李寧，武甜甜，李天歌，宋蓮軍，黃現(xiàn)青，BUKYEI Erkigul，王田林*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.蒙古國生命科學(xué)大學(xué)，蒙古國 烏蘭巴托 999097）

過量的重金屬在環(huán)境和生物體內(nèi)積累，對人類健康和環(huán)境構(gòu)成重大威脅，例如高血壓、心血管疾病、帕金森病等。我國GB 2762—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》規(guī)定，飲用水中Pb 含量不得超過0.01 mg/L、Cd 含量不得超過0.005 mg/L、礦泉水中Hg含量不得超過0.001 mg/L[1]。美國環(huán)境保護署規(guī)定飲用水中Pb、Hg 和Cu 的最大允許量應(yīng)少于72、10 nmol/L和20 μmol/L。世界衛(wèi)生組織也規(guī)定飲用水中Pb、Hg的最高含量不能超過48 nmol/L 和30 nmol/L。因此，對食品中重金屬含量的實時監(jiān)測非常重要。

傳統(tǒng)的金屬離子檢測方法有原子吸收光譜（atomic absorption spectroscopy，AAS）法[2]、原子發(fā)射光譜（atomic emission spectroscopy，AES）法[3]、電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spec-trometry，ICP-MS）法[4]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（inductively coupled plasma atomic emission spectros -copy，ICP-AES）法[5]、反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法[6]、電化學(xué)法[7]等。這些方法具有高準(zhǔn)確性和高靈敏性的優(yōu)點，但耗時較長，不能滿足可視化快速檢測的需求[8-9]。因此，尋求新的檢測方法是必要的。

熒光法是一種以光為激發(fā)源的介于發(fā)射光譜法與吸收光譜法之間的光譜分析法。簡單來說，用紫外光照射目標(biāo)物時它們可受激發(fā)而發(fā)出熒光，測定發(fā)出的熒光能量即可對物質(zhì)中的多種組分進(jìn)行定量分析[10]。此外，熒光法具有分析速度快、樣品需求量少以及操作簡便等特點[11-12]。研究表明，熒光傳感器作為利用熒光法的典型代表，在檢測重金屬離子方面的應(yīng)用越來越廣泛。熒光傳感器具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性以及較低的檢測限等優(yōu)勢。比率熒光傳感器作為熒光傳感器的一種，可以通過計算兩個或多個發(fā)射的熒光強度比值，賦予自身自校準(zhǔn)功能，具有良好的分辨率，提高了探針的靈敏度和可量化性[13]。同時，雙發(fā)射或多發(fā)射的比率熒光強度檢測可以有效彌補單波長發(fā)射檢測的不足，如探針濃度、溫度、溶劑極性、激發(fā)強度等環(huán)境因素[14]。此外，在一定濃度的物質(zhì)中，比率熒光傳感器觀察到的顏色變化更為顯著。因此，比率型熒光探針廣泛應(yīng)用于食品安全檢測、環(huán)境污染、醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域[15-17]。

本文梳理了幾種類型的比率型熒光探針在檢測重金屬中的研究進(jìn)展，探討了其在應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)和未來的發(fā)展趨勢。

