王明偉,夏應(yīng)菊,陳紫昱,李佳昕,劉業(yè)兵*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家豬瘟參考實驗室,北京 100081;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東泰安 271000)

mRNA又稱信使RNA(message RNA, mRNA),由DNA為模板轉(zhuǎn)錄而來,負(fù)責(zé)指導(dǎo)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成[1］。mRNA技術(shù)是一種將人工合成的mRNA分子引入細(xì)胞內(nèi),并利用細(xì)胞自身的翻譯機(jī)制將其轉(zhuǎn)錄成蛋白質(zhì)的技術(shù),已有幾十年的研究歷史。新冠疫情暴發(fā)后,Moderna利用該技術(shù)僅用了42天即完成了新冠mRNA候選疫苗mRNA-1273的構(gòu)建和篩選,并于2020年3月獲得FDA批準(zhǔn)正式開始評估安全性和免疫原性的I期臨床試驗,試驗結(jié)果顯示該候選株的免疫保護(hù)性可達(dá)94.1%[2］。2020年12月輝瑞和Moderna分別研制的mRNA疫苗均獲得美國食品安全局的緊急使用授權(quán)(EUA),成為疫苗史上最快研制上市的疫苗[3］,標(biāo)志著mRNA技術(shù)正式應(yīng)用到COVID-19臨床預(yù)防。隨著mRNA技術(shù)的發(fā)展以及在新冠疫情防控中的應(yīng)用,該技術(shù)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),得到了極大的關(guān)注,并獲得了2023年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。同時該技術(shù)也在動物疫病中進(jìn)行了應(yīng)用研究,現(xiàn)就mRNA技術(shù)的發(fā)展歷程,mRNA疫苗的設(shè)計、遞送及特點(diǎn),以及其在動物疫病研究中的進(jìn)展予以綜述。

1 mRNA技術(shù)的發(fā)展歷程

mRNA主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,由編碼區(qū)、上游的5′非編碼區(qū)和下游的3′非編碼區(qū)組成,真核生物mRNA分子兩端還有5′帽子和3′尾部結(jié)構(gòu),原核細(xì)胞的mRNA一般沒有尾部結(jié)構(gòu)[4］。1961年,Brenner及Gross等發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)合成過程中,有一種物質(zhì)與核糖體結(jié)合,由此發(fā)現(xiàn)了mRNA[5］。到了1975年,有文獻(xiàn)報道發(fā)現(xiàn)了mRNA的帽子結(jié)構(gòu)(5′端高度甲基化修飾)[6］。1978年,Dimitriadis GJ將脂質(zhì)體包裹的mRNA遞送至小鼠淋巴細(xì)胞[7］,有了這些前期的基礎(chǔ),Malone在1989年首次提出mRNA疫苗的概念[8］。然而,受mRNA不穩(wěn)定,易被機(jī)體模式識別受體(PRRs)識別并降解等因素的限制,當(dāng)時的研究更傾向于比較穩(wěn)定的DNA疫苗,而mRNA的應(yīng)用研究更偏向于免疫佐劑方向[9］。直到1990年,Wolff等人首次報道使用人工合成的裸mRNA注射到小鼠骨骼肌可促進(jìn)編碼蛋白的表達(dá)[10］,證明體外合成mRNA作為信息載體指導(dǎo)體細(xì)胞蛋白合成的可行性。2005年,Weissman等人發(fā)現(xiàn)使用修飾的外源mRNA可以降低在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)并避免快速降解[11］。近年來,隨著5′端加帽技術(shù)的發(fā)展,體外合成mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率得到提高,而機(jī)體對RNA的先天免疫反應(yīng),RNA的降解速度也相對降低。此外,假尿苷修飾技術(shù)、種屬密碼子的選擇和優(yōu)化、最優(yōu)化的UTR(非編碼區(qū))和多聚A等技術(shù)的發(fā)展進(jìn)一步增加了mRNA穩(wěn)定性[12］。2020年新冠mRNA疫苗獲得了EUA認(rèn)證[13］,證明mRNA疫苗可能成為未來快速應(yīng)對新發(fā)傳染病的新手段,也加速了mRNA技術(shù)的發(fā)展。2023年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎公布,授予匈牙利生物化學(xué)家 Katalin Karikó和美國醫(yī)學(xué)家Drew Weissman,以表彰他們在核苷堿基修飾方面的發(fā)現(xiàn),從而開發(fā)出了有效的mRNA疫苗。

