲醇均購自默克股份有限公司,Milli-Q超純水(實(shí)驗(yàn)室自制);分析級(jí)甲醇和乙醇購自西隴科學(xué)股份有限公司,蒙花苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):111528-201710,含量:96.6%),毛蕊花糖苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):111530-201713,含量:92.5%),芹菜素(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):111901-201603,含量:99.2%)。

1.3 材料

本次實(shí)驗(yàn)密蒙花藥材由廣東一方制藥有限公司采購管理部于產(chǎn)地搜集,經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為馬錢科植物密蒙花BuddlejaofficinalisMaxim.的干燥花蕾和花序。經(jīng)檢驗(yàn)均符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》密蒙花藥材項(xiàng)下規(guī)定。樣品產(chǎn)地信息見表1所示。

表1 密蒙花樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取蒙花苷、毛蕊花糖苷對(duì)照品適量,分加70%甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為16.585μg·mL-1、16.125μg·mL-1的溶液。另取芹菜素對(duì)照品適量,加70%甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為15.356μg·mL-1的溶液。

2.2 供試品溶液制備

取密蒙花藥材粉末(過三號(hào)篩)約0.2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入70%甲醇100mL,稱定質(zhì)量,加熱回流45min,放冷,再稱定質(zhì)量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3 色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY HSS T3(2.1mm×150mm,1.8μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B),梯度洗脫,0～5min,25%→30% A,5～15min,30% A,15～18min,30%→38% A,18～35min,38%→45% A,35～55min,45%→80% A。體積流量0.2mL·min-1,柱溫為30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為326nm,進(jìn)樣體積為1μL。

2.4 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY HSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm);其余色譜條件同“2.3”項(xiàng)下。

采用電噴霧離子源(HESI),正、負(fù)離子分別檢測(cè),毛細(xì)管噴霧電壓為3.5kV,毛細(xì)管溫度為350℃。樣品掃描采用Full-MS(dd-MS2),一級(jí)質(zhì)譜采集范圍m/z70～1 050,分辨率為17 500,碰撞能(NCE)為20V。

2.5 指紋圖譜建立

取20批不同產(chǎn)地的密蒙花藥材,按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄20批密蒙花藥材色譜圖,并將所有的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2012版進(jìn)行分析。以MMH01為參照?qǐng)D譜,對(duì)20批密蒙花藥材指紋圖譜共有峰進(jìn)行匹配,選擇分離度較好、峰型對(duì)稱、峰純度高、峰面積較大的色譜峰為指紋峰,共標(biāo)定11個(gè)指紋峰,共有峰模式見圖1。

注:5:毛蕊花糖苷;9:蒙花苷;10:芹菜素。

2.6 指紋峰指認(rèn)

為了深入研究密蒙花成分,本次研究采用超高效液相色譜-四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS)對(duì)密蒙花中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析,根據(jù)所獲得的分子碎片峰、精確相對(duì)分子質(zhì)量等色譜信息,快速分析鑒定密蒙花藥材共有指紋峰的成分。

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液,按照“2.4”項(xiàng)下的色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)行分析,得到密蒙花藥材正、負(fù)離子模式下的總離子流圖,如圖2所示。根據(jù)實(shí)際測(cè)得的相對(duì)分子質(zhì)量與理論相對(duì)分子質(zhì)量二者偏差小于5ppm,同位素豐度比以及一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜碎片信息等,結(jié)合Thermom/zVault數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)信息,對(duì)11個(gè)指紋峰化合物進(jìn)行推斷鑒別,結(jié)果如表2所示。

圖2 密蒙花藥材正離子(A)和負(fù)離子模式下總離子流圖(B)

表2 密蒙花指紋峰鑒別結(jié)果

2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

2.7.1 專屬性試驗(yàn) 取空白溶劑(70%甲醇)、對(duì)照品溶液、密蒙花樣品MMH01供試品溶液,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,結(jié)果表明空白溶劑不干擾指紋峰的檢測(cè)。見圖3。

注:5.毛蕊花糖苷;9.蒙花苷;10.芹菜素。

2.7.2 精密度試驗(yàn) 取密蒙花樣品MMH01供試品溶液,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,以3號(hào)峰(毛蕊花糖苷)為參照峰,計(jì)算11個(gè)指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.01%～0.08%范圍內(nèi),相對(duì)峰面積RSD值在0.41%～1.70%范圍內(nèi),表明儀器精密度良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取密蒙花樣品MMH01供試品溶液,于室溫下放置,分別在制備后的0h、3h、4h、6h、13h、24h進(jìn)樣測(cè)定,以3號(hào)峰(毛蕊花糖苷)為參照峰,計(jì)算11個(gè)指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.01%～0.10%范圍內(nèi),相對(duì)峰面積RSD值在1.40%～2.38%范圍內(nèi),表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批密蒙花樣品粉末6份,按“2.2”項(xiàng)下制備6份供試品溶液,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以3號(hào)峰(毛蕊花糖苷)為參照峰,計(jì)算11個(gè)指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.01%～0.06%范圍內(nèi),相對(duì)峰面積RSD值在0.59%～2.96%范圍內(nèi),表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.5 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 將所有的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》,采用平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜,對(duì)照指紋圖譜見圖4,并進(jìn)行相似度計(jì)算,MMH01～MMH20指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均>0.90,相似度結(jié)果見表3,表明各批次藥材之間的質(zhì)量比較穩(wěn)定。

