耿智霞,王玉欣,賈 興,瞿紅穎,宋婷婷,劉 靜,郭李珉,劉 欣,曹興元,王德功*

(1.河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司,石家莊 050041;2.河北省獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心,石家莊 050041;3.石家莊市獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心,石家莊 050041;4.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),北京 100094)

卡洛芬(carprofen)是2-芳基丙酸類非甾體抗炎藥(NSAIDs),與其他NSAIDs一樣,是花生四烯酸級(jí)聯(lián)酶環(huán)加氧酶的抑制劑,通過抑制前列腺素合成而發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用,具有吸收快、副作用小等特點(diǎn)[3］?？宸易⑸湟河?008年由碩騰公司公司開發(fā),用于輔助治療牛呼吸道疾病[1］和急性乳腺炎[2］,是高效的動(dòng)物用抗炎藥[4］。在使用抗菌藥的同時(shí)聯(lián)合使用卡洛芬注射液,可以快速緩解病牛發(fā)熱并顯著降低肺組織炎癥反應(yīng)。目前,該藥物在我國(guó)還沒有上市。本試驗(yàn)研究了卡洛芬注射液在青年牛體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征,并將其作為受試制劑與碩騰公司產(chǎn)品(Rimadyl Cattle 50 mg/mL Solution for Injection)進(jìn)行對(duì)比分析,獲取卡洛芬注射液在靶動(dòng)物牛體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù),為制定合理的給藥方案提供數(shù)據(jù)支持,同時(shí)也為新獸藥研發(fā)和臨床用藥提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼料 荷斯坦牛8頭,年齡為15月齡及以上,體重為350-400 kg,來自萊西市眾合興牧奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)。所有試驗(yàn)動(dòng)物將被開放集中飼養(yǎng)在牛舍中,保持牛舍環(huán)境適宜牛的生長(zhǎng),常規(guī)飼喂青儲(chǔ)飼料和牧草,可以通過飲水槽隨意飲水。

1.1.2 供試藥品及試劑 卡洛芬注射液(規(guī)格:100 mL∶5 g;批號(hào):KLF020902)由河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司生產(chǎn);卡洛芬注射液參比制劑(規(guī)格:50 mL∶2.5 g;批號(hào):M4613-09)由碩騰動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn));卡洛芬對(duì)照品(批號(hào):C153919)購自美國(guó)SIGMA公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源,美國(guó)Waters公司);分析天平(感量0.00001 g,Precisa公司);電子天平(感量0.01 g,Sartorius公司);高速冷凍離心機(jī)(Hettich公司);渦旋混合器(北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司)。

1.1.4 主要試劑 乙腈:色譜純;甲醇:色譜純;甲酸:質(zhì)譜純均購自MERK公司。

1.2 方法

1.2.1 藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在適應(yīng)期,將8頭牛隨機(jī)分為兩組,并按照升序的方式,隨機(jī)給每頭牛編號(hào)為1～8。利用EXCEL隨機(jī)數(shù)生成器對(duì)8頭牛隨機(jī)選擇。利用上述方式將8頭牛隨機(jī)分為以下兩組:RT組:第1周期給予參比制劑,第2周期給予受試制劑;TR組:第1周期給予受試制劑,第2周期給予參比制劑。

按照隨機(jī)單劑量,雙周期雙交叉原則設(shè)計(jì)給藥。受試制劑和參比制劑都采用推薦的單次皮下注射方式給藥,給藥劑量為1.4 mg/kg BW。在給藥后不同時(shí)間點(diǎn),從牛的頸靜脈采血5 mL置于抗凝采血管中。具體的采血時(shí)間點(diǎn)如下:0 h(給藥前)、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48、72、96、120 h、144 h、168 h、192 h、216 h、240 h。將采集的血液離心,取血漿層,在-20 ℃的低溫冰箱中冷凍保存,直至動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)束。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:廠家:Phenomenex,型號(hào):Kinetex 2.6 μC18 100A 50 mm×2.1 mm;流速:0.45 mL/min;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相:0.1% 甲酸水溶液,0.1%甲酸乙腈溶液(梯度洗脫條件見表1)。