圖1 mRNA的發(fā)展歷程圖

2 mRNA疫苗的設(shè)計、遞送及特點(diǎn)

2.1 mRNA疫苗的設(shè)計 mRNA技術(shù)是一種將人工合成的mRNA分子引入細(xì)胞內(nèi),并利用細(xì)胞自身的翻譯機(jī)制來將其轉(zhuǎn)錄成蛋白質(zhì)的技術(shù)。這其中最難的便是人工合成mRNA分子,合成過程大概分為三步:第一步根據(jù)目的基因序列設(shè)計mRNA序列,優(yōu)化其序列并制備重組質(zhì)粒;第二步對重組質(zhì)粒進(jìn)行線性化及加尾;第三步對線性化質(zhì)粒DNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄、加帽及純化,得到mRNA分子后,再對其進(jìn)行體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染和檢測。現(xiàn)階段mRNA技術(shù)最成功的應(yīng)用是mRNA疫苗,其結(jié)構(gòu)和mRNA一樣,包括5′端帽子結(jié)構(gòu)—5′UTR(非編碼區(qū))—ORF編碼區(qū)(目的基因序列)—3′UTR(非編碼區(qū))—3′端poly(A)尾巴[22］。5′末端添加cap帽子結(jié)構(gòu)可以增強(qiáng)mRNA分子的穩(wěn)定性。5′端添加cap帽子方法很多,可以通過加帽試劑盒添加,也可以在體外轉(zhuǎn)錄的同時添加,即cap結(jié)構(gòu),DNA模板,T7RNA聚合酶以及核苷酸和修飾的核苷在體外合成mRNA分子,然后將其純化后便得到mRNA原液,在眾多添加cap結(jié)構(gòu)的方法中,這種方法比較快捷方便。位于5′端和3′端的UTR一般選擇高表達(dá)基因,如人β珠蛋白[23］,因為含有這些UTR的mRNA通常具有高水平的翻譯和穩(wěn)定性。通過高通量篩選合適的UTR序列添加到mRNA質(zhì)粒上,可以提高mRNA的表達(dá),合理組合5′UTR和3′UTR可以使翻譯效率最大化。編碼抗原的ORF(開放閱讀框)是mRNA中最關(guān)鍵的組成部分,因為它包含了翻譯成蛋白質(zhì)的編碼序列。盡管開放閱讀框的可塑性不及非編碼區(qū),但它可以通過將人體內(nèi)很少使用的密碼子替換為經(jīng)常出現(xiàn)的密碼子來進(jìn)行優(yōu)化,當(dāng)然編碼蛋白的氨基酸序列不能改變,這樣優(yōu)化可增加蛋白質(zhì)翻譯。目前有多種poly尾的添加方法,最簡單的方法是在PCR擴(kuò)增目的基因進(jìn)行質(zhì)粒線性化的時候在下游引物上增加互補(bǔ)堿基,使得到的目的基因上帶有poly尾。mRNA疫苗由這五部分組成的結(jié)構(gòu)不僅增強(qiáng)了mRNA的穩(wěn)定性,同時提高了mRNA翻譯的準(zhǔn)確性和效率。之后再將體外轉(zhuǎn)錄獲得的mRNA原液直接引入目標(biāo)細(xì)胞中,在細(xì)胞內(nèi)完成翻譯形成蛋白質(zhì)[24］。該蛋白質(zhì)更接近天然構(gòu)象的蛋白,因為避免了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)制備方法中所面臨的問題,例如復(fù)雜的蛋白質(zhì)折疊和后續(xù)純化等步驟。