1 比率型熒光探針在重金屬離子檢測中的應(yīng)用

1.1 以納米材料為主體的比率型熒光傳感器

金屬納米粒子、碳基納米材料以及金屬有機框架等納米材料由于其高熒光產(chǎn)率、高熱穩(wěn)定性，耐光漂白性、小尺寸可調(diào)節(jié)，大的斯托克斯位移和良好的發(fā)光性能等熒光特性，以及較高的化學(xué)穩(wěn)定性[18]，已經(jīng)作為熒光納米材料廣泛應(yīng)用于重金屬離子的檢測中[19]。He 等[20]利用量子點（quantum dots，QDs）與分析物之間的電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)，設(shè)計了比率熒光探針CDs-QDx，實現(xiàn)了多種金屬離子的同時檢測。所設(shè)計的探針的原理是基于QDs 對不同目標(biāo)分析物的尺寸大小依賴性熒光響應(yīng)。通過結(jié)合碳點（carbon dots，CDs）和不同尺寸大小的CdTe QDs，對Hg2＋、Cu2＋和Ag＋進(jìn)行定量檢測，其線性檢測范圍分別為0～600、0～2 000 nmol/L 和0～1 000 nmol/L，檢出限分別為22、57、45 nmol/L。Gao 等[21]基于氮摻雜的石墨烯量子點和谷胱甘肽（glutathione，GSH）包裹的金納米團簇（Au nanoclusters，AuNCs）（glutathione-Au nanoclusters，GSH-AuNCs） 的靜電相互作用構(gòu)建了比率熒光探針—GQDs-AuNCs，用于定量檢測Cu2+和Cd2+。檢測Cu2+的原理是Cu2+與GSH 的羧基配合形成GSH-Cu2+配合物，電荷從GSH-AuNCs轉(zhuǎn)移到Cu2+上，導(dǎo)致GSH-AuNCs 的熒光被猝滅；檢測Cd2+的原理是由于Cd2+與GSH 的巰基形成GSHCd 配合物，使得GSH-AuNCs 表面鈍化，有效地減少了非輻射衰減途徑，導(dǎo)致熒光增強。其線性檢測范圍分別為0.08～6 μmol/L 和1～40 μmol/L，檢出限分別為4.12 nmol/L 和0.943 μmol/L。Zhu 等[22]利用金原子和巰基之間的相互作用，將AuNCs 共價連接到QDs 的SiO2納米顆粒表面，設(shè)計了一種新型的比率探針用于檢測Pb2+。其檢測原理是由于AuNCs 表面的谷胱甘肽與Pb2+結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致AuNCs 的熒光猝滅。Pb2+的線性檢測范圍為25～0.25 μmol/L，檢出限為3.5 nmol/L。Wang 等[23]將氮鈷（II）共摻雜碳點（CDs），包裹在銪金屬有機骨架中，形成了一種比例熒光探針—CDs@Eu-MOFs，用于檢測Hg2+。其檢測原理歸因于Hg2+與CDs@Eu-MOFs 之間的內(nèi)濾效應(yīng)（inner filter effect，IFE）。其線性檢測范圍為2～100 μmol/L，檢出限為0.21 μmol/L。

以納米材料為主體的比率型熒光探針的優(yōu)點在于納米材料的多樣性，比如納米材料之間可以通過靜電相互作用、共價等方式進(jìn)行結(jié)合，形成多種多樣的比率型探針。另外，還可以在納米材料表面修飾各種摻雜物，例如N-CDs、B-CDs、BSA-AuNCs、Eu-MOF等；其優(yōu)點可以歸因于納米材料的易于獲得性。據(jù)報道，已經(jīng)有多種原料被開發(fā)用于CDs 的合成，例如竹葉、香蕉、橘子等任何含有C 元素的物質(zhì)，都可以通過簡單的水熱法一步合成CDs。能夠滿足單一重金屬和多種重金屬同時檢測的需求。

1.2 以DNA 為主體的比率型熒光傳感器

脫氧核酶（deoxyribozyme，DNAzyme）是一種具有特異性識別能力的功能性核酸，在互補鏈的特定位置可以被金屬離子剪切；適配體是一種短的單鏈脫氧核糖核酸（deoxyriboNucleic acid，DNA）或核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）分子，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易于合成和化學(xué)修飾等優(yōu)勢[24]。適配體能與靶標(biāo)分子特定區(qū)通過氫鍵作用、靜電作用、堿基堆積作用、范德華力以及構(gòu)象互補等方式，形成發(fā)夾、G-四鏈體、頸環(huán)、假結(jié)等穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)實現(xiàn)結(jié)合[25-26]。

常見的DNAzyme 比率型熒光探針多用于檢測Pb2＋。Ji 等[27]開發(fā)了一種快速、高靈敏度和特異性檢測Pb2＋的熒光傳感策略，是將用于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（hybrid chain reaction，HCR）擴增的DNA 發(fā)夾在四面體DNA納米結(jié)構(gòu)（tetrahedral DNA nanostructure，TDN）的4 個頂點上進(jìn)行修飾，然后利用發(fā)夾在引發(fā)鏈存在的情況下進(jìn)行快速四面體DNA 納米結(jié)構(gòu)超支化雜交鏈反應(yīng)（tetrahedral DNA nanostructure hyper-branched hybri -dization chain reaction，TDA-hHCR），產(chǎn)生大尺寸交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物，從而大大提高熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluores cence reso-nance energy transfer，F(xiàn)RET）信號輸出。Pb2＋DNAzyme 催化引發(fā)鏈的裂解，抑制TDN-hHCR 的起始，并減弱FRET 信號。Pb2＋DNAzyme 催化的裂解反應(yīng)和隨后的TDN-hHCR 的協(xié)同信號放大使傳感平臺具有超高的靈敏度。通過使用信號“打開”或“關(guān)閉”模式，可以檢測到低至0.25 pmol/L 的Pb2＋。此外，Jin 等[28]將DNAzyme 的底物鏈（S-DNA） 修飾在磁珠（magnetic beads，MBs）表面，然后將DNAzyme（E-DNA）的酶鏈與MBs 連接，與S-DNA 形成雙鏈DNA（dsDNA）。用兩端分別標(biāo)記Cy3 和Cy5 的發(fā)夾DNA（HP）作為熒光探針檢測Pb2＋。在Pb2+的存在下，由于DNAzyme 的裂解和單鏈DNA（ssDNA）的釋放，HP 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，兩個熒光團之間的FRET 消失，導(dǎo)致Cy3 信號增強，Cy5 信號減弱。隨著Pb2+濃度的增加，熒光信號比逐漸增加。其線性檢測范圍為0.1～1 000 nmol/L，檢出限為77 pmol/L。

