蔣浩波，段嘉豪，劉恩旭，陳 茜，李 夏，邵 樂，楊少鋒*，張 曉*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007；3.廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 東莞523808

近幾十年來，腰痛已成為影響人們生活質(zhì)量最為重要的筋骨疾患之一[1]。 相關(guān)研究表明，高達(dá)84%的人在其一生中都可能會(huì)受到腰痛的困擾[2]。 其中，腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation, LDH）是導(dǎo)致腰痛最為常見的原因之一[3]，它的發(fā)生與腰椎退行性改變密切相關(guān)。 LDH 指椎間盤發(fā)生退行性改變后，由于纖維環(huán)部分或全部破裂，單獨(dú)或連同髓核、軟骨終板向外突出，刺激或壓迫脊髓、神經(jīng)和血管等組織，引起以腰腿痛為主要癥狀的病變。 椎間盤主要由上下終板軟骨（endplate cartilage, EPC）、纖維環(huán)（annulus fibrosus, AF）、纖維環(huán)包裹的髓核（nucleus pulposus, NP）組成。 由于椎間盤內(nèi)無血管分布，其營(yíng)養(yǎng)主要依靠終板軟骨的擴(kuò)散。 隨著人年齡的增長(zhǎng)，終板軟骨細(xì)胞發(fā)生退變，終板軟骨的營(yíng)養(yǎng)供給功能障礙，導(dǎo)致椎間盤衰老變性，進(jìn)而引起LDH[4-5]。

LDH 歸屬于中醫(yī)學(xué)“痹病”范疇，相關(guān)研究表明中醫(yī)在LDH 的保守治療中療效顯著[6]。腰為腎之府，腎主骨，生髓，為先天根本；肝為藏血之臟，在體合筋；當(dāng)肝腎虧虛時(shí)，則精血生發(fā)較少，無法滋骨絡(luò)髓，無法榮筋，而發(fā)腰痹，所以肝腎虧虛為L(zhǎng)DH 的主要內(nèi)因。 因此，以獨(dú)活寄生湯為代表的經(jīng)典方劑，在治療LDH 方面得到了廣泛應(yīng)用[7-8]。加味獨(dú)活寄生合劑是在獨(dú)活寄生湯的基礎(chǔ)上，經(jīng)臨床辨證論治、三因制宜對(duì)藥味、藥量進(jìn)行加減的院內(nèi)制劑，其對(duì)于痹?。L(fēng)寒濕痹、肝腎不足）有著良好的臨床療效，在保守治療的情況下，加味獨(dú)活寄生合劑治療LDH 有效率達(dá)到80%[9]。

因中藥復(fù)方成分的復(fù)雜性和靶點(diǎn)的不確定性，常規(guī)藥理研究方法難以全面闡明加味獨(dú)活寄生合劑治療LDH 的分子作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為藥理學(xué)新興分支學(xué)科，在揭示化學(xué)成分復(fù)雜的中藥復(fù)方的藥理學(xué)規(guī)律上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其整體性、系統(tǒng)性與中醫(yī)藥的整體觀、辨證論等基本理論趨于一致[10-11]。 因此，本研究設(shè)計(jì)通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)獲取加味獨(dú)活寄生合劑干預(yù)LDH 交集靶標(biāo)，得到交集靶標(biāo)以及富集通路，并預(yù)測(cè)相關(guān)機(jī)制；最后通過大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，為深入探討加味獨(dú)活寄生合劑干預(yù)LDH 的機(jī)制提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康1 月齡SPF 級(jí)SD 大鼠20 只，雄性，質(zhì)量（200±20） g；由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心代購(gòu)。質(zhì)量合格證編號(hào)為：ZS-202209200008。 對(duì)于動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)過湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審核，倫理號(hào)為：LLBH-202209050004。大鼠4 只用于原代終板軟骨細(xì)胞的提??；8 只用于加味獨(dú)活寄生合劑含藥血清的提取，8 只用于無藥血清的提取。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

加味獨(dú)活寄生合劑，批號(hào)：2022111，湘藥制備字：Z20190063，規(guī)格：每瓶250 mL。 主要成分：獨(dú)活、桑寄生、天南星、黃芩、木瓜、威靈仙、杜仲、牛膝、細(xì)辛、秦艽、茯苓、肉桂、防風(fēng)、川芎、人參、甘草、當(dāng)歸、白芍、熟地黃。 生藥濃度為0.664 g/mL。