2.2 mRNA疫苗的遞送系統(tǒng) 除了mRNA本身外,遞送系統(tǒng)也是mRNA疫苗中不可或缺的一部分,因為mRNA必須穿過細(xì)胞膜才能到達(dá)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行抗原蛋白表達(dá)。但由于mRNA帶有負(fù)電荷且分子量較大,容易被核酸酶降解[25］,很難到體內(nèi)發(fā)揮作用,所以就需要一種有效的遞送方式來解決這個難題。mRNA遞送系統(tǒng)的研發(fā)最早可追溯到1989年[8］,主要包括物理和化學(xué)兩種方式,前者通過電穿孔的方式,使靶組織生物膜表面瞬時形成微孔,讓mRNA通過,這種方式操作簡單,但由于電擊操作的可變因素較多,電脈沖也會對細(xì)胞造成一定損害,該方法的應(yīng)用受到了限制?；瘜W(xué)方式中最常用的是脂質(zhì)納米顆粒(LNP)遞送技術(shù)。LNP由4種成分組成,包括可電離的氨基脂質(zhì)、惰性親水性聚乙二醇(PEG)—脂質(zhì)、穩(wěn)定劑膽固醇和輔助磷脂。這些成分的精確比例可以增強(qiáng)LNP的穩(wěn)定性,從而促進(jìn)mRNA復(fù)合物的吸收,使得mRNA在準(zhǔn)確遞送至細(xì)胞內(nèi)的同時也得到準(zhǔn)確高效的翻譯,從而將抗原遞送給抗原遞呈細(xì)胞刺激機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[26］。在使用LNP時,可電離的氨基脂質(zhì)可以在低pH下與核酸縮合,促進(jìn)自組裝成病毒大小的顆粒,并將mRNA從內(nèi)體釋放到細(xì)胞質(zhì),惰性親水性聚乙二醇(PEG)—脂質(zhì)可以增加制劑的半衰期,并限制蛋白質(zhì)和細(xì)胞的相互作用,同時穩(wěn)定劑膽固醇可以填補(bǔ)LNP分子之間的間隙,提高穩(wěn)定性,并幫助LNP與內(nèi)體膜融合,輔助磷脂可以支持脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)。此外,LNP還可以保護(hù)mRNA分子不過早被TLR識別,避免先天免疫反應(yīng)過度激活[12］。由于其簡易、模塊化和生物兼容性等優(yōu)勢,LNP成為目前最有前途、研究最廣泛、進(jìn)展最快的mRNA遞送技術(shù)之一。

2.3 mRNA疫苗的獨(dú)特優(yōu)勢 mRNA疫苗相較于亞單位、滅活病毒和減毒活病毒以及DNA的疫苗等傳統(tǒng)疫苗具有高效性、安全性、適應(yīng)性、無需單獨(dú)佐劑等優(yōu)點(diǎn)。

2.3.1 高效性 mRNA疫苗研制速度遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)疫苗,是因為其生產(chǎn)過程不需要使用活病毒或細(xì)菌,也不需要培養(yǎng)細(xì)胞,只需要合成mRNA序列即可[25］。此外,mRNA疫苗可以在短時間內(nèi)產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng),是因為它不僅可以激活體液免疫,還可以激活細(xì)胞免疫,例如輝瑞和BioNTech共同研發(fā)的新冠mRNA疫苗BNT162b2,一次注射就足以引發(fā)人體高滴度的中和抗體反應(yīng)以及CD4輔助T細(xì)胞和CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)[27］。這也是mRNA疫苗的關(guān)鍵優(yōu)勢。