Wu 等[29]通過引入DNA 插層染料（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚，DAPI）作為內(nèi)部參考信號，構(gòu)建了一個Pb2+誘導(dǎo)的基于G-四鏈體多態(tài)性的比率型熒光探針。該探針設(shè)計的關(guān)鍵在于協(xié)同利用G-四鏈體特異性染料（N-甲基介卟啉IX，NMM）和DAPI 兩種信號報告器，其中，NMM 與K+穩(wěn)定的G-四鏈體適配體（平行結(jié)構(gòu)）結(jié)合。當(dāng)加入Pb2+后，形成了比K+更穩(wěn)定的Pb2+適配體的G-四鏈體（反平行結(jié)構(gòu)），由于NMM 不與反平行的G-四鏈體結(jié)合，導(dǎo)致NMM 從體系中脫離，NMM的熒光強度降低，根據(jù)DAPI 和NMM 的熒光強度比可以定量檢測Pb2＋。其線性檢測范圍為100～2 500 nmol/L，檢出限為58.59 nmol/L。此外，Geng 等[30]同樣利用這兩種染料以及兩端富含胸腺嘧啶（T）和鳥嘌呤（G）的DNA序列的Hg2＋的特異性適配體，設(shè)計合成了用于檢測Hg2＋的比率型熒光探針。在Hg2＋存在的情況下，由于TT 不匹配堿基對與Hg2＋之間具有特異性和強親和力，富T 段與Hg2+協(xié)同配合，導(dǎo)致另一端的兩個富G 段形成分裂的G-四鏈體。因此，DAPI 和NMM 的熒光染料分別選擇性插入dsDNA 和G-四鏈體DNA，其熒光也相應(yīng)增強。該熒光探針已成功檢測牛胎血清中的Hg2＋含量。其線性檢測范圍為0.05～3.00 μmol/L，檢出限為8 nmol/L。該類型傳感器還可以檢測水中的Hg2＋[31]。

以DNA 為主體的比率型熒光探針的優(yōu)點在于目標(biāo)物與適配體的特異性結(jié)合。例如DNAzyme 的特定位點切割，以及適配體與分析物的堿基互補配對特性。此外，DNAzyme 和適配體還可以結(jié)合各種納米粒子或其他納米材料，達(dá)到高效、快速檢測重金屬的效果。

1.3 以有機熒光染料為主體的比率型熒光傳感器

有機熒光染料是指吸收某一波長的光后能發(fā)射出另一波長大于吸收光的物質(zhì)，呈現(xiàn)鮮艷顏色，它們基本上都含有苯環(huán)或雜環(huán)并帶有共軛雙鍵的化合物。有機熒光染料在電致發(fā)光、熒光探針、生物成像、防偽等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。常見的有機熒光染料有氟化硼二吡咯（boron-dipyrromethene，BODIPY）、香豆素，羅丹明類等。染料類的比率型熒光探針多用來檢測Hg2＋和Cu2＋。

