房思遠(yuǎn),趙子玉,榮 軒,朱永明,張世佳,李育明,4,趙兵令

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院,河北保定 071000;2. 河北維爾利動(dòng)物藥業(yè)集團(tuán)有限公司,石家莊 050200;3. 河北省中獸藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,石家莊 050200;4. 河北維爾利生物科技有限公司,石家莊 050200)

輸卵管炎在雞(Gallusgallus)中發(fā)生普遍,表現(xiàn)為產(chǎn)蛋高峰消失,產(chǎn)蛋量減少,蛋品質(zhì)下降,導(dǎo)致?lián)錃⒓爸委煶杀驹黾?阻礙了雞規(guī)?；B(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展[1］。輸卵管炎的誘因?yàn)殡u舍環(huán)境條件差,為大腸桿菌和沙門氏菌等細(xì)菌的滋生創(chuàng)造了有利條件,細(xì)菌通過(guò)泄殖腔到達(dá)輸卵管,引起輸卵管機(jī)能障礙, 卵泡發(fā)育不良, 蛋白分泌功能受損, 對(duì)雞的繁殖性能造成極大影響[2］。雞蛋是人類優(yōu)質(zhì)蛋白獲取的重要途徑,因此蛋雞輸卵管炎的治療尤為重要?？股氐臑E用不僅會(huì)產(chǎn)生獸藥殘留等一系列問(wèn)題,更重要的是對(duì)人類安全及生態(tài)環(huán)境等都會(huì)造成極大的威脅,而中獸藥以其安全性好、毒副作用小、殘留量少等優(yōu)勢(shì)被視為替抗的重要手段之一。

苦虎益母口服液是本實(shí)驗(yàn)室篩選出的治療蛋雞輸卵管炎的中藥組方,由苦參、虎杖、益母草、黃芪、菟絲子幾味藥組成?？鄥榫?具有燥濕、抑菌、利尿等功效[3］,能夠清除輸卵管道的炎癥,減少炎性滲出物;虎杖為臣藥,具有止痛、散瘀、解毒等功效[4］,能夠清除生殖道內(nèi)的淤堵,減輕生殖疼痛;黃芪和菟絲子為佐藥具有益氣健脾[5］,滋補(bǔ)肝腎[6］的功效,二者合用在促進(jìn)炎癥恢復(fù)的同時(shí)促進(jìn)卵泡發(fā)育;益母草為使藥,具有活血、化瘀、利尿和通路的功效[7］,能夠清除生殖道的炎性水腫,減輕產(chǎn)后瘀痛。五種藥材合用具有清熱解毒、化瘀通絡(luò)、健肝益氣、滋補(bǔ)肝腎之功效,用于治療雞輸卵管炎能夠改善卵泡發(fā)育不良,提高產(chǎn)蛋率,減輕炎性滲出等。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)涵蓋了包括系統(tǒng)生物學(xué)等多門學(xué)科,能夠揭示藥物、成分、靶點(diǎn)和疾病之間的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系,能夠分析并預(yù)測(cè)中獸藥復(fù)方的作用機(jī)制,這與中醫(yī)的整體觀念相一致。因而采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究苦虎益母口服液治療雞輸卵管炎的作用機(jī)制并采用分子對(duì)接進(jìn)一步驗(yàn)證,為苦虎益母口服液的下一步研究提供參考依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)與方法

1.1 苦虎益母口服液有效成分及目標(biāo)靶蛋白的篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP,http: ∥tcmspw.com/tcmsp.php),對(duì)苦虎益母口服液(苦參、虎杖、益母草、黃芪、菟絲子)進(jìn)行有效成分的篩選,條件為口服生物利用度(OB≥30%) 和類藥性(DL≥0.18),物種為“Gallusgallus”,獲取相應(yīng)的蛋白質(zhì)靶標(biāo),并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https: ∥www.uniprot.org/)對(duì)其名稱進(jìn)行規(guī)范化處理。