2.3.2 安全性 相比傳統(tǒng)的疫苗技術(shù),mRNA疫苗不包含活病毒或細(xì)菌,因此不會引起感染;無需進(jìn)入細(xì)胞核,直接在細(xì)胞質(zhì)翻譯,不存在基因組整合風(fēng)險。此外,mRNA疫苗在人體內(nèi)的半衰期較短,僅10 min左右[28］,不會在體內(nèi)長期停留,降低了不良反應(yīng)的風(fēng)險。

2.3.3 適應(yīng)性 mRNA疫苗可以根據(jù)病原體的變異來快速更新,以保持其對新型病毒株的有效性。這種靈活性使得mRNA疫苗可以更好地應(yīng)對新興病毒和傳染病的爆發(fā)。

2.3.4 無需單獨(dú)佐劑 傳統(tǒng)疫苗需要添加佐劑以增強(qiáng)免疫反應(yīng),但是mRNA疫苗的LNP組分具有佐劑活性,這種LNP驅(qū)動的佐劑活性能夠激活免疫系統(tǒng)[29］,因此不需要其他單獨(dú)佐劑。

3 mRNA技術(shù)在動物疫病研究中的應(yīng)用

mRNA技術(shù)在動物傳染病研究中的應(yīng)用相對滯后,尚無可臨床應(yīng)用的產(chǎn)品被批準(zhǔn)。目前國內(nèi)外動物傳染病mRNA疫苗的研究主要聚焦人獸共患病及幾種少數(shù)重要動物疫病的病原微生物,主要動物疫病mRNA疫苗的研究進(jìn)展見表1。

表1 幾種主要動物疫病mRNA疫苗的研究進(jìn)展一覽表

3.1 在狂犬病研究中的應(yīng)用 狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus, RV)引起人和所有溫血動物的一種接觸性傳染病,潛伏期較長,病死率可到達(dá)100%,犬、貓、人、牛、羊、豬等均易感[30］。RV的G蛋白是中和抗體識別的主要抗原。G蛋白為糖蛋白全長,其中G△TM蛋白為G糖蛋白的膜外部分;Gtrimer蛋白為G糖蛋白的三聚體(模擬病毒表面G蛋白天然構(gòu)象);除此之外,M蛋白是RV的膜蛋白,M蛋白可以調(diào)控病毒RNA復(fù)制及病毒的組裝,在病毒裝配和出芽過程中起關(guān)鍵作用[31］。目前主要通過疫苗免疫預(yù)防和控制該病?，F(xiàn)有Rabies疫苗包括滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位蛋白疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗等。我國現(xiàn)在使用的VERO細(xì)胞或地鼠腎細(xì)胞源的Rabies疫苗,均為滅活疫苗,盡管安全、有效,但是需多次接種才能產(chǎn)生足夠免疫、生產(chǎn)周期較長且費(fèi)用高等因素限制了該類疫苗的使用。因此,多個研究團(tuán)隊開展了以mRNA技術(shù)為載體的新型狂犬疫苗的研發(fā)。Saxena S等研究人員制造了一種表大RV G蛋白的mRNA疫苗。微小劑量的疫苗能夠使小鼠產(chǎn)生類似DNA疫苗引發(fā)的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng),小鼠產(chǎn)生了較高水平的中和抗體和足夠的免疫保護(hù)[32］。張夢玲等分別針對RV的G蛋白,G△TM蛋白、Gtrimer蛋白、M蛋白、Gtrimer蛋白和M蛋白的抗原組合設(shè)計了mRNA疫苗,發(fā)現(xiàn)這五種疫苗候選物均能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的中和抗體,顯示出很好的免疫原性[33］。此外,劉雋等將RV CTN-1毒株的G蛋白的mRNA序列進(jìn)行優(yōu)化合成和純化,之后將純化后的mRNA序列與適宜載體進(jìn)行組裝和包裝,形成mRNA疫苗顆粒,得到最終的mRNA疫苗制劑對小鼠通過靜脈注射、皮下注射或肌肉注射等方式進(jìn)行給藥,能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生RV G蛋白特異性的免疫反應(yīng)[34］。Margit Schnee使用mRNA技術(shù)開發(fā)了一種編碼RV G蛋白的mRNA,并將其注射到小鼠和家豬體內(nèi)。結(jié)果顯示,這種mRNA能夠誘導(dǎo)小鼠和家豬產(chǎn)生高水平的中和抗體,保護(hù)小鼠和家豬不被RV感染[35］。Stitz L等根據(jù)RV G蛋白設(shè)計的mRNA疫苗可有效保護(hù)小鼠感染RV,進(jìn)行人體Ⅰ期臨床試驗結(jié)果顯示,71%測試者皮下注射80或160 μg疫苗,46%測試者無針注射裝置肌肉注射200或400 μg疫苗,可誘導(dǎo)產(chǎn)生有充足保護(hù)效力的中和抗體[36］。這些研究數(shù)據(jù)顯示,基于不同蛋白設(shè)計的狂犬mRNA候選物均能使實驗動物產(chǎn)生高水平的中和抗體,部分免疫攻毒實驗數(shù)據(jù)顯示,候選物對免疫動物提供了有效保護(hù),使狂犬有望成為繼新冠后的下一個研制成功的mRNA疫苗。