注:5:毛蕊花糖苷;9:蒙花苷;10:芹菜素。

表3 20批密蒙花藥材相似度計(jì)算結(jié)果

2.8 指紋圖譜化學(xué)模式識(shí)別分析

2.8.1 系統(tǒng)聚類分析 采用SPSS 20.0軟件,對(duì)20批密蒙花指紋圖譜共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,采用Ward法,以平方歐氏距離為測(cè)度,全矩從-1至1標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化,進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見圖5。當(dāng)類間距離在15時(shí),密蒙花藥材被分為3類,其中MMH01～MMH03、MMH10～MMH12聚為第Ⅰ類,其中MMH01～MMH03來源于陜西省安康市,而MMH10～MMH12來源于云南省德宏市;MMH09、MMH15、MMH16～MMH20聚為第Ⅱ類,均來源于貴州省凱里市;MMH04～MMH08、MMH13～MMH14聚為第Ⅲ類,其中MMH04～MMH06、MMH14來源于陜西省安康市,MMH07～MMH08、MMH13來源于四川省綿陽市。

圖5 20批密蒙花樣品聚類分析樹狀圖

將20批密蒙花指紋圖譜共有峰峰面積同時(shí)采用SIMCA14.1軟件繪制PCA得分圖,結(jié)果見圖6。由PCA得分圖可知,20批密蒙花藥材分成3類,與系統(tǒng)聚類分析結(jié)果一致。

分類結(jié)果表明貴州省凱里市、云南省德宏市、四川省綿陽市產(chǎn)區(qū)的密蒙花藥材可以實(shí)現(xiàn)較好的分類,表明這3個(gè)產(chǎn)地的藥材質(zhì)量各自具有一定的相似性,而陜西省安康市的密蒙花藥材有4批能與四川省綿陽市產(chǎn)區(qū)的樣品聚為一類,另有3批能與云南省德宏市產(chǎn)區(qū)的樣品聚為一類,表明陜西省安康市的藥材質(zhì)量波動(dòng)較大。

2.8.2 主成分分析 采用SPSS 20.0軟件,將20批密蒙花指紋圖譜共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,計(jì)算主成分特征值、累計(jì)貢獻(xiàn)率及主成分得分。以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn),提取出的主成分有3個(gè),累積方差貢獻(xiàn)率為84.64%,表明提取出的3個(gè)主成分反映了20批密蒙花藥材指紋圖譜的主要信息,碎石圖進(jìn)一步說明了3個(gè)主成分可以表征密蒙花的整體特征,見圖7。由于載荷值越高,表明變量對(duì)主成分的影響越大。根據(jù)載荷矩陣表4,可知主成分1主要與峰1、峰2、峰5、峰9有關(guān),主成分2主要與峰3、峰6、峰11有關(guān),主成分3主要與峰3、峰8有關(guān),表明密蒙花的質(zhì)量差異是由多個(gè)成分同時(shí)影響,因此密蒙花藥材質(zhì)量應(yīng)采用多指標(biāo)成分共同控制。

圖7 20批密蒙花樣品主成分分析碎石圖

表4 20批密蒙花樣品載荷矩陣

2.8.3 正交偏最小二乘判別分析 為了進(jìn)一步明確上述3類密蒙花藥材之間產(chǎn)生差異的主要標(biāo)志物,采用OPLS-DA對(duì)20批密蒙花藥材進(jìn)行對(duì)比分析。由于VIP值越大,表明該化學(xué)指標(biāo)對(duì)于解釋變量的貢獻(xiàn)越大,因此可以VIP>1作為標(biāo)準(zhǔn),得出密蒙花藥材之間的差異標(biāo)志物。使用OPLS-DA建模分析,篩選出3個(gè)預(yù)測(cè)主成分,累積解釋能力參數(shù)R2x和R2y分別為0.9、0.7,預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.5,表明所建立的模型穩(wěn)定、可靠。以VIP>1的色譜峰為差異標(biāo)志物,如圖8所示,峰6、峰3、峰11、峰1、峰7、峰8的VIP值分別為1.19、1.11、1.11、1.08、1.06、1.02,因此峰6、峰3、峰11、峰1、峰7、峰8可作為區(qū)分密蒙花質(zhì)量差異標(biāo)志物。