表1 梯度洗脫條件

1.2.3 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源;掃描方式:負(fù)離子掃描;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè); 離子源溫度:120 ℃;脫溶劑溫度:350 ℃;毛細(xì)管電壓:3.0kV;脫溶劑氣流速:800L/h;Q1,Q3均為單位分辨率(表2)。

表2 定量離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量

1.2.4 血漿樣品前處理 取血漿100 μL,加標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μL,渦動(dòng)10 s。加入300 μL乙腈,渦動(dòng) 2 min,4 ℃下以8000 rpm離心20 min,取出上清液。進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.2.5 方法確證

1.2.5.1 特異性 分析空白血漿(n=20),觀察在藥峰出現(xiàn)的區(qū)域是否有干擾信號(hào)。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別設(shè)置六個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液,依次為10 ng/mL,20 ng/mL,100 ng/mL,500 ng/mL,1000 ng/mL和5000 ng/mL,依據(jù)設(shè)定濃度加入標(biāo)準(zhǔn)品,將所得峰面積為縱坐標(biāo),以相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到相應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與相關(guān)系數(shù)。

1.2.5.3 方法的檢出限與定量限 本試驗(yàn)中采用最常見的檢出限與定量限的確定方法:信噪比法:分別以3倍信噪比和10倍信噪比作為檢出限和定量限。

1.2.5.4 方法的準(zhǔn)確度與精密度 通過添加回收試驗(yàn)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度與精密度,分別用回收率和變異系數(shù)表示準(zhǔn)確度和精密度。選擇以20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL進(jìn)行添加回收。每日三個(gè)不同濃度,每個(gè)濃度5個(gè)重復(fù),持續(xù)3天,分別計(jì)算回收率,日內(nèi)變異系數(shù),日間變異系數(shù)。

1.2.5.5 方法的穩(wěn)定性試驗(yàn) 待測(cè)藥物在凍融過程中的穩(wěn)定性 分別添加三個(gè)不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標(biāo)準(zhǔn)品于血漿中混勻,于-20 ℃冰箱中,每個(gè)濃度分成3份;將樣品反復(fù)凍融三次,與新鮮添加的血漿樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),待測(cè)物在凍融過程中的穩(wěn)定性。

待測(cè)藥物在室溫的穩(wěn)定性 分別添加三個(gè)不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標(biāo)準(zhǔn)品于血漿中混勻,進(jìn)行前處理檢測(cè)待測(cè)物。室溫24 h后以同樣的方法再次制備樣品進(jìn)行前處理檢測(cè)樣品,分析樣品在室溫的穩(wěn)定性。

前處理后待測(cè)物的穩(wěn)定性 分別添加三個(gè)不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標(biāo)準(zhǔn)品于血漿中混勻,進(jìn)行前處理,分別在前處理結(jié)束后0 h,8 h檢測(cè)樣品,分析前處理后待測(cè)物的穩(wěn)定性。

待測(cè)物在血漿中的穩(wěn)定性 分別添加三個(gè)不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標(biāo)準(zhǔn)品于血漿中混勻,分別在第0,21天進(jìn)行前處理檢測(cè),分析待測(cè)藥物在血漿中的穩(wěn)定性。

1.2.6 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 WinNonlin8.1版本的軟件(Pharsight公司)非房室分析方法進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法確證

2.1.1 特異性 分析不同來源的空白血漿樣品,目標(biāo)化合物的保留時(shí)間附近沒有雜質(zhì)干擾。

2.1.2 線性范圍 在10-5000 ng/mL的濃度范圍內(nèi),方法的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)≥0.99,線性方程為y=2.4508x+ 3.61186,r2=0.990178。

