孫 丹,黃小潔,薛 麒,秦義嫻,高月異,孫 淼,劉 丹*

(1.北京市獸藥飼料監(jiān)測(cè)中心,北京 102200;2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

牛病毒性腹瀉病(bovine viral diarrhea disease,BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一種接觸性傳染病,以發(fā)熱、腹瀉、消化道黏膜壞死、潰爛、持續(xù)性感染等為特征[1-3］。BVD在國(guó)內(nèi)外地區(qū)均廣泛流行,其致病機(jī)制復(fù)雜且缺乏有效的治療手段,給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-6］。BVDV屬于黃病毒科瘟病毒屬,是一種長(zhǎng)度約12.3 kb的單股正鏈RNA病毒,在遺傳上分為BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3型,其基因型主要由5′UTR區(qū)、Npro和E2蛋白編碼區(qū)決定。E2蛋白是BVDV主要的結(jié)構(gòu)蛋白,位于病毒粒子的表面,是最早產(chǎn)生抗體的囊膜糖蛋白,因此可用于BVD的快速診斷[7-9］。

BVDV基因型和基因亞型眾多,給該病的檢測(cè)和預(yù)防帶來(lái)了嚴(yán)重挑戰(zhàn),特別是持續(xù)性感染,加重了該病的傳播,因此對(duì)患病牛和帶毒牛的檢測(cè)和淘汰非常必要。BVD的檢測(cè)和鑒定方法主要有病原學(xué)檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)。病原學(xué)檢測(cè)包括病毒分離、電鏡技術(shù)、分子生物學(xué)檢測(cè)等;血清學(xué)檢測(cè)包括血清中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫熒光技術(shù)和ELISA方法等。其中ELISA方法具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)等特點(diǎn),技術(shù)比較成熟,能實(shí)現(xiàn)樣本的快速和高通量檢測(cè),最適于在基層推廣使用[10-11］。本研究對(duì)BVDV-1標(biāo)準(zhǔn)株C24V株的E2基因進(jìn)行分析和密碼子優(yōu)化,利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)E2蛋白,建立基于E2蛋白的BVDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法,以期為BVDV大批量樣本的抗體檢測(cè)和流行病學(xué)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、病毒和血清 pET22b載體、E.coliBL21(DE3)購(gòu)自北京擎科生物技術(shù)公司;中和試驗(yàn)用BVDV NADL株和MDBK細(xì)胞由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存;BVDV陽(yáng)性血清和陰性血清、160份BVDV臨床樣本血清(收集自內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)和河北張家口地區(qū)牛場(chǎng))、牛副流感病毒3型(BPIV3)陽(yáng)性血清、牛傳染性鼻氣管炎(IBRV)陽(yáng)性血清、牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)陽(yáng)性血清等由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。

1.2 主要試劑 IPTG、氨芐青霉素購(gòu)自Amresco公司;明膠、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗牛IgG購(gòu)自Sigma公司;蛋白預(yù)染Marker、TMB單組份顯色液、終止液、包被液均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司;BVDV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 pET22b-E2原核表達(dá)載體的構(gòu)建 以BVDV-1 C24V株基因序列(GenBank登錄號(hào)L07496.1)為基礎(chǔ),密碼子優(yōu)化后進(jìn)行基因合成目的片段,通過(guò)同源重組將目的片段亞克隆至pET22b表達(dá)載體,經(jīng)測(cè)序鑒定正確后命名為pET22b-E2。

1.4 E2蛋白的表達(dá)、鑒定和純化 pET22b-E2轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3),得到的菌液加入IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行表達(dá)測(cè)試,確認(rèn)目的蛋白有表達(dá)后進(jìn)行蛋白的純化測(cè)試。

1.5 間接ELISA方法的優(yōu)化 以純化后的E2蛋白作為包被抗原,采用間接ELISA方法作為基礎(chǔ),分別對(duì)影響間接ELISA反應(yīng)的各個(gè)因素進(jìn)行方陣優(yōu)化。