1.3 主要試劑及儀器

CCK-8 細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：PN659）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；PBS 緩沖液（批號(hào)：PB180327）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；IL-6 ELISA 試劑盒（批號(hào)：Y17039786）購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；重組人IL-17（批號(hào)：Q16552）購(gòu)自美國(guó)PeproTech 公司；DAPI（批號(hào)：C1005）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Collagen Ⅱ抗體（種屬：兔）（批號(hào)：ab34712）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；Trizol試劑（批號(hào)：5301100）購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：E047-01B）購(gòu)自中國(guó)北京康為世紀(jì)；p-p65 抗體（批號(hào)：3033S）、MMP9 抗體（批號(hào)：2270S）；GAPDH 抗體（批號(hào)：2118S）以上抗體均購(gòu)自美國(guó)CST 公司。

A00-1-1102 型流式儀（Beckman 公司）；PW-812 型全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）；MB-530 型多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）；PIKOREAL96 型熒光定量RCP 儀（美國(guó)Thermo 公司）；DYY-2C 型電泳儀、DYCP-31DN 型水平瓊脂糖電泳槽（中國(guó)北京六一公司）；GL-88B 型旋渦混合器（中國(guó)江蘇其林貝爾公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 獲取交集靶標(biāo) 應(yīng)用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）及BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http:/bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）檢索加味獨(dú)活寄生合劑所有組成藥物的活性成分。 篩選出類藥性（drug-likeness, DL）≥0.18、口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%的化合物作為研究對(duì)象， 然后基于該數(shù)據(jù)庫(kù)，將納入的活性成分逐一配對(duì)潛在作用靶點(diǎn)。 再通過UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白和基因信息注釋，限定物種為“Homo sapiens”，得到加味獨(dú)活寄生合劑主要活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。 通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、OMIM 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://omim.org/）搜集LDH 相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，并將化合物作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，獲取加味獨(dú)活寄生合劑干預(yù)LDH的交集靶標(biāo)。

2.1.2 構(gòu)建“藥物-化合物-疾病靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)模型 將交集靶標(biāo)入Cytoscape 3.7.0 軟件中構(gòu)建“藥物－化合物－疾病靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖以備后續(xù)分析。 其中節(jié)點(diǎn)的類型代表藥物成分、疾病和交集靶標(biāo)，利用CentiScape插件計(jì)算有效成分的度值，度值越高提示發(fā)揮主要功能的概率越大。

2.1.3 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)獲取核心靶蛋白 將獲得的交集靶標(biāo)輸入STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，將Settings 設(shè)為“high confidence：0.7”，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)。 并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 繪制蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，根?jù)度值大于中位數(shù)篩選出核心靶蛋白。

2.1.4 GO 分析及KEGG 通路富集分析獲取關(guān)鍵通路 用R 語(yǔ)言（https://www.r-project.org/）軟件中clusterProfiler GO.R 插件及Perl 語(yǔ)言對(duì)活性成分與LDH 的交集靶標(biāo)進(jìn)行GO 分析。 并應(yīng)用clusterProfilerKEGG.R 插件進(jìn)行KEGG Pathway 通路富集分析。根據(jù)富集因子值分析核心通路富集程度，探究加味獨(dú)活寄生合劑治療LDH 的可能的生物功能及信號(hào)通路機(jī)制。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 終板軟骨細(xì)胞的提取、培養(yǎng)和鑒定 取健康1 月齡SD 大鼠4 只，使用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，脊柱脫臼法處死，使用75%乙醇浸泡5 min，移至超凈工作臺(tái)。 俯臥固定大鼠，剪開被毛，暴露完整椎體，取出椎間盤終板軟骨組織。將組織用無菌PBS 清洗3 次， 剪碎至1 mm3大小，加入5 mL 0.2%Ⅱ型膠原酶消化液，37 ℃恒溫?fù)u床，震蕩消化2～3 h。吹打組織30 次，經(jīng)過200 目細(xì)胞篩過濾，濾液1 000 r/min 離心5 min，離心半徑9 cm。去除上清液后，用含10%胎牛血清以及1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的DMEM 培養(yǎng)液將收集的終板軟骨細(xì)胞重懸，并接種在25T 的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放置在恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中培育。24 h 后觀察細(xì)胞貼壁情況，若貼壁情況良好，則3 d 后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行第一次換液，之后每隔2～3 d 換一次液。 當(dāng)?shù)谌?xì)胞增長(zhǎng)至80%后取出細(xì)胞，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察以及CollagenⅡ免疫熒光染色進(jìn)行鑒定，鑒定成功后，取出第三代終板軟骨細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 加味獨(dú)活寄生合劑藥液的制備 采取蒸餾法，濃縮藥液至2 g/mL。