3.2 在口蹄疫研究中的應(yīng)用 口蹄疫(Foot-and-mouth-disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth-disease virus, FMDV)引起的偶蹄獸的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,豬、牛、羊最易感,人也偶爾感染發(fā)病,是世界上現(xiàn)有家畜傳染病中最復(fù)雜、最受重視的疾病之一,傳播速度極快,往往會造成大范圍流行,傳染性極強(qiáng)。

Pulido MR等將O血清型FMDV的基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA注入小鼠體內(nèi)。小鼠分為四組,其中一組為對照組注射生理鹽水,另外三組分別注入10 μg、50 μg以及100 μg體外轉(zhuǎn)錄的mRNA,其中接種mRNA的小鼠中,58%的小鼠都產(chǎn)生了高滴度的FMDV中和抗體,隨后對這些小鼠進(jìn)行攻毒實驗,發(fā)現(xiàn)免疫的小鼠中,有38%的小鼠得到了有效的保護(hù)。該結(jié)果表明,使用FMDV基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA可以在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高水平的抗體[37］,但如何產(chǎn)生足夠有效的免疫保護(hù)還需進(jìn)一步探討。

3.3 在豬繁殖與呼吸綜合征研究中的應(yīng)用 豬繁殖與呼吸綜合征病(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁殖和呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起豬的一種接觸性傳染病,主要導(dǎo)致仔豬呼吸道疾病和母豬繁殖障礙,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[38］。賀筍等利用PRRSV含有中和抗原表位的結(jié)構(gòu)蛋白GP3、GP4、GP5、M和N蛋白,通過不同組合方式,將挑選的含有抗原表位的基因通過linker連接起來,進(jìn)行后期融合表達(dá)。這5種蛋白根據(jù)不同的排列組合構(gòu)建了三種mRNA疫苗,將這三種疫苗免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)這些疫苗均能夠模擬天然感染的過程,在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)被翻譯、修飾,可以被MHCⅠ類分子和MHCⅡ類分子呈遞,激活機(jī)體產(chǎn)生特異性的CD8+和CD4+T細(xì)胞,從而產(chǎn)生高水平的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答[39］。