1.2 苦虎益母口服液-有效活性成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖構(gòu)建 利用Cytoscape 3.8.2軟件,繪制1.1得到的苦虎益母口服液藥物-有效活性成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 雞輸卵管炎靶點(diǎn)的篩選 以“Gallusgallussalpingitis”、“Chickensalpingitis”、“salpingitis”、為關(guān)鍵詞,在基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards,https: ∥www.genecards.org/)、在線孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM,https: ∥omim.org)、毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(CTD,http:∥ctdbase.org/)進(jìn)行檢索,整合并標(biāo)準(zhǔn)化得到的數(shù)據(jù),刪除重復(fù)項(xiàng)。

1.4 苦虎益母口服液與雞輸卵管炎交集靶點(diǎn)的獲取 利用微生信平臺(tái)(http:∥www.bioinformatics.com.cn/),得到1.1獲得的藥物成分靶點(diǎn)與1.3項(xiàng)獲得的疾病成分靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn),生成Veen圖。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將從1.4項(xiàng)獲得的苦虎益母口服液成分與雞輸卵管炎交集靶點(diǎn)利用基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)信息的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)(STRING,https: ∥www.string-db.org/)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建,設(shè)定物種為“Gallusgallus”,置信度>0.4,并隱藏游離節(jié)點(diǎn),其他指標(biāo)均為默認(rèn)值,下載其“tsv”文件。將下載好的“tsv”文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件,構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)圖,并利用軟件自身工具Network Analyzer計(jì)算Degree值,篩選核心靶點(diǎn)。

1.6 GO和KEGG通路富集分析 將1.4項(xiàng)獲得的交集靶點(diǎn)利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https: ∥david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析,物種選擇 “Gallusgallus”,篩選偽發(fā)現(xiàn)率<0.05的條目,繪制其條形圖和氣泡圖。

1.7 分子對(duì)接 為驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果,通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https: ∥phbchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找關(guān)鍵藥物活性成分,并下載其3D結(jié)構(gòu),保存為“SDF”,作為配體文件,并利用Open Babel(https:∥openbabel.org)轉(zhuǎn)換為moL 2格式。從UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)關(guān)鍵靶點(diǎn)的Entry值,下載關(guān)鍵靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu),保存為“PDB”格式作為受體文件。將處理好的文件分別導(dǎo)入到AutoDock Tools中進(jìn)行去除水分子、加氫等處理后再利用AutoDock Tools進(jìn)行分子對(duì)接。利用PyMol2.6進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦虎益母口服液-有效活性成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖構(gòu)建 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,得到苦參有效成分25個(gè),靶點(diǎn)163個(gè);虎杖有效成分10個(gè),靶點(diǎn)86個(gè);黃芪有效成分21個(gè),靶點(diǎn)142個(gè);菟絲子有效成分10個(gè),靶點(diǎn)86個(gè);益母草有效成分8個(gè),靶點(diǎn)70個(gè)。合并去重后得到靶點(diǎn)共計(jì)77個(gè)。將有效成分經(jīng)Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)和規(guī)范化的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2,實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化,如圖1。并根據(jù)其Dgree篩選出排名前10的有效活性成分(表1)。并根據(jù)圖1靶點(diǎn)的連接Dgree值,獲取前10的有效成分作用靶點(diǎn)信息(表2)。

藍(lán)綠色代表有效成分靶點(diǎn);紅色代表藥物交集靶點(diǎn);淺藍(lán)色代表各個(gè)藥物;綠色代表苦參有效成分;金黃色代表虎杖有效成分;淺紫色代表黃芪有效成分;深紫色代表菟絲子有效成分;藍(lán)紫色代表益母草有效成分Blue-green represents the active ingredient target; Red represents drug intersection targets; Light blue represents individual drugs; Green represents the active ingredient of Sophora; The golden yellow color represents the active ingredient of knotweed; Light purple represents the active ingredient of astragalus; The dark purple color represents the active ingredient of dodder seed; Blue-purple represents the active ingredient of motherwort

