陳 欣，劉佩鋒，劉書禹，徐 亮，諶苗苗，陳俊山

（遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所，遼寧 鳳城 118100）

在柞蠶生產(chǎn)上，種繭依靠人工創(chuàng)造的適宜低溫環(huán)境越冬貯藏以待翌年制種放養(yǎng)，在此期間，雖然柞蠶蛹體表面看不出形態(tài)學(xué)變化，但實(shí)質(zhì)上其處于滯育后期發(fā)育階段[1]，各項(xiàng)生理代謝活動(dòng)一直在進(jìn)行，而所有的生命活動(dòng)均需要消耗能量，因此其體內(nèi)能量物質(zhì)的含量一直呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化狀態(tài)[2-3]。由于蛹體完全不進(jìn)食，低溫貯藏期間能量消耗情況對(duì)于保障其貯藏期的存活率及貯藏后成蟲期的表現(xiàn)尤為重要[4]。前人研究結(jié)果表明，糖代謝的變化是昆蟲響應(yīng)溫度等逆境的重要過(guò)程[5]，糖原是柞蠶蛹滯育期最重要的能量來(lái)源之一，也是滯育解除后發(fā)育的重要供能物質(zhì)，其在低溫期會(huì)轉(zhuǎn)化為具有抗凍保護(hù)作用的小分子碳水化合物海藻糖，來(lái)提高柞蠶蛹對(duì)于低溫環(huán)境的抵抗能力[6-8]，且海藻糖合成量與抗逆能力呈正比關(guān)系[9]，同時(shí)這種轉(zhuǎn)化不僅是雙向的，在滯育解除后海藻糖又會(huì)重新轉(zhuǎn)化為糖原，同時(shí)還是一個(gè)耗能過(guò)程，據(jù)此推測(cè)，柞蠶蛹脂肪體糖原和血淋巴海藻糖之間的轉(zhuǎn)化能夠反映其低溫貯藏期的能量消耗情況以及其對(duì)低溫的耐受能力。

在二化性柞蠶產(chǎn)區(qū)，春柞蠶種繭低溫貯藏期從11 月下旬至翌年2 月下旬，長(zhǎng)達(dá)3 個(gè)多月，二化一放種繭低溫貯藏期更是在此基礎(chǔ)上延長(zhǎng)3~4 個(gè)月，由于低溫貯藏期的延長(zhǎng)，影響了蛹體正常的生理代謝及發(fā)育，因此出現(xiàn)了羽化率低、異常蛾率高以及孵化率低等一系列種蛾質(zhì)量問(wèn)題，嚴(yán)重制約了二化一放生產(chǎn)效益[10-12]，前人研究表明，適用于二化性地區(qū)的一化性柞蠶品種耐貯性要優(yōu)于二化性品種[13]，且在家蠶方面有相關(guān)研究顯示不同的二化性蠶種的耐冷藏性有所差異[14]，因此為根本解決上述問(wèn)題，本研究試圖從糖原和海藻糖之間的轉(zhuǎn)化為切入點(diǎn)，選擇在二化一放生產(chǎn)上孵化率高、生命力強(qiáng)、豐產(chǎn)性好的二化性地區(qū)一化性品種遼8 為對(duì)照[15-16]，對(duì)比測(cè)定了7 個(gè)二化性柞蠶品種種繭在低溫貯藏過(guò)程中蛹體血淋巴海藻糖和脂肪體糖原含量的變化情況，以期探明糖代謝與種繭耐貯性之間的關(guān)系，進(jìn)一步為選育耐低溫貯藏的二化一放柞蠶品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試柞蠶品種為二化性品種大9、鳳久、抗大、遼蠶527、遼蠶582、墨玉、青黃1號(hào)和一化性品種遼8，均來(lái)自遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所育種研究室。供試品種2021年秋季統(tǒng)一放養(yǎng)，11月17日統(tǒng)一入庫(kù)貯藏，庫(kù)溫0~2 ℃。

1.2 主要試劑

海藻糖測(cè)定試劑盒（A149-1-1），糖原測(cè)定試劑盒（A043-1-1），均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.3 主要儀器

