翟文婭，武麗娜，陽(yáng)碩，沈保華，施妍

1.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專(zhuān)業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；2.西安交通大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是一種高選擇性的α2腎上腺素受體激動(dòng)劑[1-4]，具有顯著的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗焦慮作用。右美托咪定主要與中樞、外周和自主神經(jīng)系統(tǒng)中G-蛋白偶聯(lián)的α2腎上腺素能受體相結(jié)合，尤其對(duì)α2A 和α2C 受體的親和力較高，并在全身各個(gè)器官以及血管中發(fā)揮作用[5]。與同樣作用于α2腎上腺素受體的可樂(lè)定相比，右美托咪定的鎮(zhèn)靜效果更強(qiáng)，且對(duì)患者的呼吸抑制更小[6]，從而被廣泛應(yīng)用于臨床麻醉中。

近年來(lái)，利用臨床治療藥物來(lái)實(shí)施犯罪的案件日益增多，右美托咪定作為臨床上常用的一種藥物，與其他具有麻醉成分的藥物同時(shí)使用時(shí)可增強(qiáng)麻醉的特定效果，起到很好的協(xié)同作用，且該藥物不受管制，容易獲得，放入水或飲料中不易被察覺(jué)，因而常被用于藥物輔助犯罪（drug facilitated crimes，DFC），如麻醉?yè)尳?、?qiáng)奸、殺人等犯罪行為，因此亟需建立一種簡(jiǎn)便快速的方法用于檢測(cè)血液中的右美托咪定，為其攝入提供客觀證據(jù)。目前已有的文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道主要是對(duì)血漿中的右美托咪定進(jìn)行檢測(cè)分析，分析方法包括GC-MS[9-10]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[11-12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[13-15]。據(jù)報(bào)道[16]，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography -tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）對(duì)血液中的右美托咪定進(jìn)行檢測(cè)，其檢出限（limit of detection，LOD）可低至0.1 ng/mL，但樣品前處理采用的是固相萃取，較為復(fù)雜。因此，本研究旨在建立一種簡(jiǎn)單的HPLC-MS/MS 方法用于分析血液中的右美托咪定，為相關(guān)案件中右美托咪定的檢驗(yàn)提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

API 4000 三重四極桿質(zhì)譜（美國(guó)AB SCIEX 公司）聯(lián)合LC-20AD 液相色譜儀（日本島津公司），Milli-Q Advantage A10 超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司），JP-010T 超聲波清洗儀（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司），XW-80A 渦旋混合器（上海醫(yī)大儀器有限公司），MiniSpin?迷你離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

右美托咪定標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院），氘代內(nèi)標(biāo)（internal standard，IS）地西泮-D5（美國(guó)Cerilliant 公司），乙腈、甲醇（美國(guó)Sigma-Aldrichgongs 公司），98%甲酸（優(yōu)級(jí)純，美國(guó)Honeywell Fluka 公司），乙酸銨（色譜純，美國(guó)Honeywell Fluka 公司），去離子水由Milli-Q Advantage A10 超純水處理系統(tǒng)制備，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Allure PFP Propyl液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，5 μm；美國(guó)Restek 公司），預(yù)柱為ZORBAX Extend-C18 保護(hù)柱（2.1 mm×12.5mm，5 μm，美國(guó)Agilent 公司），流動(dòng)相為V（乙腈）∶V（20 mmol/L 乙酸銨、0.1%甲酸和5%乙腈）=70∶30；恒流洗脫9 min，流速0.25 mL/min，室溫，進(jìn)樣量5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）、正離子模式進(jìn)行離子化，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式檢測(cè)；離子噴霧電壓5 500 V，碰撞氣7 lbf/in2（48.26 kPa），氣簾氣30 lbf/in2（206.84 kPa），霧化氣40 lbf/in2（275.79 kPa），輔助氣50 lbf/in2（344.74 kPa）；離子源溫度500 ℃。化合物參數(shù)見(jiàn)表1，選用兩對(duì)前級(jí)離子/產(chǎn)物離子對(duì)進(jìn)行定性分析，其中一對(duì)離子對(duì)用于定量。

表1 右美托咪定和IS 的MRM 參數(shù)和保留時(shí)間Tab.1 MRM parameters and retention time of dexmedetomidine and IS

1.3 溶液配制

稱(chēng)取右美托咪定對(duì)照品適量，用甲醇配制成1 mg/mL 的對(duì)照品溶液，隨后用甲醇逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為100、20、5、1、0.1 μg/mL 的工作液。

取地西泮-D5標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇配制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液，再用乙腈逐級(jí)稀釋成終質(zhì)量濃度為40 ng/mL 的工作液。

1.4 血液樣品

經(jīng)過(guò)肝素抗凝的空白血液來(lái)自健康志愿者，右美托咪定陽(yáng)性血液樣本來(lái)自藥物輔助犯罪實(shí)際案例受害者。本研究已通過(guò)司法鑒定科學(xué)研究院倫理委員會(huì)審查，所有血液樣本的采集均有書(shū)面知情同意書(shū)。