2.2.3 含藥血清的制備 1 月齡SD 大鼠16 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，按隨機(jī)數(shù)表法分為加味獨(dú)活寄生合劑組和生理鹽水組。 按照藥理試驗(yàn)中動(dòng)物與人體間的等效劑量換算[12]。 加味獨(dú)活寄生合劑參考人體劑量（1.186 g·kg-1·d-1），并按人（70 kg）和大鼠（200 g）體表面積折算等效劑量，大鼠等效劑量約為7.35 g·kg-1·d-1。 據(jù)相關(guān)研究表明，當(dāng)大鼠灌胃劑量達(dá)到臨床等效劑量5 倍時(shí)取得的大鼠含藥血清質(zhì)量最高[13]，因此，大鼠需要藥物劑量為36.75 g·kg-1·d-1。 濃縮后的藥液需要灌18.375 mL·kg-1·d-1，生理鹽水組灌等量的生理鹽水，分早晚兩次灌胃。 灌胃第7天給藥1 h 后，使用3%的戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈采血，常溫靜置3 h；以3 000 r/min、離心半徑9 cm、4 ℃條件下離心15 min，按組收集血清。 將各組血清組內(nèi)混合，減少個(gè)體差異。 于56 ℃的恒溫水浴鍋中放置30 min 滅活，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，保存在1.5 mL 離心管內(nèi)，做好標(biāo)記，放置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 造模方法 使用添加含有10 ng/mL 的IL-17 的DMEM 培養(yǎng)液對(duì)第3 代終板軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過24 h 誘導(dǎo)后形成終板軟骨細(xì)胞退變模型[14]。通過倒置顯微鏡、甲苯胺藍(lán)染色以及CollagenⅡ免疫熒光染色鑒定細(xì)胞并觀察細(xì)胞退變情況。

2.2.5 含藥血清毒性檢測(cè) 終板軟骨細(xì)胞以5×103個(gè)/cm3的密度接種到96 孔板中，分別加入200 μL含有0%、5%、10%、20%、40%、60%、80%、100%含藥血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基干預(yù)24 h。干預(yù)后，將含10%CCK-8 的100 μL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入孔板，37 ℃孵育2 h。 使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)在450 nm 處測(cè)量每個(gè)孔的吸光度值（optical density, OD）值。 檢測(cè)細(xì)胞活性，分析含藥血清毒性。 CCK-8 實(shí)驗(yàn)計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力（%）=[（實(shí)驗(yàn)孔-空白孔）/（對(duì)照孔-空白孔）]×100%。

2.2.6 分組及干預(yù) 取P3 代終板軟骨細(xì)胞，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成5 組：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、加味獨(dú)活寄生合劑低劑量組（簡(jiǎn)稱低劑量組）、加味獨(dú)活寄生合劑低劑量組中劑量組（簡(jiǎn)稱中劑量組）、加味獨(dú)活寄生合劑高劑量組（簡(jiǎn)稱高劑量組）。 除空白對(duì)照組外，其他4 組均采用IL-17 干預(yù)大鼠的椎間盤終板軟骨細(xì)胞。 IL-17 干預(yù)細(xì)胞后使用不同濃度含藥及空白血清干預(yù)各組細(xì)胞。

各組具體干預(yù)方式為：空白對(duì)照組：20%空白血清+DMEM；模型對(duì)照組：20%空白血清+DMEM+10 ng/mL IL-17；低劑量組：5%含藥血清+15%空白血清+DMEM+10 ng/mL IL-17；中劑量組：10%含藥血清+10%空白血清+DMEM +10 ng/mL IL-17；高劑量組：20%含藥血清+DMEM+10 ng/mL IL-17。