制冰機(jī)（SIM-F140AY65-PC），日本松下公司；高速冷凍離心機(jī)（MICRO17R），日本Thermo 公司；醫(yī)用冰箱（DW-FL270），中科美菱低溫科技股份有限公司；恒溫水浴鍋（HH-2），常州智博瑞儀器制造有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV2600），日本島津公司；高精度電子分析天平（ESJ-A），沈陽(yáng)龍騰電子有限公司。

1.4 取樣

每個(gè)品種雌雄蛹各5頭為一組，在冰浴條件下解剖取血淋巴和脂肪體（加入苯基硫脲），3次重復(fù)，取樣時(shí)間從2021年11月17日入庫(kù)當(dāng)天開始至2022年5月17日（二化一放出庫(kù)期）出庫(kù)為止，每隔1個(gè)月取樣1次，樣品置于低溫冰箱（-80 ℃）備用。

1.4.1 柞蠶蛹血淋巴取樣 將8個(gè)供試柞蠶品種種繭繭殼割開取出蛹體，雌雄分開，在冰浴條件下取血淋巴（蛹體背部近頭位置剪開），每頭1 mL，置于2 mL離心管中（離心管提前加入0.1 mg苯基硫脲晶體），冷凍離心機(jī)5 000 g·min-1，離心10 min，吸取上清液，將同一品種同一性別每5頭蛹血淋巴混勻置于10 mL離心管中為1次重復(fù)，取樣設(shè)3次重復(fù)，取完樣將樣品置于低溫冰箱（-80 ℃）備用。

1.4.2 柞蠶蛹脂肪體取樣 將取完血淋巴的蛹體在冰浴條件下摘取脂肪體，每頭0.2 g，同一品種同一性別每5頭蛹脂肪體混勻置于2 mL離心管中（離心管提前加入0.1 mg苯基硫脲晶體）為1次重復(fù)，取樣設(shè)3次重復(fù)，取完樣將樣品置于低溫冰箱（-80 ℃）備用。

1.5 測(cè)定

為消除因性別造成的糖類物質(zhì)含量差異，將各品種雌雄蛹分別進(jìn)行測(cè)定，采用蒽酮比色法測(cè)定脂肪體糖原和血淋巴海藻糖的含量，具體操作方法均參照對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書。試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，光度值使用島津UV2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

對(duì)各品種雌雄蛹測(cè)定結(jié)果的平均值進(jìn)行比較，使用SPSS 25 數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和雙變量相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫貯藏期柞蠶種繭蛹體血淋巴海藻糖和脂肪體糖原的含量變化

由圖1可知，低溫貯藏期各品種血淋巴海藻糖和脂肪體糖原含量之間呈現(xiàn)明顯的此消彼長(zhǎng)的變化趨勢(shì)，海藻糖峰值出現(xiàn)時(shí)間及水平各化性品種間存在差異，二化性品種抗大、遼蠶582、墨玉峰值出現(xiàn)在1月份，大9、鳳久、遼蠶527 和青黃1 號(hào)以及一化性品種遼8 的峰值則出現(xiàn)在2 月份即春制種出庫(kù)期，從耐寒物質(zhì)積累角度分析，此5 個(gè)品種在春用種繭保護(hù)期具有更好的低溫應(yīng)對(duì)能力。3 月份各化性品種海藻糖含量均發(fā)生大幅下降，一化性品種降幅顯著小于二化性品種，且下降后直至5月份二化一放制種出庫(kù)期一直顯著高于二化性品種，結(jié)合一化性品種的耐貯性，推測(cè)蛹體血淋巴海藻糖的高水平含量和變化的相對(duì)平穩(wěn)是柞蠶種繭耐長(zhǎng)時(shí)間低溫貯藏的要素。

圖1 低溫貯藏期各柞蠶品種血淋巴和脂肪體中糖類含量的變化Figure 1 The changes of carbohydrate content in the hemolymph and fat body of every tussah varieties during low-temperature storage time