1.5 樣品處理

取血液0.1 mL 置于2 mL 離心管中，加入0.9 mL含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液，超聲10 min，渦旋1 min，以離心半徑2 cm，12 000 r/min，離心3 min。取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜，進(jìn)行LC-MS/MS 分析。

1.6 方法學(xué)驗(yàn)證

根據(jù)國(guó)際方法驗(yàn)證指南[17-18]進(jìn)行驗(yàn)證，考察該方法的選擇性、線性、LOD、定量限（limit of quantitation，LOQ）、準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和穩(wěn)定性。

1.6.1 選擇性

通過(guò)分析來(lái)自10 個(gè)不同來(lái)源的空白血評(píng)估選擇性，考察全血中內(nèi)源性物質(zhì)以及IS 對(duì)目標(biāo)物的分析是否存在干擾。

1.6.2 線性、LOD、LOQ

取空白血1 mL，加入右美托咪定對(duì)照品工作液，配制成0.2、0.5、2、10、50、200、800、1 000 ng/mL 全血樣品，按照1.5 節(jié)樣品處理方法進(jìn)行處理和分析。以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)之間的峰面積比與目標(biāo)物濃度構(gòu)建校正曲線，用加權(quán)（權(quán)重系數(shù)W右美托咪定=1/x2，x表示濃度）最小二乘法進(jìn)行回歸得到線性方程。LOD 為信噪比至少為3（S/N≥3）的濃度，LOQ 為信噪比至少為10（S/N≥10）、精密度（以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)，relative standard deviation，RSD）小于20%且準(zhǔn)確度在參照值的80%～120%的濃度。

1.6.3 準(zhǔn)確度和精密度

取空白血1 mL，加入右美托咪定對(duì)照品工作液，配制成0.5、2、50、800 ng/mL 全血樣品。從各個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)取100 μL 全血樣品，每個(gè)濃度6 份樣品，按照1.5 節(jié)樣品處理方法進(jìn)行處理和分析，計(jì)算日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度，并連續(xù)4 d 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算日間精密度和準(zhǔn)確度。

1.6.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

在低（2 ng/mL）和高（800 ng/mL）兩個(gè)質(zhì)量濃度制備3 組樣品，分別為提取前添加樣品（峰面積設(shè)為SA）、提取后添加樣品（峰面積設(shè)為SB）、對(duì)照品溶液（峰面積設(shè)為SC），重復(fù)6 次，基質(zhì)效應(yīng)=SB/SC×100%，提取回收率=SA/SB×100%。

1.6.5 穩(wěn)定性

將提取處理后的高低兩個(gè)濃度點(diǎn)樣品在4 ℃的液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24 h 以評(píng)估處理后樣品的穩(wěn)定性，每個(gè)濃度點(diǎn)做6 個(gè)重復(fù)樣品，并與當(dāng)天新制備的質(zhì)量控制樣品進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 儀器條件選擇

根據(jù)右美托咪定的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，離子化方式采用正離子模式。對(duì)于質(zhì)譜條件，在正離子模式下獲得最佳的前體離子和產(chǎn)物離子后，在MRM 模式下對(duì)右美托咪定和IS 的去簇電壓進(jìn)行優(yōu)化，然后對(duì)產(chǎn)物離子的碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，兩對(duì)離子對(duì)進(jìn)行定性，響應(yīng)強(qiáng)度大的離子對(duì)為定量離子對(duì)，質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 選擇性

分析10 份空白血液樣品后，血樣中的內(nèi)源性物質(zhì)未干擾右美托咪定的測(cè)定。

2.2.2 線性、LOD、LOQ

血液中右美托咪定在0.5～1 000 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=0.023 07x+0.000 22，相關(guān)系數(shù)（r）>0.99。LOD為0.2 ng/mL，LOQ為0.5 ng/mL，血液中LOQ 質(zhì)量濃度添加樣品中右美托咪定和IS 的提取離子流色譜圖如圖1 所示。

圖1 右美托咪定和IS在LOQ濃度下的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of dexmedetomidine and IS at LOQ concentration

2.2.3 準(zhǔn)確度和精密度

從表2 可見(jiàn)，右美托咪定的日內(nèi)精密度和日間精密度分別為1.98%～4.48%、3.60%～9.34%，準(zhǔn)確度為90.34%～112.67%，表明該方法精密度和準(zhǔn)確度良好。

表2 右美托咪定精密度和準(zhǔn)確度Tab.2 Precision and accuracy of dexmedetomidine（%）

2.2.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

結(jié)果（表3）顯示，血液中右美托咪定在低和高兩個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)不明顯，均值為93.48%～101.11%。提取回收率為50.05%～91.08%。