2.1.3 準(zhǔn)確度和精密度 三個(gè)添加濃度的回收率在90.51～104.55%;批內(nèi)變異系數(shù)均小于14.71%,批間變異系數(shù)均小于11.30 %。

2.1.4 檢測(cè)限與定量限 以3倍信噪比作為檢出限,10倍信噪比為定量限,卡洛芬的方法檢出限為5 ng/mL,定量限為10 ng/mL。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 待測(cè)藥物在凍融過程中的穩(wěn)定性 分別添加三個(gè)不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標(biāo)準(zhǔn)品的血漿樣品在凍融過程中(-20 ℃),待測(cè)藥物的響應(yīng)值的變異系數(shù)分別為0.98%、5.62%和8.69%,均低于20%。

待測(cè)藥物在室溫的穩(wěn)定性 分別添加三個(gè)不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標(biāo)準(zhǔn)品于血漿中混勻,進(jìn)行前處理檢測(cè)待測(cè)物。室溫24 h后以同樣的方法再次制備樣品進(jìn)行前處理檢測(cè)樣品,分析樣品在室溫的穩(wěn)定性。待測(cè)藥物的響應(yīng)值的變異系數(shù)分別為0.01%、0.47%和0.50%,均低于20%。

前處理后待測(cè)物的穩(wěn)定性分別添加三個(gè)不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標(biāo)準(zhǔn)品的血漿樣品在前處理后,待測(cè)藥物的響應(yīng)值的變異系數(shù)分別為0.07%、2.53%和2.65%,均低于20%。

待測(cè)物在血漿中的穩(wěn)定性 分別添加三個(gè)不同濃度(20 ng/mL,500 ng/mL,2000 ng/mL)的卡洛芬標(biāo)準(zhǔn)品在血漿中,新鮮制備及制備后21天時(shí)待測(cè)藥物的響應(yīng)值的變異系數(shù)分別為11.36%、8.73%和0.01%,均低于20%。

2.2 藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)結(jié)果 自動(dòng)物試驗(yàn)開始直至結(jié)束,皮下給藥后,未觀察到明顯的臨床異常現(xiàn)象。試驗(yàn)對(duì)受試藥物卡洛芬注射液開展了在牛體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。研究采用隨機(jī)單劑量、雙周期雙交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。牛分別以1.4 mg/kg BW(以卡洛芬計(jì))經(jīng)皮下注射給藥受試制劑和參比制劑,不同時(shí)間點(diǎn)采取血樣,隨后經(jīng)建立并驗(yàn)證的UPLC-MS/MS方法對(duì)牛血漿中卡洛芬的含量進(jìn)行檢測(cè)分析,對(duì)測(cè)定的血藥濃度數(shù)據(jù)經(jīng)WinNonlin8.1軟件的非房室模型模塊進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算。受試制劑組卡洛芬注射液和參比制劑組卡洛芬注射液以1.4 mg/kg BW劑量皮下注射給藥后在牛血漿中卡洛芬的藥時(shí)曲線見圖1。

圖1 皮下注射液卡洛芬注射液后卡洛芬在牛血漿中的藥時(shí)曲線

卡洛芬注射液受試制劑以1.4 mg/kg BW(以卡洛芬計(jì))單劑量皮下注射給藥后,卡洛芬的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù):Cmax和Tmax分別為(17473.30 ±2398.73)ng·mL-1和(8.00±2.62)h,說明卡洛芬吸收較快,達(dá)峰時(shí)間較快。T1/2和MRTlast分別為(55.69±3.25)h和(48.29±2.59)h,說明卡洛芬皮下注射給藥后在牛體內(nèi)消除較慢,滯留時(shí)間較長(zhǎng)。AUClast為(1052647.93±143055.37)h·ng· mL-1,動(dòng)物個(gè)體之間存在較大變異。