2.2.7 各組終板軟骨細(xì)胞的細(xì)胞活性檢測(cè) 為了測(cè)定各組細(xì)胞增殖活性情況，將終板軟骨細(xì)胞以5×103個(gè)/cm3的密度接種到96 孔板中。 完成上訴干預(yù)后，將含10% CCK-8 的100 μL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入孔板，37 ℃孵育2 h。 使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)在450 nm處測(cè)量每個(gè)孔的OD 值，計(jì)算細(xì)胞活力。

2.2.8 各組終板軟骨細(xì)胞的細(xì)胞周期情況檢測(cè) 胰酶消化收集各組細(xì)胞，PBS 沖洗3 遍，1 000 r/min，離心半徑9 cm，3 min 收集細(xì)胞沉淀。 加入1 mL 70%的預(yù)冷的乙醇固定細(xì)胞24 h；重懸離心2 遍去除乙醇后，加入200 μL 碘化丙啶（PI）工作液，4 ℃避光染色30 min。 轉(zhuǎn)至流式檢測(cè)管，上機(jī)檢測(cè)，PI 用488 nm 氬離子激光器激發(fā)，由630 nm 通濾光片接收，通過FSC/SSC 散點(diǎn)圖收集10 000 個(gè)細(xì)胞，采用設(shè)門技術(shù)，排除粘連細(xì)胞和碎片，分析PI 熒光直方圖上各細(xì)胞周期的百分率。

2.2.9 ELISA 檢測(cè)各組細(xì)胞IL-6 的表達(dá) 收集各組干預(yù)完成后的細(xì)胞上清液，分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣本孔，操作步驟按照試劑盒說明進(jìn)行。 用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度OD 值。 以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，OD 值為橫坐標(biāo)，使用Curve Expert 軟件進(jìn)行分析，計(jì)算出樣本濃度。

2.2.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞p-p65、MMP9 的基因表達(dá) 應(yīng)用Trizol 試劑提取各組細(xì)胞總RNA。按照試劑操作盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，作為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增條件如下：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，30 s，40 個(gè)循環(huán)，熔解曲線分析：60 ℃- 95 ℃。 根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算目標(biāo)mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，上下游引物由北京擎科生物科技有限公司合成；引物序列：p-p65：正向5'-CCGATGCATCCACAGTTCCC-3'， 反 向5'-TGGGGGCACGGTTAT CAAAA-3'，長(zhǎng)度：156 bp。 MMP9：正向5'-AGGGCCCCTTTCTTATTGCC-3'，反向5'-CACATTTTGCGCCCAGAGAA-3'，長(zhǎng)度：112 bp。 GAPDH：正向5'-TCACTATGAGGTCTACTCGG-3'，反向5'-CATATTGCCAGTTCTTCGTA-3'，長(zhǎng)度：141 bp。

2.2.11 Western blot 法 檢測(cè) 各組p-p65、MMP9 的表達(dá) 各組細(xì)胞干預(yù)24 h 后棄上清，PBS 洗滌后加入細(xì)胞裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）， 冰上裂解30 min 后12 000 r/min，離心半徑5 cm，離心15 min，吸取上清并加入緩沖液，100 ℃金屬浴5 min 后放入-80 ℃凍存。 選用8%～12%的分離膠進(jìn)行電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，使用5%脫脂奶粉封閉1 h 后加入稀釋后的一抗（1∶1000）放入4 ℃過夜，TBST 清洗3 次，8 min 后用稀釋后的二抗（1∶5000）孵育1 h， 再次使用TBST 洗膜后加入ECL 液上機(jī)顯影。 內(nèi)參為GAPDH，使用Image J 軟件分析pp65、MMP9 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

3.1.1 加味獨(dú)活寄生合劑治療LDH 的潛在靶點(diǎn)的確定 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)及BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并經(jīng)文獻(xiàn)補(bǔ)充后，共篩選出加味獨(dú)活寄生合劑19 種藥物共計(jì)295 種活性成分，見圖1A。 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取及SwissTarget 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)經(jīng)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范化處理，得到257 個(gè)活性成分作用靶點(diǎn)，通過GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)共搜集得到498 個(gè)LDH 疾病靶點(diǎn)，加味獨(dú)活寄生合劑與LDH 兩者的交集靶標(biāo)為50 個(gè)，見圖1B。