1.5.1 確定抗原包被濃度和陰陽(yáng)性血清稀釋度 使用包被液將純化的E2蛋白稀釋為8、4、2、1、0.5 μg/mL 5個(gè)稀釋度。將陰陽(yáng)性血清分別做1∶40、1∶80、1∶160和1∶320稀釋,封閉液選擇1%明膠,酶標(biāo)二抗作1∶5000稀釋,按常規(guī)ELISA方法進(jìn)行方陣滴定試驗(yàn),用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值。以P/N最大且陽(yáng)性血清OD450nm≥1.0、陰性血清OD450nm≤0.2作為判定最優(yōu)的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5.2 確定最佳封閉液 按照優(yōu)化的包被濃度和血清稀釋度,分別選擇5%脫脂奶、1%明膠、10%山羊血清、10%馬血清、1%BSA、10%兔血清作為封閉液,按照上述方法和判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn),確定最佳封閉液。

1.5.3 確定血清最佳作用方式 將陰陽(yáng)性血清分別于室溫和37 ℃孵育30 min、60 min,測(cè)定OD450nm值,確定血清最佳作用溫度和時(shí)間。

1.5.4 確定酶標(biāo)二抗工作濃度 將HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG分別作1∶2000、1∶4000、1∶6000和1∶8000稀釋,選擇已經(jīng)優(yōu)化好的條件、確定最佳二抗?jié)舛取?/p>

1.5.5 確定酶標(biāo)二抗最佳作用方式 將酶標(biāo)二抗分別于室溫和37 ℃孵育30 min、60 min,測(cè)定OD450nm值,確定酶標(biāo)二抗最佳作用溫度和時(shí)間。

1.5.6 最佳底物作用時(shí)間的優(yōu)化 按照已經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)條件,將TMB底物分別避光置室溫作用10 min、20 min和30 min加入終止液終止反應(yīng),確定底物最佳作用時(shí)間。

1.7 ELISA方法的特異性試驗(yàn) 將建立的ELISA方法對(duì)BVDV抗體陽(yáng)性牛血清、IBRV 抗體陽(yáng)性牛血清、BPIV3抗體陽(yáng)性牛血清、BRSV抗體陽(yáng)性牛血清以及BVDV抗體陰性牛血清進(jìn)行同步檢測(cè),根據(jù)OD450nm值判定有無(wú)交叉反應(yīng),以評(píng)價(jià)建立方法的特異性。

1.8 ELISA方法的敏感性試驗(yàn) 將BVDV陽(yáng)性血清稀釋至 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400倍,用建立的ELISA方法進(jìn)行檢測(cè),以評(píng)估方法的敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn):使用同一批純化的E2蛋白包被酶標(biāo)板,檢測(cè)5份不同抗體水平的BVDV陽(yáng)性血清樣品和1份BVDV陰性血清樣品,計(jì)算變異系數(shù)。批間重復(fù)性試驗(yàn):取3塊不同時(shí)間包被在不同酶標(biāo)板的試劑盒,檢測(cè)5份不同抗體水平的BVDV陽(yáng)性血清樣品和1份BVDV陰性血清樣品,每份血清做3個(gè)重復(fù),計(jì)算并分析結(jié)果。

1.10 臨床樣本檢測(cè) 選取160份臨床牛血清樣品,應(yīng)用建立的間接ELISA方法進(jìn)行BVDV抗體檢測(cè),并與微量血清中和試驗(yàn)、商品化試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,計(jì)算符合率情況。