卡洛芬注射液參比制劑以1.4 mg/kg BW(以卡洛芬計(jì))單劑量皮下注射給藥后,卡洛芬的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù):Cmax和Tmax分別為(15695.98 ±4865.73)ng·mL-1和(8.50±2.98)h,說明卡洛芬吸收較快,達(dá)峰時(shí)間較快。T1/2和MRTlast分別為(55.03±2.64)h和(47.46±0.82)h,說明卡洛芬皮下注射給藥后在牛體內(nèi)消除較慢,滯留時(shí)間較長(zhǎng)。AUClast為(1002858.15±297235.31)h·ng· mL-1,動(dòng)物個(gè)體之間存在較大變異。

將受試制劑組卡洛芬注射液皮下注射給藥后藥-時(shí)曲線下面積(AUClastT)與參比制劑組卡洛芬注射液皮下注射給藥后藥-時(shí)曲線下面積(AUClastR)比較,經(jīng)公式FPO=(DoseR/DoseT)×(AUClastT/AUClastR)計(jì)算皮下注射給藥后卡洛芬的相對(duì)生物利用度為104.96%。

卡洛芬注射液受試制劑組和參比制劑組皮下注射給藥后卡洛芬的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3。

表3 皮下注射給藥后,卡洛芬的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=8)

3 討 論

據(jù)Morris T H等報(bào)道[5-9］,目前卡洛芬血藥濃度測(cè)定法常用高效液相色譜法,該法存在步驟繁瑣,使用乙醚等危險(xiǎn)試劑且樣品處理時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低等缺點(diǎn)。本研究建立了牛血漿樣品中卡洛芬含量檢測(cè)的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法,該方法步驟簡(jiǎn)單,能縮短樣品處理時(shí)間,使用常規(guī)分析試劑,操作方便,靈敏度和準(zhǔn)確度高,回收率高且雜質(zhì)峰少,樣品溶液穩(wěn)定性好,與血漿中其他成分分離度高,可應(yīng)用于卡洛芬在牛體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究。

本研究表明,受試制劑和參比制劑卡洛芬注射液在牛體內(nèi)的消除半衰期分別為55.69 h和55.03 h,與文獻(xiàn)報(bào)道[10］結(jié)果相同,即牛體內(nèi)卡洛芬的血漿消除半衰期在44.5 h至64.6 h吻合。另有報(bào)道[11］,對(duì)健康奶牛和內(nèi)毒素致乳腺炎奶牛為試驗(yàn)對(duì)象,采用0.7 mg/kg體重單次靜脈注射卡洛芬,消除半衰期分別為30.7 h和43.0 h,與本次試驗(yàn)結(jié)果有差異的原因可能與給藥方式及給藥劑量有關(guān)。

疼痛管理是人類和獸醫(yī)醫(yī)學(xué)的一個(gè)組成部分[12］。國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)(IASP)將疼痛定義為“與實(shí)際或潛在的組織損傷相關(guān)或類似不愉快的感官和情感體驗(yàn)”,鎮(zhèn)痛對(duì)于減少生理應(yīng)激、改善動(dòng)物福利、康復(fù)和提高治療成功率至關(guān)重要[13］。非甾體抗炎藥是人類和獸藥中最常用的鎮(zhèn)痛類藥物之一,除了鎮(zhèn)痛作用外,非甾體抗炎藥還具有抗炎和退熱的優(yōu)良特性。由于非甾體抗炎藥的治療范圍很窄,盡管在推薦劑量下相對(duì)安全,但個(gè)體敏感性可能會(huì)使動(dòng)物中毒[14］。因此,開發(fā)非甾體抗炎藥的新產(chǎn)品卡洛芬注射液,須注意藥物在靶動(dòng)物使用中的安全性,進(jìn)行卡洛芬注射液在牛體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究將對(duì)其新獸藥研發(fā)和臨床試驗(yàn)劑量制定提供重要參考。