圖1 加味獨(dú)活寄生湯中有效活性成分分布情況及藥物－疾病靶標(biāo)交集情況

3.1.2 加味獨(dú)活寄生合劑干預(yù)LDH 的“藥物－化合物－疾病靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建 將交集靶標(biāo)入Cytoscape 軟件中構(gòu)建“藥物－化合物－疾病靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。 其中節(jié)點(diǎn)的類型代表藥物成分、疾病和交集靶標(biāo)，利用“CentiScape”插件計(jì)算有效成分的度值，度值越高提示發(fā)揮主要功能的概率越大。 在“藥物－化合物－疾病靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)模型中，該網(wǎng)絡(luò)的度值的中位數(shù)為9，大于該值的活性成分有槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、山柰酚，提示它們?cè)诩游丢?dú)活寄生合劑干預(yù)LDH 中發(fā)揮主要功能。

圖2 加味獨(dú)活寄生合劑干預(yù)LDH 的“藥物－化合物－疾病靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)模型

3.1.3 加味獨(dú)活寄生合劑干預(yù)LDH 的PPI 的構(gòu)建及核心靶蛋白的獲取 將獲得的交集靶標(biāo)輸入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，將Settings 設(shè)為“high confidence：0.7”，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)。并導(dǎo)入Cytoscape 軟件繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯鶕?jù)度值大于中位數(shù)篩選出核心靶蛋白，如圖3A所示。 此網(wǎng)絡(luò)的度值中位數(shù)為13.4，以此為標(biāo)準(zhǔn)篩選出核心靶蛋白16 個(gè)，如圖3B 所示，IL-6 靶蛋白的度值最高，提示最可能是加味獨(dú)活寄生合劑干預(yù)LDH 的核心靶點(diǎn)。

圖3 加味獨(dú)活寄生合劑干預(yù)LDH 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶蛋白

3.1.4 加味獨(dú)活寄生合劑活性成分-LDH 靶點(diǎn)GO功能及KEGG 通路富集分析 通過clusterProfiler GO.R 插件及Perl 語(yǔ)言對(duì)活性成分與LDH 的交集靶標(biāo)進(jìn)行GO 分析獲取1 294 生物功能、22 條細(xì)胞功能以及70 種分子功能，如圖4A 所示。 應(yīng)用clusterProfilerKEGG.R 插件進(jìn)行KEGG 通路富集分析。 如圖4B 所示，KEGG 富集分析中IL-17 相關(guān)信號(hào)通路富集的集因子值較高，提示其可能為關(guān)鍵通路。

圖4 加味獨(dú)活寄生合劑干預(yù)LDH 的GO 功能（A）及KEGG 通路富集（B）分析

3.2 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.2.1 終板軟骨細(xì)胞及其退變模型鑒定 倒置顯微鏡下細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)為梭形并多角形，見圖5A。 甲苯胺藍(lán)染色顯示，細(xì)胞核被染色為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)及胞漿被染為淡藍(lán)色，見圖5B。CollagenⅡ免疫熒光染色鑒定結(jié)果顯示，胞漿熒光為紅色，細(xì)胞核不著色，見圖5C。 據(jù)此可鑒定提取培養(yǎng)的細(xì)胞為終板軟骨細(xì)胞。

圖5 終板軟骨細(xì)胞的鑒定

IL-17 刺激誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞24 h 后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)少量漂浮細(xì)胞，細(xì)胞偽足輕度減少，見圖6A。甲苯胺藍(lán)顯示，可見細(xì)胞有空泡狀改變，見圖6B。CollagenⅡ免疫熒光染色鑒定結(jié)果顯示，紅色熒光顏色明顯變淺，見圖6C。由此可以推斷，經(jīng)過IL-17 刺激誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞24 h 后，終板軟骨細(xì)胞明顯退變衰老，細(xì)胞功能下降。

圖6 退變終板軟骨細(xì)胞模型的鑒定

3.2.2 含藥血清毒性檢測(cè) 與空白對(duì)照組相比，含藥血清超過20%的各組細(xì)胞活性顯著下降（P＜0.05），具有顯著的細(xì)胞毒性，因此，選定最高含藥血清濃度為20%。 詳見圖7。