參照常規(guī)方法進(jìn)行微量血清中和試驗(yàn):采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)MDBK細(xì)胞至長(zhǎng)滿單層;將BVDV NADL株病毒稀釋至200 TCID50/0.1mL;將待檢血清做5倍稀釋,取血清200 μL加入200 μL工作抗原,充分混合后置37 ℃作用2 h;取MDBK 96孔細(xì)胞板,棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,每孔加入血清病毒中和液100 μL,每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔,至37 ℃吸附1 h后,每孔補(bǔ)加100 μL細(xì)胞維持液,繼續(xù)培養(yǎng),每日觀察細(xì)胞病變,第5日進(jìn)行判定;同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清和病毒對(duì)照。待檢血清在1∶5稀釋時(shí)有2個(gè)或2個(gè)以上孔的細(xì)胞未出現(xiàn)細(xì)胞病變判為血清陽(yáng)性,否則判為血清陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 E2蛋白的原核表達(dá) 重組質(zhì)粒pET22b-E2轉(zhuǎn)化BL21(DE3),得到的菌液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示目的蛋白在40 kD左右出現(xiàn)明顯條帶,有可溶性表達(dá)和包涵體表達(dá)兩種形式,可溶性表達(dá)蛋白經(jīng)純化后效果較好(圖1A)。Western-blot檢測(cè)結(jié)果表明,重組E2蛋白能與BVDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖1B)。

A: pET22b-E2誘導(dǎo)表達(dá);1. Marker; 2. pET22b-E2未誘導(dǎo); 3. 誘導(dǎo)樣品上清; 4. 誘導(dǎo)樣品沉淀; 5. 可溶蛋白純化樣品B: Western-blot鑒定E2蛋白; 1. Marker; 2. E2蛋白

2.2 間接ELISA方法的方陣優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度的確定 由表1可以看出,抗原包被濃度為1 μg/mL、血清稀釋倍數(shù)為1∶40時(shí),P/N值最大,陽(yáng)性血清OD450nm≥1.0且陰性血清OD450nm≤0.2,所以確定抗原包被濃度為1 μg/mL,血清稀釋倍數(shù)為1∶40。

表1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度選擇

2.2.2 最佳封閉液選擇 選擇封閉液為1%明膠于37 ℃封閉1 h,P/N值最大且陽(yáng)性血清OD450nm≥1.0、陰性血清OD450nm≤0.2。

2.2.3 血清最佳作用方式的確定 血清于37 ℃作用30 min時(shí),P/N值最大且陽(yáng)性血清OD450nm≥1.0且陰性血清OD450nm≤0.2(表2)。

表2 血清最佳作用方式

2.2.4 最佳酶標(biāo)二抗工作濃度的確定 酶標(biāo)二抗選擇1∶2000時(shí),P/N值最大且陽(yáng)性血清OD450nm≥1.0、陰性血清OD450nm≤0.2。

2.2.5 酶標(biāo)二抗最佳作用方式的確定 酶標(biāo)二抗于37 ℃作用30 min時(shí),P/N值最大且陽(yáng)性血清OD450nm≥1.0且陰性血清OD450nm≤0.2(表3)。

表3 酶標(biāo)二抗最佳作用方式

2.2.6 底物作用時(shí)間的確定 表4結(jié)果顯示,底物作用時(shí)間為室溫20 min時(shí),P/N值最大。

表4 底物最佳作用時(shí)間

表5 53份BVDV抗體陰性牛血清OD450nm值

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果 特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示,僅BVDV抗體陽(yáng)性牛血清檢測(cè)OD450nm>0.255,其他均為陰性,說(shuō)明建立的間接ELISA具有良好的特異性,與常見(jiàn)其它的牛血清無(wú)交叉反應(yīng)。

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 將BVDV陽(yáng)性血清連續(xù)倍比稀釋后,用建立的ELISA方法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,陽(yáng)性血清稀釋1600倍時(shí),OD450nm>0.255仍為陽(yáng)性,表明建立的ELISA方法具有較高的敏感性。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 表6和表7結(jié)果顯示,批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均小于10%,表明建立的ELISA方法重復(fù)性良好。

表6 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

表7 批間重復(fù)性試驗(yàn)