例如Huang 等[32]報道了一種基于二炔基BODIPY的近紅外熒光探針，利用光譜變化和肉眼實現(xiàn)了對兩種金屬離子Hg2＋和Cu2＋的檢測。由于抑制分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移過程，光譜顯示出顯著的藍(lán)移吸收和熒光帶。該探針與Hg2+或Cu2+結(jié)合后的熒光變化完全不同。其線性檢測范圍分別為6～78 μmol/L 和0～24 μmol/L，檢出限分別為0.09 μmol/L 和1.02 μmol/L。此外，BODIPY 的比率型熒光探針還可以同時檢測水中的Hg2＋和Cu2＋[33-34]。Wen 等[35]以BODIPY 為能量供體，羅丹明為能量受體，研制了一種新型的BODIPY-羅丹明比值熒光探針BR，用于Hg2+的檢測。存在Hg2+時，Hg2+可以打開羅丹明的螺內(nèi)酰胺環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致BODIPY 和羅丹明之間發(fā)生FRET。其線性檢測范圍為0～8 μmol/L，檢出限為0.3 μmol/L。此外，BR 探針已成功應(yīng)用于試紙條上的Hg2+檢測和活體Hela 細(xì)胞中的Hg2+成像。

Zhu 等[36]構(gòu)建了一種新的以喹啉-苯并噻唑基為供體，羅丹明為受體的比值熒光探針1，用于Hg2+的熒光和比色檢測。由于Hg2+促進(jìn)了羅丹明肼的打開，從而導(dǎo)致羅丹明的熒光猝滅。其熒光線性檢測范圍為0～26 μmol/L，檢出限為0.2 μmol/L。Zhang 等[37]利用FRET 機制，設(shè)計并合成了一種基于羅丹明和蒽基的比色、比例熒光探針1。探針1 在CH3CN ∶H2O（1 ∶1，體積比）體系中對Hg2+表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性。其檢測原理可以歸因于Hg2+可以使探針1 形成羅丹明酸形式，從而將非熒光羅丹明熒光團轉(zhuǎn)化為開環(huán)強熒光形式，進(jìn)而開啟FRET 過程。此外，Zhang 等[38]還設(shè)計了一種基于黃蒽基和萘酰亞胺基的比色、比例熒光探針R1 用于檢測Hg2+。其檢測原理與探針1 類似：Hg2+可以使探針R1 形成氧雜蒽酸形式，從而將非熒光氧雜蒽熒光團轉(zhuǎn)化為開環(huán)強熒光形式，開啟FRET 過程。其線性檢測范圍分別為15～45 μmol/L 和0～60 μmol/L，檢出限分別為0.81、1.14 μmol/L。Guo 等[39]采用二維COF（TAPT-DHTA-COF）作為宿主封裝了摻氮碳點（NCDs）和羅丹明B（RhB）合成了比率型熒光探針—NCDs-RhB@COF。NCDs 和RhB 在TAPT-DHTA-COF 的孔隙中以氫鍵的方式均勻組裝。加入Hg2＋后，由于NCDs-RhB@COF 和Hg2＋之間的強協(xié)同作用，藍(lán)色發(fā)射減弱，而紅色發(fā)射增強。這種“ON-OFF”熒光探針用于痕量Hg2＋的檢測，其線性檢測范圍為0.048～10 mmol/L，檢測限為15.9 nmol/L。Liu 等[40]提出了負(fù)載羅丹明B 的沸石咪唑酸骨架-8（ZIF-8）納米復(fù)合材料—ZIF-8@-Rhodamine-B，用于檢測Cu2+，其檢測原理是ZIF-8 的咪唑中的吡啶氮能夠識別Cu2+，并且Cu2+結(jié)合吡啶氮的能力比Zn2+強，進(jìn)而代替Zn2+與吡啶氮結(jié)合，減少配體中心的電荷轉(zhuǎn)移，從而降低了配體內(nèi)的發(fā)光效率。該納米復(fù)合熒光探針在68.4 nmol/L～125 μmol/L 范圍內(nèi)顯示出良好的線性關(guān)系，檢出限為22.8 nmol/L。

Cheng 等[41]利用Hg2+促進(jìn)二硫縮醛和香豆素發(fā)色團的特殊脫保護反應(yīng)，設(shè)計合成了針對Hg2+的新型比率型熒光探針C4。其檢出限為90 nmol/L。Qin 等[42]設(shè)計和研制了一種新型的基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（intramolecular charge transfer，ICT） 的Hg2+比率熒光探針。該探針通過硫代香豆素與香豆素的特定汞促進(jìn)脫硫反應(yīng)進(jìn)行操作，在幾乎純凈的水溶液中表現(xiàn)出高選擇性和靈敏度。其線性檢測范圍為0～1.5 μmol/L，檢出限為1.85 μg/L。此外，該探針還成功地用于活細(xì)胞中Hg2+的熒光成像。