圖7 不同濃度含藥血清對(duì)終板軟骨細(xì)胞活性影響

3.2.3 各組終板軟骨細(xì)胞活性 與空白對(duì)照組相比，經(jīng)過IL-17 干預(yù)造模24 h 的終板軟骨細(xì)胞，活性顯著下降（P＜0.05）。與模型對(duì)照組相比，加味獨(dú)活寄生合劑低、中、高劑量組活性顯著升高（P＜0.05）。 詳見圖8。

圖8 各組終板軟骨細(xì)胞活性

3.2.4 各組終板軟骨細(xì)胞周期 與空白對(duì)照組相比，其余各組的G1 期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），S期比例顯著降低（P＜0.05），見圖9。與模型組相比，加味獨(dú)活寄生合劑低、中、高劑量組G1 細(xì)胞比例均顯著降低（P＜0.05），S 期比例顯著升高（P＜0.05），見圖10。

圖9 各組終板軟骨細(xì)胞周期

圖10 各組終板軟骨細(xì)胞周期比例

3.2.5 各組終板軟骨細(xì)胞上清液IL-6 的含量的比較 與空白對(duì)照組相比，經(jīng)過IL-17 干預(yù)造模24 h的終板軟骨細(xì)胞，IL-6 含量明顯升高（P＜0.05）。 與模型對(duì)照組相比，加味獨(dú)活寄生合劑低、中、高劑量組IL-6 含量顯著降低（P＜0.05）。 詳見圖11。

圖11 各組終板軟骨細(xì)胞上清液IL-6 的含量

3.2.6 各組終板軟骨細(xì)胞p-p65、MMP9 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量 與空白對(duì)照組相比，經(jīng)過IL-17 干預(yù)造模24 h 的終板軟骨細(xì)胞，p-p65、MMP9 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。與模型對(duì)照組相比，加味獨(dú)活寄生合劑低、中、高劑量組p-p65 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。 詳見圖12。

圖12 各組終板軟骨細(xì)胞p-p65、MMP9mRNA 的相對(duì)表達(dá)量

3.2.7 各組終板軟骨細(xì)胞p-p65、MMP9 蛋白的表達(dá) 與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組p-p65、MMP9蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。 與模型對(duì)照組相比，加味獨(dú)活寄生合劑低、中、高劑量組p-p65、MMP9蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）。 詳見表1、圖13—14。

表1 各組軟骨細(xì)胞中p-p65、MMP9 蛋白表達(dá)量的變化（±s，n=3）

表1 各組軟骨細(xì)胞中p-p65、MMP9 蛋白表達(dá)量的變化（±s，n=3）

注：與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05；與模型對(duì)照組相比，#P＜0.05。

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組加味獨(dú)活寄生合劑低劑量組加味獨(dú)活寄生合劑中劑量組加味獨(dú)活寄生合劑高劑量組F P p-p65/GAPDH 0.49±0.02 0.90±0.02*0.79±0.02*#0.76±0.02*#0.58±0.07*#73.133＜0.05 MMP9/GAPDH 0.71±0.02 0.92±0.01*0.88±0.02*#0.83±0.02*#0.61±0.04*#76.406＜0.05

圖13 各組終板軟骨細(xì)胞p-p65 蛋白表達(dá)電泳圖

圖14 各組終板軟骨細(xì)胞MMP9 蛋白表達(dá)電泳圖

4 討論

隨著社會(huì)人口老齡化和人們生活方式的改變，LDH 的發(fā)病率明顯增加[15]。由于其高致殘率的特點(diǎn)，LDH 給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[16-17]，因此，對(duì)于LDH 的防治有十分重要的意義。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體外實(shí)驗(yàn)研究，探究加味獨(dú)活寄生合劑治療LDH 的具體作用機(jī)制。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)加味獨(dú)活寄生合劑治療LDH 具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特征。 槲皮素、木犀草素、漢黃芩素和山柰酚可能是加味獨(dú)活寄生合劑治療LDH的主要活性成分， 而IL-6、JUN、AKT-1、MAPK-8 和MMP9 則是其對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