2.2 苦虎益母口服液與雞輸卵管炎交集靶點(diǎn)Veen圖 通過(guò)篩選,去重,將得到的苦虎益母口服液基因靶點(diǎn)77個(gè),疾病基因靶點(diǎn)1102個(gè)輸入微生信平臺(tái),得到Veen圖(圖2),可看到交集靶點(diǎn)共有35個(gè)。包括雌激素受體1 (ESR1)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子(CCND1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)等。

圖2 苦虎益母口服液與雞輸卵管炎韋恩圖

2.3 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將獲得的交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),隱藏游離節(jié)點(diǎn)后下載其TSV文件并導(dǎo)入到Cytoscape 3.8.2軟件中進(jìn)行可視化,該圖包括35個(gè)節(jié)點(diǎn),130條邊,如圖3。排名前3的是ESR1、CCND1、VEGFA,分別與20、15、14個(gè)蛋白相互作用。Degree值越大,節(jié)點(diǎn)越大,顏色也越深,靶點(diǎn)越重要。

圖3 苦虎益母口服液與雞輸卵管炎蛋白互作圖

2.4 GO功能富集分析與KEGG通路分析 從DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得GO功能富集分析85個(gè)條目,篩選符合偽發(fā)現(xiàn)率<0.05的條件后得到相關(guān)條目8個(gè),繪制條形圖(圖4)。包括生物過(guò)程(biological process, BP)5個(gè),細(xì)胞組分(cellular component, CC)1個(gè),分子功能(molecular function, MF)2個(gè)。生物過(guò)程涉及到白細(xì)胞介素-18、巨噬細(xì)胞活化、免疫反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)異生刺激的反應(yīng)、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正調(diào);細(xì)胞組分涉及到細(xì)胞外間隙;分子功能涉及到干擾素-γ受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性。

圖4 苦虎益母口服液GO功能富集分析圖

KEGG富集分析共得到通路18條,篩選符合偽發(fā)現(xiàn)率<0.05的條件后得到通路10條,繪制氣泡圖(圖5),涉及到細(xì)胞衰老、細(xì)胞周期、Toll樣受體信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、沙門氏菌感染、焦點(diǎn)粘連、FoxO信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、甲型流感、單純皰疹病毒1感染等通路。氣泡越大,富集到此條目的基因數(shù)越多,顏色越紅,該條目的偽發(fā)現(xiàn)率越低。

圖5 苦虎益母口服液KEGG通路富集分析氣泡圖

2.5 分子對(duì)接 使用Autodock軟件將具有最高Degree值的3種活性成分包括槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin),與PPI網(wǎng)絡(luò)中的3種核心靶點(diǎn),包括雌激素受體1 (ESR1)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子(CCND1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)對(duì)接。結(jié)果如表3,其中結(jié)合自由能最低的是CCND1-木犀草素(-6.34 kJ/mol),表明木犀草素可能通過(guò)CCND1作用進(jìn)而治療雞輸卵管炎。配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定,兩者結(jié)合能越低。將結(jié)合能排名前3的分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化(圖6)。

表3 苦虎益母口服液有效成分分子對(duì)接結(jié)果(前3)

A,CCND1與木犀草素對(duì)接圖;B,CCND1與山奈酚對(duì)接圖;C,VEGFA與山奈酚對(duì)接圖A, CCND1 and luteolin docking diagram; B,CCND1 and kaempferol docking diagram; C,VEGFA and kaempferol docking diagram