Wang 等[43]設(shè)計并合成了一種基于香豆素-羅丹明B 雜化物的比色比率熒光探針，用于識別Cu2+和精氨酸（Arg）。添加Cu2+后，香豆素基團（供體）與羅丹明B（受體）發(fā)生了FRET，進(jìn)而可以根據(jù)490 nm 與615 nm處熒光強度變化定量檢測Cu2+。其線性檢測范圍為0～60 μmol/L，檢出限為0.47 μmol/L。

以有機熒光染料為主體的比率型熒光傳感器的優(yōu)點勝在熒光染料的易于獲得，以及其結(jié)構(gòu)特點，另外，熒光染料還可以通過各種方式與其他材料結(jié)合形成一種新的熒光傳感器。

2 快速檢測的實際應(yīng)用

快速檢測技術(shù)已經(jīng)成為目前最有前景的研究方向之一，其中，熒光探針由于檢測時間短，檢測結(jié)果靈敏且便于觀察等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品、醫(yī)學(xué)健康等方面。例如Wang 等[44]設(shè)計合成的B，N-CDs 熒光探針可以在8 min 內(nèi)達(dá)到檢測Cr6+的效果。何諧[45]合成的Tb（Ⅲ）修飾氮摻雜碳點的比率熒光探針可以在7 min 內(nèi)檢測水產(chǎn)品中的Hg2+。樊禰禰[46]合成的基于碳量子點和金納米團簇的多色比率熒光探針能夠在3 min內(nèi)完成對Cu2+的檢測。

此外，智能手機RGB 以及試紙條等輔助工具的產(chǎn)生，使得快速檢測變得更為簡單、便捷。例如Chen 等[47]開發(fā)了一種基于BODIPY 的新型熒光探針，將濾紙浸泡在該探針溶液中，經(jīng)干燥之后得到的試紙條可以通過簡單的顏色變化實現(xiàn)對Hg2+的檢測。Wang 等[48]開發(fā)了一種與熒光探針相結(jié)合的試紙條，成功應(yīng)用于水樣中Cu2+的檢測。Lu 等[49]提出了一種基于比率熒光分析的深度學(xué)習(xí)輔助的智能手機集成熒光傳感平臺，利用加樣前后熒光不同的顏色變化，可以快速地定量檢測水樣中的Hg2+。

3 結(jié)論和展望

比率熒光傳感器因為其高效性，檢測的靈敏性以及較低的檢測限在醫(yī)學(xué)、環(huán)境、食品安全方面廣受關(guān)注。本文主要介紹了3 種類型的比率型熒光傳感器，分別以納米材料、DNA、有機熒光染料為主體：1）以納米材料為主體的比率型熒光探針因為其多樣性和可修飾性一直是研究的熱點，此外納米材料還具有生物相容性好、體積小、量子產(chǎn)率高和多色發(fā)射等特點。目前對于納米材料的研究已經(jīng)十分透徹，急需新的納米材料的開發(fā)；2）以DNA 為主體的比率型熒光探針由于其具有特定金屬切割位點的DNAzyme 以及與目標(biāo)分析物的堿基序列相配對的適配體鏈，可以達(dá)到高效特定識別的能力。但目前對于該類型的比率熒光探針的研究缺乏新意，沒有令人眼前一亮的創(chuàng)新性研究；3）以有機熒光染料為主體的比率型熒光探針，其有機熒光染料通常表現(xiàn)出溶解性差、嚴(yán)重的光漂白和生物利用度差。此外，由于需要不同波長的光來激發(fā)染料，因此染料的窄激發(fā)不適合傳感。

現(xiàn)如今，重金屬污染問題非常普遍，通常微量存在于基質(zhì)中，因此，良好的靈敏度對于它們的檢測是必不可少的。鑒于目前的研究現(xiàn)狀和挑戰(zhàn)，可以從以下幾個方面進(jìn)行進(jìn)一步的研究和開發(fā)：1）擴展新的比率測量模式，并合并現(xiàn)有的比率測量模型，以提高靈敏度、多目標(biāo)量化和其他優(yōu)異的檢測性能；2）考慮到重金屬污染在各種環(huán)境介質(zhì)中普遍存在，擴大檢測目標(biāo)和樣品的范圍；3）提高實時跟蹤檢測能力，以全面預(yù)防和控制重金屬污染；4）降低成本，達(dá)到重金屬可視化快速檢測的目的。