研究結(jié)果提示，加味獨(dú)活寄生合劑中含有295種活性成分，其中槲皮素、木犀草素、漢黃芩素和山柰酚是治療LDH 較為重要的活性成分。這4 種成分均屬于黃酮類化合物，是植物為抵御外界脅迫而產(chǎn)生的天然化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎和抗病毒作用[18]。 槲皮素是一種在安全劑量范圍內(nèi)天然無毒的類黃酮，具有抗氧化、抗凋亡和抗炎特性，可以通過抑制氧化應(yīng)激、減少炎癥反應(yīng)和恢復(fù)線粒體功能障礙來延緩軟骨細(xì)胞衰老[19]。 木犀草素抑制H2O2誘導(dǎo)原代鼠軟骨細(xì)胞中的細(xì)胞死亡、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、程序性壞死和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生[20]。漢黃芩素通過誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中AMPKα 磷酸化，抑制鐵死亡，從而保護(hù)軟骨細(xì)胞[21]。 山柰酚可通過抑制炎癥、氧化應(yīng)激、破骨細(xì)胞自噬和成骨細(xì)胞凋亡，同時(shí)激活成骨細(xì)胞自噬來實(shí)現(xiàn)骨骼保護(hù)作用[22]。

炎癥的刺激會(huì)引起終板軟骨細(xì)胞的退變繼而引發(fā)椎間盤的突出[4-5]。 IL-17 能夠促進(jìn)炎癥因子和趨化因子的表達(dá)，導(dǎo)致各種炎癥性疾病的發(fā)展。 IL-17通過結(jié)合異二聚體受體IL-17RA 和IL-17RC，可誘導(dǎo)NF-κB 等轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)，增強(qiáng)下游IL-6、MMP9等細(xì)胞因子的表達(dá)[23-25]；從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，表達(dá)一系列炎癥介質(zhì)，這些介質(zhì)可以損傷軟骨細(xì)胞功能、抑制軟骨細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，最終造成軟骨細(xì)胞代謝失衡以及疾病的發(fā)生和發(fā)展[26]。IL-6 是白細(xì)胞介素家族中的一種具有多重效應(yīng)的細(xì)胞因子，參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等各方面。 作為炎癥發(fā)生和參與的重要介質(zhì)，其能夠影響LDH、膝骨性關(guān)節(jié)炎等骨與關(guān)節(jié)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，在腰椎間盤突出組織中存在較高表達(dá)[27]。 MMP9 是基質(zhì)合成和降解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在生理?xiàng)l件下，MMP9 可水解衰老和受損的椎間盤組織，其過度活化會(huì)導(dǎo)致椎間盤的退化并引起疼痛[28]。 此外，NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[29]。 相關(guān)研究表明，IL-17 與軟骨細(xì)胞表面的IL-17 受體結(jié)合后，可觸發(fā)NF-κB p65的磷酸化，進(jìn)而控制軟骨正常發(fā)育和病理破壞[30]。

本研究中，IL-17 干預(yù)后的細(xì)胞偽足輕度減少，有空泡狀改變，Ⅱ型膠原含量明顯減低，形成了明顯的終板軟骨細(xì)胞退變模型。 與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組細(xì)胞活性顯著下降（P＜0.05），增殖明顯被抑制（P＜0.05），IL-6、p-p65、MMP9 的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。通過不同濃度的含藥血清干預(yù)后，相比于模型對(duì)照組細(xì)胞，細(xì)胞活性顯著升高（P＜0.05），增殖情況顯著改善（P＜0.05），各組細(xì)胞IL-6、p-p65、MMP9的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

綜上所述，加味獨(dú)活寄生合劑含藥血清可起到保護(hù)終板軟骨細(xì)胞退變的作用。 其可能通過調(diào)控IL-17/NF-κB 通路，抑制IL-6 以及MMP9 的表達(dá)，促進(jìn)終板軟骨細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮對(duì)LDH 的治療作用。 然而，本研究仍存在不足之處，實(shí)驗(yàn)只驗(yàn)證了核心通路和對(duì)應(yīng)的核心靶點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)未設(shè)置陽(yáng)性藥物對(duì)照組。未能完整驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提示的其他通路及蛋白；接下來課題組將進(jìn)行更加深入的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步探究加味獨(dú)活寄生合劑治療LDH 的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更加堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。