3.4 在流感研究中的應(yīng)用 流感(Influenza)是由流感病毒(Influenza virus)引起的人獸共患傳染病,通常只感染禽類,但個別亞型也會感染豬或人。本病廣泛分布于世界各地,甲型和乙型流感病毒呈季節(jié)性流行,每年有近300萬～500萬例病例,造成全世界29萬～65萬人死亡[40］。禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)屬于甲型流感病毒,根據(jù)病毒表面蛋白囊膜的血凝素(HA,)及神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性不同分為18種血凝素亞型和11種神經(jīng)氨酸酶亞型[41］。目前針對不同亞型的AIV疫苗具有良好的免疫保護(hù)效果,但由于AIV頻繁的基因突變和重組,需要及時更新疫苗以應(yīng)對疫苗與流行株之間存在的抗原差異。目前,廣泛使用的AIV滅活疫苗和減毒活疫苗等傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)周期長,無法及時研發(fā)出候選疫苗應(yīng)對AIV的頻繁變異,而mRNA疫苗由于生產(chǎn)周期較短,工藝與傳統(tǒng)疫苗相比也更簡單,有望成為未來代替?zhèn)鹘y(tǒng)疫苗的新型AIV候選疫苗。一項早期研究表明,用編碼HA抗原的自擴(kuò)增性mRNA(self‐amplifying mRNA,SAM)疫苗進(jìn)行免疫,可使小鼠產(chǎn)生特異性抗體和部分保護(hù)力,免受致病的同源病毒攻擊[42］。另一項研究針對H9N2亞型AIV設(shè)計出mRNA疫苗候選物,并對其安全性和免疫效力進(jìn)行了評估,發(fā)現(xiàn)候選物對雞安全,并可使SPF雞產(chǎn)生高水平的體液免疫以及細(xì)胞免疫。與AIV全病毒滅活疫苗比較,對SPF雛雞免疫25 μg mRNA疫苗的抗體與全病毒滅活疫苗水平相當(dāng),之后對兩種疫苗免疫的SPF雛雞進(jìn)行攻毒實驗,熒光定量PCR檢測咽拭子以及肺臟、氣管、十二指腸和腺胃發(fā)現(xiàn),25 μg免疫劑量免疫的mRNA疫苗組與全病毒滅活疫苗組,除氣管之外各個組織的病毒載量極顯著低于未免疫的對照組(P<0.01),氣管中全病毒滅活疫苗組顯著低于對照組(P<0.05),25 μg免疫的mRNA疫苗組極顯著低于對照組(P<0.01)[43］。這項結(jié)果表明mRNA疫苗在免疫保護(hù)上與滅活疫苗水平相當(dāng),但是mRNA疫苗生產(chǎn)周期比滅活疫苗的生產(chǎn)周期要短很多,這也大大彰顯了mRNA疫苗的獨(dú)特優(yōu)勢。Chahal J S等構(gòu)建了包括H1N1 HA抗原、剛地弓形蟲抗原和埃博拉病毒多種抗原表達(dá)的mRNA疫苗,可以對H1N1 AIV、剛地弓形蟲和埃博拉病毒等多種致病性病原體免疫保護(hù),產(chǎn)生特異性CD8+T細(xì)胞和抗體反應(yīng),攻毒試驗結(jié)果表明,免疫一次即可使小鼠得到對H1N1 AIV的有效保護(hù)[44］。Vogel等用表達(dá)幾種不同血清型的HA抗原的SAM疫苗對小鼠進(jìn)行免疫,能夠有效預(yù)防H1N1流感病毒[45］。Arevalo等開發(fā)了一種編碼了所有已知的20種甲型和乙型流感病毒亞型的HA抗原的mRNA(20-HAmRNA-LNP)疫苗,研究證明該疫苗可以同時誘導(dǎo)小鼠和雪貂產(chǎn)生對多種抗原的免疫反應(yīng)[46］。