3 討 論

苦虎益母口服液包括苦參、虎杖、黃芪、菟絲子、益母草五味中藥。其主要活性成分包括槲皮素、山柰酚、木犀草素、芒柄花素、異鼠李素、β-谷甾醇、7-O-甲基異木糖醇、苦參堿、虎杖苷等。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)其中Degree值排名最高的3種活性成分是槲皮素、山柰酚、木犀草素,均屬于屬于黃酮類化合物。黃酮類化合物是一類結(jié)構(gòu)相對(duì)均一的化合物,具有保護(hù)生殖組織、抗炎、抗菌、抗氧化應(yīng)激等作用[8］。槲皮素是五味藥材共有的成分,Degree值最大。槲皮素具有雌激素樣作用,能夠增加激素分泌,上調(diào)或下調(diào)凋亡基因的表達(dá),從而促進(jìn)生殖器官發(fā)育和抑制卵泡凋亡來(lái)提高生產(chǎn)性能[9］。此外槲皮素的抗氧化活性主要表現(xiàn)為環(huán)境和毒理因素對(duì)谷胱甘肽(GSH)、酶活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和活性氧(ROS)的影響[10］。山柰酚可降低不同類型癌癥的發(fā)病率[11］,主要是通過(guò)增加細(xì)胞凋亡來(lái)抑制癌細(xì)胞的增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)[12］。山奈酚能抑制細(xì)胞活力,在雞胚胎的脈絡(luò)膜尿囊膜中,山奈酚顯著抑制OVCAR-70誘導(dǎo)的血管生成和腫瘤生長(zhǎng)[13］。木犀草素的抗炎活性包括抑制促炎介質(zhì)(如COX-2、NO、IL-6、TNF-α)和調(diào)節(jié)幾種信號(hào)通路(NF-KB、AP-1和JAK-STAT),這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過(guò)串?dāng)_相互連接,木犀草素可以調(diào)節(jié)和抑制這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,且木犀草素還具有強(qiáng)大的抗氧化能力,能清除自由基和保護(hù)細(xì)胞[14-15］?？嗷⒁婺缚诜嚎赡芡ㄟ^(guò)多種有效活性成分調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)、抗氧化和保護(hù)細(xì)胞等,達(dá)到治療雞輸卵管炎的目的。

PPI分析結(jié)果顯示,苦虎益母口服液治療雞輸卵管炎的靶點(diǎn)主要涉及ESR1、CCND1、VEGFA。雌激素受體(ER)是核受體超家族的成員,主要核受體為ESR1和ESR2[16］。配體結(jié)合后,ESR1復(fù)合物充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子并與雌激素靶基因(例如PGR)的啟動(dòng)子結(jié)合以誘導(dǎo)其表達(dá)[17］。ESR1在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)占主導(dǎo)地位,雌激素依賴性增殖主要通過(guò)ESR1介導(dǎo)[18］。ESR1在雞胚成纖維細(xì)胞(DF-1)細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)上調(diào)了CYP19A1的蛋白表達(dá),而形成協(xié)調(diào)CYP19A1表達(dá)的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有助于CYP19A1在雞卵巢卵泡膜細(xì)胞中的中表達(dá)[19］。此外,ESR1的缺失還會(huì)影響傳出小管和附睪功能,阻礙離子運(yùn)輸和水重吸收,導(dǎo)致精子異常[20］。CCND1是一種原癌基因,可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1-S期的進(jìn)展,細(xì)胞周期分析和增殖分析表明,CCND1的近端聚腺苷酸化位點(diǎn)加速了細(xì)胞周期并促進(jìn)了細(xì)胞增殖[21］。CCND1誘導(dǎo)母體視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤1(RB1)蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化,導(dǎo)致該蛋白的降解。這可能有助于胚層發(fā)育過(guò)程中母體到合子的過(guò)渡后細(xì)胞周期進(jìn)程[22］。且CCND1主要在成年雄雞睪丸的生精小管內(nèi)的Sertoli細(xì)胞核中表達(dá),在Sertoli細(xì)胞的分化和睪丸發(fā)育過(guò)程中生精小管的形成中起重要作用。VEGFA是一個(gè)蛋白質(zhì)家族的成員,在卵巢組織中研究廣泛[23］。VEGFA亞型的生物學(xué)效應(yīng)由兩種酪氨酸激酶受體介導(dǎo),即VEGFR1 (FLT1)和VEGFR2 (FLK1或KDR)[24］。VEGFA是血管生成最重要的調(diào)節(jié)因子之一,在血管生成和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[25］。研究表明卵巢功能依賴于正常的鞘血管系統(tǒng)的建立,而VEGFA是鞘膜血管生成的主要調(diào)節(jié)因子,鞘血管損傷很可能是卵巢功能障礙的原因之一[26］。