圖8 密蒙花藥材指紋圖譜OPLS-DA模型的VIP得分

3 討論與結(jié)論

3.1 指紋圖譜條件確定

本研究對(duì)供試品溶液的制備進(jìn)行了優(yōu)化,考察了提起溶劑、提取方式對(duì)指紋圖譜測(cè)定結(jié)果的影響,結(jié)果表明,當(dāng)采用70%甲醇為提取溶劑,加熱回流為提取方法時(shí),11個(gè)指紋峰的響應(yīng)最大。對(duì)比了0.1%磷酸溶液、0.1%甲酸溶液、0.1%乙酸溶液對(duì)色譜峰分離效果的影響,結(jié)果表明,當(dāng)采用0.1%甲酸溶液為水相流動(dòng)相時(shí)分離效果最佳。在200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn),當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為326nm時(shí),各指紋峰響應(yīng)最大,色譜峰信息全面,因此本研究在326nm下測(cè)定。

3.2 化學(xué)模式識(shí)別分析

對(duì)密蒙花藥材指紋圖譜采用相似度分析、系統(tǒng)聚類分析、主成分分析方法以及正交偏最小二乘判別分析,以全面評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量。通過PCA分析和聚類分析發(fā)現(xiàn),采自陜西省安康市的7批樣品被分成2類,有4批能與四川省綿陽市產(chǎn)區(qū)的樣品聚為1類,另有3批能與云南省德宏市產(chǎn)區(qū)的樣品聚為1類,表明該產(chǎn)區(qū)的藥材質(zhì)量差異較大,對(duì)這7批樣品的指紋峰峰面積進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),MMH01～MMH03的峰5(毛蕊花糖苷)的峰面積為4.556～6.594,MMH04～MMH06、MMH14的峰5(毛蕊花糖苷)的峰面積為6.925～15.685,后4批的峰5的峰面積明顯高于前3批,說明毛蕊花糖苷的含量具有一定差異,這可能是二者各自聚為1類的原因,因此在后續(xù)研究中可以增加該指標(biāo)定量測(cè)定。通過OPLS-DA分析篩選出6個(gè)差異性標(biāo)志物,因此在后續(xù)研究中可以重點(diǎn)關(guān)注峰1、峰3、峰6、峰7、峰8、峰11,可采用多指標(biāo)成分測(cè)定對(duì)密蒙花藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。

3.3 色譜峰指認(rèn)

密蒙花指紋圖譜11個(gè)指紋峰,其鑒定依據(jù)主要是根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜碎片離子與文獻(xiàn)報(bào)道[10]進(jìn)行比對(duì)推導(dǎo)。例如,保留時(shí)間為9.52min的峰1,負(fù)離子掃描模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z621.110 7,二級(jí)裂解碎片可見m/z445.078 0、m/z269.045 7,通過Xcalibur數(shù)據(jù)處理平臺(tái),以及文獻(xiàn)報(bào)道鑒定該化合物為Clerodendrin;保留時(shí)間為10.15min的峰2,負(fù)離子掃描模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z785.251 6,二級(jí)裂解碎片可見m/z623.219 5、m/z161.023 4,通過Xcalibur數(shù)據(jù)處理平臺(tái)及文獻(xiàn)報(bào)道鑒定該化合物為Echinacoside;保留時(shí)間為20.78min的峰6,負(fù)離子掃描模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z447.093 8,二級(jí)裂解碎片可見m/z285.040 7、m/z327.052 8,通過Xcalibur數(shù)據(jù)處理平臺(tái)及文獻(xiàn)報(bào)道鑒定該化合物為木犀草苷。保留時(shí)間為37.16min的峰8,正離子掃描模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z739.245 3,二級(jí)裂解碎片可見m/z593.187 2、m/z285.075 8,通過Xcalibur數(shù)據(jù)處理平臺(tái)以及文獻(xiàn)報(bào)道鑒定該化合物為Neobudofficide。對(duì)于尚未采用對(duì)照品再驗(yàn)證的化合物,還需進(jìn)一步采用對(duì)照品進(jìn)行確證。

3.4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了密蒙花指紋圖譜檢測(cè)方法,該方法穩(wěn)定且專屬性較好。對(duì)不同產(chǎn)地的密蒙花藥材指紋圖譜采用相似度分析及化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),貴州省凱里市、云南省德宏市、四川省綿陽市產(chǎn)地的藥材質(zhì)量各自具有一定相似性;并且不同產(chǎn)地并找到6個(gè)密蒙花藥材質(zhì)量差異性標(biāo)志物,通過UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技術(shù)以及Thermom/zVault數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)信息已推測(cè)出其分子式,這可為更加全面評(píng)價(jià)密蒙花藥材質(zhì)量提供借鑒。