2.2 不同制種出庫(kù)期種繭蛹體血淋巴海藻糖含量對(duì)比

基于海藻糖的耐寒物質(zhì)屬性，對(duì)圖1 中不同制種出庫(kù)期各化性品種蛹體血淋巴海藻糖含量進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)對(duì)比，對(duì)比結(jié)果如表1 和圖2，各化性品種在二化一放制種出庫(kù)期相較于春制種出庫(kù)期血淋巴海藻糖含量均發(fā)生顯著下降，說(shuō)明隨著低溫貯藏期的延長(zhǎng)，蛹體耐低溫能力發(fā)生明顯下滑，推測(cè)這是引起二化一放種蛾質(zhì)量下降的原因之一。其中一化性品種下降后含量水平顯著高于二化性品種，可見(jiàn)從耐低溫能力方面考慮，以海藻糖含量為衡量指標(biāo)，一化性品種較二化性品種耐長(zhǎng)時(shí)間低溫貯藏，符合一化性品種的耐貯性，二化性品間也存在顯著差異，其中下降后仍處于較高水平的是品種大9、鳳久、遼蠶527。

表1 不同制種出庫(kù)期各柞蠶品種血淋巴海藻糖含量的對(duì)比Table 1 The hemolymph trehalose content of every tussah varieties at different low temperature storage time

圖2 不同低溫貯藏時(shí)間各柞蠶品種血淋巴海藻糖含量的對(duì)比Figure 2 The hemolymph trehalose content of every tussah varieties at different low temperature storage time

2.3 低溫貯藏期種繭蛹體血淋巴海藻糖和脂肪體糖原含量的相關(guān)性分析

由圖1可知，整個(gè)低溫貯藏期蛹體糖類物質(zhì)含量呈動(dòng)態(tài)變化，且海藻糖和糖原之間的轉(zhuǎn)化一個(gè)是雙向耗能的過(guò)程。因此，不能單純的以海藻糖含量為指標(biāo)衡量品種的耐貯性，對(duì)二者含量進(jìn)行進(jìn)一步的相關(guān)性分析。由表2 可知，皮爾遜相關(guān)系數(shù)表明一化性品種呈極顯著負(fù)相關(guān)，二化性品種呈顯著性負(fù)相關(guān)，結(jié)合一化性品種海藻糖含量在春制種期之后變化趨勢(shì)相對(duì)平穩(wěn)的情況，可見(jiàn)二者之間相互轉(zhuǎn)化的耗能情況可通過(guò)相關(guān)性分析來(lái)反映，二者相關(guān)性越強(qiáng)，說(shuō)明糖原和海藻糖除彼此轉(zhuǎn)化外很少被蛹體額外消耗和利用。判定系數(shù)進(jìn)一步表明，二化性品種中，大9、鳳久、遼蠶52、青黃1 號(hào)相關(guān)的密切程度（判定系數(shù)>0.7）高于其他3 個(gè)二化性品種，即此4個(gè)二化性品種在低溫貯藏期的能源物質(zhì)利用情況更為合理。

表2 低溫貯藏期各柞蠶品種海藻糖和糖原含量相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of trehalose and glycogen content of every tussah varieties in low temperature storage period