3.5 在猴痘研究中的應(yīng)用 猴痘(Monkeypox,Mpox)是一種由猴痘病毒(Monkeypox virus,MPXV)感染所致的病毒性人畜共患病,人類中出現(xiàn)的癥狀與過去在天花患者身上所看到的癥狀相似,但是自1980年世界上消滅天花以后,MPX成為現(xiàn)存最為嚴(yán)重的且由正痘病毒引起的疾病[47］。Yang等構(gòu)建了3種表達(dá)MPX A35R蛋白和M1R蛋白的mRNA疫苗,其中VGPox1和VGPox2是編碼由A35R的胞外結(jié)構(gòu)域和全長的M1R組成的融合蛋白,兩者的區(qū)別在于VGPox2去除了A35R的莖區(qū)。而VGPox3含有兩個單獨(dú)的mRNA-LNP的混合物,分別編碼A35R和M1R。免疫小鼠結(jié)果顯示VGPox1和VGPox2比VGPox3具有更好的抗病毒能力[48］。

3.6 在弓形蟲病研究中的應(yīng)用 弓形蟲是一種單細(xì)胞寄生蟲,其學(xué)名為Toxoplasmagondii,是一種廣泛分布于世界各地的寄生蟲。弓形蟲能夠感染人類和其他哺乳動物。弓形蟲感染每年會導(dǎo)致超過100萬人死亡。Chahal J S等人在他們的研究中利用樹突狀納米粒子封裝mRNA復(fù)制體,開發(fā)了一種六價mRNA疫苗。該疫苗的抗原是弓形蟲的多個生命周期階段中高度保守的蛋白質(zhì),包括GRA6、ROP2A、ROP18、SAG1、SAG2A和AMA1。他們對小鼠進(jìn)行了接種,每個小鼠接種單劑40 μg的疫苗(每個復(fù)制子6.67 μg),結(jié)果發(fā)現(xiàn)該疫苗可以保護(hù)小鼠在致命劑量的弓形蟲感染中存活超過6個月[44］。這項研究表明,利用樹突狀納米粒子封裝mRNA復(fù)制體制備的六價mRNA疫苗具有很高的保護(hù)效力,可以為弓形蟲感染提供新的預(yù)防和控制手段。Luo F等構(gòu)建了表達(dá)弓形蟲核苷三磷酸水解酶-Ⅱ(NT-Pase-Ⅱ)蛋白的LNPs-saRNA 疫苗,該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體;攻毒保護(hù)試驗顯示,免疫小鼠存活時間延長且腦內(nèi)弓形蟲量減少至對照組的46.4%[49］。

3.7 在細(xì)菌性疾病研究中的應(yīng)用 mRNA技術(shù)在病毒上有較多的研究,只有極少數(shù)細(xì)菌抗原被嘗試用于mRNA疫苗的構(gòu)建。2017年,Maruggi G等人設(shè)計了兩種預(yù)防性SAM疫苗,分別與編碼A組鏈球菌溶血素-O(SLOdm)和B組鏈球菌(GBS)鏈球菌的毛發(fā)2a骨架蛋白(BP-2a)混合,接種小鼠進(jìn)行動物試驗,結(jié)果小鼠成功產(chǎn)生大量全功能抗體[50］。

在單一病原菌致病種中,細(xì)菌病原菌結(jié)核分枝桿菌致死率長期居全球首位。盡管如此,只有一種疫苗獲準(zhǔn)針對人類結(jié)核:卡介苗(BCG),這是一種減毒全細(xì)胞疫苗,但臨床上存在局限性,一是卡介苗免疫效力在不同個體中差異較大中,免疫力較弱的人群即使免疫了卡介苗依然可能感染結(jié)核;二是BCG由許多遺傳上不同的亞菌株組成。這些遺傳差異是否以及如何影響B(tài)CG的效力仍然未知[51］。MVA85A是一種表達(dá)單抗原Ag85A的結(jié)核亞單位疫苗,在IIb期試驗中沒有顯著改善保護(hù)作用[52］。失敗案例說明與病毒感染相比,細(xì)菌感染往往具有更復(fù)雜的階段,具有多種分子表達(dá)特征,僅表達(dá)單個抗原無法滿足免疫保護(hù)要求。未來mRNA疫苗想進(jìn)一步應(yīng)用于細(xì)菌感染的預(yù)防和治療領(lǐng)域,應(yīng)考慮更多的優(yōu)化,包括各種抗原或表位的選擇和重組,不同靶抗原的周期性給藥,甚至直接添加佐劑等被動免疫組合物[53］。