表3 右美托咪定提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性Tab.3 Extraction recovery，matrix effect and stability of dexmedetomidine （%）

2.2.5 穩(wěn)定性

結(jié)果（表3）顯示，提取處理后的右美托咪定樣品在4 ℃的自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24 h 后穩(wěn)定性良好。

2.3 案例應(yīng)用

案例1：某市公安局接到2 名女性張某、劉某報(bào)警稱(chēng)，段某（男）以邀請(qǐng)其到家吃飯為由，勸說(shuō)張某、劉某喝“水”，一段時(shí)間后渾身無(wú)力，段某趁機(jī)圖謀不軌欲對(duì)其進(jìn)行猥褻。警方在段某家中發(fā)現(xiàn)碗內(nèi)殘留的無(wú)色液體，并提取了張某、劉某當(dāng)天的血液和案件發(fā)生后第三天的血液和尿液。根據(jù)本研究建立的方法，對(duì)剩余的無(wú)色液體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)含有右美托咪定成分。對(duì)張某、劉某報(bào)案當(dāng)天的血液進(jìn)行檢測(cè)，同樣含有右美托咪定成分，質(zhì)量濃度分別為5.1、4.6 ng/mL，色譜圖見(jiàn)圖2。對(duì)張某、劉某案發(fā)后第三天的血液和尿液進(jìn)行檢測(cè)，未檢出右美托咪定成分。

圖2 案例1 血樣中右美托咪定的色譜圖Fig.2 Chromatograms of dexmedetomidine in the blood samples of case 1

案例2：某市公安局接到秦某（女）報(bào)警稱(chēng)，其在KTV 吃了胡某（男）給的口香糖后出現(xiàn)意識(shí)模糊，隨后遭到胡某性侵。警方收繳了胡某所攜帶的口香糖、藍(lán)色藥片、外包裝為棕褐色安瓿瓶?jī)?nèi)的無(wú)色液體以及外包裝為標(biāo)有“床前明月光”字樣玻璃瓶?jī)?nèi)的無(wú)色液體。采用本研究方法對(duì)口香糖、藍(lán)色藥片和2 種無(wú)色液體成分進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)口香糖和外包裝為標(biāo)有“床前明月光”字樣玻璃瓶的無(wú)色液體中均含有右美托咪定成分。參照本實(shí)驗(yàn)室已有方法[19]進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)藍(lán)色藥片中含有三唑侖成分，外包裝為棕褐色安瓿瓶的無(wú)色液體中含有亞達(dá)唑散成分。

3 討論

3.1 前處理?xiàng)l件選擇

血液樣品常采用的處理方法主要包括液液萃取、固相萃取和蛋白質(zhì)沉淀法，液液萃取和固相萃取均具有樣品富集與凈化的功能，因此可在一定程度上提高檢測(cè)靈敏度，如王瑞花等[16]采取固相萃取的方法對(duì)血液中的右美托咪定進(jìn)行檢測(cè)，LOD 低至0.1 ng/mL，但液液萃取和固相萃取操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，成本也較高。而蛋白質(zhì)沉淀法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊裝置便可進(jìn)行。因此本研究采用簡(jiǎn)單快速的蛋白質(zhì)沉淀法對(duì)0.1 mL血液樣品進(jìn)行處理，LOD 為0.2 ng/mL，與王瑞花等[16]報(bào)道的LOD 相近，LOQ 為0.5 ng/mL，可滿(mǎn)足法醫(yī)學(xué)鑒定實(shí)踐和臨床檢測(cè)的要求。

3.2 案例回顧

近年來(lái)，右美托咪定因其優(yōu)良的輔助麻醉效果而在臨床實(shí)踐中應(yīng)用廣泛，但也常常被不法分子作為作案的輔助工具。正如本研究中案例1 所示，由于右美托咪定本身無(wú)色無(wú)味，因此被放入水或飲料中也不易被察覺(jué)。此外，右美托咪定被用于非法目的時(shí)一般不會(huì)單獨(dú)使用，常常結(jié)合其他具有鎮(zhèn)靜、催眠或麻醉效果的藥物同時(shí)使用，如本文案例2 中的三唑侖以及其他文獻(xiàn)所報(bào)道的東莨菪堿[16]，這些物質(zhì)與右美托咪定合用時(shí)具有較好的協(xié)同作用，而案例2 中的亞達(dá)唑散是一種選擇性高的α2受體阻斷藥，可以很好地阻斷右美托咪定的α2腎上腺素受體激動(dòng)劑作用，有時(shí)會(huì)被犯罪分子隨身攜帶作為“解藥”，因此在檢測(cè)右美托咪定的同時(shí)需要注意排查是否伴有其他物質(zhì)的可能性。

本研究建立了HPLC-MS/MS 法檢測(cè)血液中的右美托咪定，該方法前處理簡(jiǎn)單，選擇性好，靈敏度較高，適用于藥物輔助犯罪案件的分析檢測(cè)。