3 討論與結(jié)論

海藻糖是一種典型的應(yīng)激代謝與保護(hù)物質(zhì)，當(dāng)生物體生長(zhǎng)環(huán)境良好時(shí)，體內(nèi)不積累海藻糖，而當(dāng)生物體處于脅迫環(huán)境時(shí)，體內(nèi)就會(huì)迅速積累海藻糖[17-19]，其存在可以保護(hù)生物體在低溫、干燥、熱激、冷凍、高滲透性、氧化和農(nóng)藥等逆境條件下免受傷害[20-25]，本研究中，各化性柞蠶品種蛹體血淋巴海藻糖含量在入庫(kù)低溫貯藏后總體都呈現(xiàn)積累趨勢(shì)，與此同時(shí)脂肪體糖原呈現(xiàn)相反的下降趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明二者存在一定程度的相互轉(zhuǎn)化，與前人對(duì)昆蟲越冬滯育期間關(guān)于二者存在轉(zhuǎn)化的研究結(jié)果相一致[26-31]。但是海藻糖的積累并不是隨著低溫環(huán)境的持續(xù)而一直保持，當(dāng)海藻糖含量達(dá)到一定水平后即發(fā)生了下降，與此同時(shí)，蛹體脂肪體糖原含量升高，這是因?yàn)楹Ｔ逄堑暮铣纱嬖谪?fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，即血淋巴中高濃度的海藻糖會(huì)抑制6-磷酸海藻糖合成酶，從而轉(zhuǎn)變?yōu)樘窃铣?，測(cè)定結(jié)果中各化性品種蛹體海藻糖含量峰值出現(xiàn)的時(shí)間和含量水平的不同則說(shuō)明，血淋巴中海藻糖引發(fā)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的濃度存在化性、品種間的差異，結(jié)合海藻糖具有的提高蟲體抗寒性的作用，說(shuō)明各化性品種蛹體耐低溫能力皆有所不同，到達(dá)峰值時(shí)間較晚的品種相應(yīng)的峰值持續(xù)時(shí)間也較長(zhǎng)且峰值水平較高，顯然耐貯性更強(qiáng)，暫時(shí)的下降之后海藻糖含量再次發(fā)生積累，且隨著低溫貯藏期的延長(zhǎng)一化性品種海藻糖含量水平越來(lái)越優(yōu)于二化性品種，體現(xiàn)出一化性品種耐貯性的同時(shí)，也與生產(chǎn)上二化一放制種期，二化性地區(qū)一化性品種比二化性品種種蛾質(zhì)量好，蛾卵孵化率高的實(shí)際相符，充分證明海藻糖含量與種繭耐貯性直接相關(guān)，結(jié)合所測(cè)試的各二化性品種間存在的顯著性差異，說(shuō)明在二化一放生產(chǎn)上可以以海藻糖的含量為指標(biāo)衡量二化性種繭的耐長(zhǎng)時(shí)間低溫貯藏能力。但是由于海藻糖與糖原之間的轉(zhuǎn)化是一個(gè)雙向的耗能過(guò)程，由糖原降解每產(chǎn)生1分子海藻糖需要消耗1個(gè)ATP，而由海藻糖重新合成糖原，糖原鏈每增加一個(gè)葡萄糖單位就需要耗用2個(gè)ATP[32]，可見(jiàn)發(fā)生在2至3月間的海藻糖重新轉(zhuǎn)化為糖原的情況，海藻糖下降的越多，顯然消耗的能量也越多，因此，從這一角度可見(jiàn)在低溫貯藏期一化性品種耗能較少，結(jié)合一化性品種的耐貯藏特性，說(shuō)明較少的耗能是一化性品種比二化性品種耐低溫貯藏的原因之一。因此不能簡(jiǎn)單地以海藻糖含量為種繭耐低溫貯藏的衡量指標(biāo)，貯藏期其與糖原轉(zhuǎn)化間能量的消耗也是需要考慮的因素，本研究中這種能量的消耗可以通過(guò)相關(guān)性分析得到直觀的體現(xiàn)，二者轉(zhuǎn)化的相關(guān)系數(shù)越高，說(shuō)明轉(zhuǎn)化效率越高，能量被額外消耗的越少，越有利于長(zhǎng)時(shí)間低溫貯藏。

此外，由于本研究試驗(yàn)過(guò)程中將各品種雌雄蛹體進(jìn)行分開測(cè)定，數(shù)據(jù)分析過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)各品種雌性蛹體比雄性蛹體血淋巴海藻糖含量更高，且其與脂肪體糖原之間轉(zhuǎn)化系數(shù)也更高，說(shuō)明雌蛹比雄蛹更耐低溫貯藏，這也從能源物質(zhì)利用和耐寒物質(zhì)積累角度證明了前人在實(shí)際生產(chǎn)中曾采用“二交一”的辦法解決“二化一放”生產(chǎn)難題的合理性。綜上，通過(guò)與一化性品種的對(duì)比，以及二化性品種間具有的顯著差異，明確了海藻糖含量及其在低溫貯藏期與糖原含量的相關(guān)程度可作為衡量柞蠶種繭耐貯性的指標(biāo)，并以之為參考初步篩選出了3 個(gè)較耐長(zhǎng)時(shí)間低溫貯藏的二化性品種，該研究結(jié)果可為柞蠶耐貯性研究以及二化一放柞蠶品種選育提供參考。