4 存在問題及展望

在過去的十年里,mRNA技術(shù)已經(jīng)從實驗室走向臨床應(yīng)用,取得了良好效果。這種生物技術(shù)領(lǐng)域的突破性進(jìn)展在冠狀病毒病(COVID-19)全球大流行期間表現(xiàn)得尤為明顯,也標(biāo)志著mRNA技術(shù)正在逐步走向成熟。到目前為止,許多實驗證明了mRNA疫苗無論從mRNA本身的特性,還有引發(fā)的免疫反應(yīng)情況等方面來看,都優(yōu)于亞單位疫苗、滅活疫苗等傳統(tǒng)疫苗[54］。

雖然mRNA技術(shù)發(fā)展迅速,但是它也存在一些問題和挑戰(zhàn),主要表現(xiàn)在以下幾個方面。一是mRNA技術(shù)用于設(shè)計疫苗,首先需找到對該疫病可產(chǎn)生免疫保護(hù)力的關(guān)鍵蛋白以及最適UTR和質(zhì)粒載體,而不像滅活病毒疫苗那樣直接全病毒滅活,如何尋找最適蛋白及UTR和載體是至關(guān)重要的問題。此外,在設(shè)計mRNA序列時需要考慮到對細(xì)胞的毒性和免疫反應(yīng)等因素[55］,這也增加了技術(shù)的復(fù)雜性。二是mRNA分子的穩(wěn)定性較差,容易被降解,導(dǎo)致注射進(jìn)體內(nèi)沒有效果,所以如何保存mRNA疫苗不被降解也是一個難題。三是目前mRNA制備所涉及的幾項關(guān)鍵原材料,由于受專利保護(hù)、技術(shù)壁壘、制備流程等因素限制,成本較高,若構(gòu)建動物疫病mRNA疫苗,如何降低成本,也是需要解決的難點(diǎn)問題。

針對這些問題,要在病原端及基于LNP的mRNA疫苗凍干工藝端加快步伐。首先需要充分了解某種病原,收集病原UTR等序列庫以供篩選,并建立自有的質(zhì)粒載體,滿足線性化酶切這一特殊需求;同時,也應(yīng)該建立平臺性的mRNA設(shè)計和篩選流程、以及平臺性的工藝路線,即可適用于幾乎所有的mRNA序列。研究表明基于LNP的mRNA疫苗凍干化處理后可以在室溫下長期儲存[56］,這為mRNA疫苗的儲存和運(yùn)輸提供了一個潛在的解決方案。同時,對于目前尚存在的專利保護(hù)及技術(shù)壁壘等問題,希望能夠隨著全球合作的進(jìn)一步深化以及mRNA技術(shù)的進(jìn)一步成熟來解決。

總體來說,mRNA技術(shù)是一項具有廣闊前景的生物技術(shù),它可以為許多疾病的治療提供新的思路和方法,比如腫瘤疾病,遺傳學(xué)疾病及各種自身免疫疾病,相信mRNA技術(shù)會成為這些疫苗開發(fā)的新突破;同時也會推動更多的動物mRNA疫苗的研發(fā)和應(yīng)用,比如一些重要的動物傳染病,如非洲豬瘟、豬圓環(huán)病毒病、犬貓細(xì)小病毒病等,可以根據(jù)這些病毒的靶抗原或者多種組合抗原的形式設(shè)計mRNA候選疫苗,隨著mRNA技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展以及對這些疾病的進(jìn)一步探索,開發(fā)這些疾病的mRNA候選疫苗是非常有前途的策略。