GO富集分析表明,苦虎益母口服液主要通過(guò)白細(xì)胞介素-18、巨噬細(xì)胞活化、免疫反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)異生刺激的反應(yīng)、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正調(diào)等生物過(guò)程對(duì)雞輸卵管炎發(fā)揮作用。KEGG富集通路分析表明,調(diào)節(jié)雞輸卵管炎的主要通路是細(xì)胞衰老、細(xì)胞周期、Toll樣受體信號(hào)通路。細(xì)胞衰老是一種應(yīng)激反應(yīng),可引發(fā)永久性細(xì)胞周期停滯并引發(fā)深刻的表型變化,如產(chǎn)生生物活性分泌組,稱為衰老相關(guān)分泌表型(SASP)[27］。SASP持續(xù)誘導(dǎo)衰老,甚至在免疫系統(tǒng)受損時(shí)適度的衰老水平,可能導(dǎo)致衰老細(xì)胞的大量積累,從而引發(fā)慢性炎癥狀態(tài),對(duì)鄰近細(xì)胞和整個(gè)生物體產(chǎn)生有害影響。SASP能夠激活免疫監(jiān)視并招募適應(yīng)性和先天免疫細(xì)胞來(lái)消除衰老細(xì)胞[28］。在衰老過(guò)程中,衰老細(xì)胞的積累超過(guò)了這些細(xì)胞的清除能力,并通過(guò)SASP相關(guān)分子的分泌,導(dǎo)致組織的慢性衰退[29］。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)由蛋白質(zhì)、酶、細(xì)胞因子和細(xì)胞周期信號(hào)通路之間的復(fù)雜相互作用網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào),對(duì)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和修復(fù)至關(guān)重要[30］。Toll樣受體(TLR)是定義明確的模式識(shí)別受體,負(fù)責(zé)病原體識(shí)別和誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng),感知病原體相關(guān)的分子模式(例如脂多糖)并觸發(fā)基因表達(dá)變化,保護(hù)宿主免受細(xì)菌、病毒及其他微生物的侵害[31-32］。細(xì)菌脂多糖(LPS)是 toll樣受體4 (TLR4)的配體,誘導(dǎo)粘蛋白mRNA增強(qiáng)母雞陰道粘膜屏障,在蛋雞陰道中,LPS上調(diào)了粘蛋白的表達(dá),這種粘蛋白表達(dá)系統(tǒng)可能在陰道黏膜抗感染的粘膜屏障中起作用[33］。

分子對(duì)接結(jié)果表明,苦虎益母口服液主要有效活性成分槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)與關(guān)鍵靶點(diǎn)雌激素受體1 (ESR1)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子(CCND1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)結(jié)合能均為負(fù)值,且構(gòu)象穩(wěn)定,結(jié)合活性良好?？嗷⒁婺缚诜旱挠行С煞挚赡芡ㄟ^(guò)上述的關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮治療雞輸卵管炎的作用。

綜上所述,苦虎益母口服液的活性成分,即槲皮素、木犀草素、山奈酚等,可能作用于ESR1、CCND1、VEGFA等多個(gè)靶點(diǎn),調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老、細(xì)胞周期、Toll樣受體信號(hào)等多種信號(hào)通路,抑制炎癥反應(yīng)、抗炎、抗氧化應(yīng)激,保護(hù)生殖組織,從而實(shí)現(xiàn)雞輸卵管炎的治療。研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù),預(yù)測(cè)苦虎益母口服液治療雞輸卵管炎的作用機(jī)制,符合中藥的組方原則,契合其“多組分、多靶點(diǎn)、多通路”的特點(diǎn)。上述研究也為其進(jìn)一步的研究提供數(shù)據(jù)支撐和參考依據(jù)。