2.7 臨床樣本檢測(cè) 對(duì)160份牛血清樣本,用商品化的BVDV總抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行抗體檢驗(yàn),結(jié)果顯示陽(yáng)性92份,陰性68份。對(duì)92份陽(yáng)性樣本,用建立的間接ELISA方法檢測(cè)到陽(yáng)性血清85份,其中的82份用血清中和試驗(yàn)檢測(cè)同為陽(yáng)性;有7份樣本兩種方法檢測(cè)均為陰性。對(duì)陰性血清68份,間接LEISA方法和血清中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果均為陰性。間接ELISA方法與血清中和試驗(yàn)、商品化試劑盒的總體符合率分別為98%和96%。詳見(jiàn)表8。

表8 對(duì)160份血清樣本BVDV抗體檢測(cè)

3 討論與結(jié)論

BVDV呈世界性流行,我國(guó)流行情況更加復(fù)雜,給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。BDV目前尚無(wú)特效藥物,國(guó)內(nèi)外主要采取疫苗免疫、病原和抗體檢測(cè)、清除持續(xù)性感染牛、BVDV凈化等綜合防控措施,因此BVDV抗體監(jiān)測(cè)和疫苗效果評(píng)價(jià)尤為重要。BVDV抗體檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法是血清中和試驗(yàn),但其操作復(fù)雜,試驗(yàn)周期較長(zhǎng),敏感性不高,不利于高通量樣本檢測(cè)和基層推廣使用。而血清抗體間接ELISA方法具有檢測(cè)速度快、對(duì)試驗(yàn)環(huán)境和人員的要求低,且其敏感性高于血清中和試驗(yàn),結(jié)果判定簡(jiǎn)單,在臨床樣本檢測(cè)和疫苗免疫抗體監(jiān)測(cè)等方面能發(fā)揮更大的作用。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)BVDV E2蛋白建立的檢測(cè)血清抗體的間接ELISA方法,可準(zhǔn)確檢測(cè)血清中的BVDV抗體,特異性強(qiáng)敏感性高,對(duì)于大批量臨床樣本的抗體檢測(cè)、基層樣本篩查及BVDV凈化等方面具有重要價(jià)值。

目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)BVDV抗體使用的ELISA試劑盒大多為國(guó)外進(jìn)口,存在價(jià)格昂貴,進(jìn)口周期長(zhǎng)等劣勢(shì)。美國(guó)IDEXX公司商品化的BVDV總抗體試劑盒,其包被抗原為全病毒抗原,需要繁殖大量病毒并進(jìn)行密度梯度離心,存在制備工藝復(fù)雜、成本高和散毒風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn)。本研究借助基因表達(dá)和蛋白純化技術(shù)制備BVDV E2蛋白,E2蛋白是BVDV結(jié)構(gòu)蛋白中免疫原性最強(qiáng)的糖蛋白,在結(jié)構(gòu)基因中具有良好的中和抗體能力。將純化后的E2蛋白作為包被抗原,克服了全病毒包被的不足之處,建立的間接ELISA方法與商品化試劑盒的符合率高達(dá)96%。

包被抗原的反應(yīng)原性和純度是影響間接ELISA方法敏感性和特異性的關(guān)鍵。目前已報(bào)道的BVDV Erns蛋白表達(dá)產(chǎn)物大多以包涵體形式表達(dá),存在目的蛋白損失嚴(yán)重、純度不高等缺點(diǎn),本研究通過(guò)線性抗原表位預(yù)測(cè)分析并進(jìn)行密碼子優(yōu)化,利用大腸桿菌原核表達(dá)E2蛋白,E2蛋白主要以可溶性形式在大腸桿菌中高效表達(dá),這一蛋白表達(dá)特性獲得了高純化和濃度的包被抗原。本研究建立的間接ELISA方法與血清中和試驗(yàn)的符合率較高,更適于高通量檢測(cè),用于BVDV疫苗免疫效果評(píng)價(jià)和BVDV凈化等,具有較好的應(yīng)用前景。