朱沁泉，張 滌*

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是小兒常見(jiàn)的肺部疾患，主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性咳嗽、喘息、氣促、胸悶，并伴可逆性的氣道高反應(yīng)及梗阻性呼吸道疾病[1]。哮喘是由環(huán)境因素與遺傳因素共同決定的多基因復(fù)雜性疾病，遺傳因素決定了個(gè)體對(duì)哮喘的易感性，其主要發(fā)病機(jī)制是Th 淋巴細(xì)胞失衡、氣道炎癥、氣道重塑和信號(hào)通路調(diào)節(jié)異常[2]。 氣道炎癥、組織結(jié)構(gòu)損傷以及繼發(fā)性組織異常修復(fù)導(dǎo)致哮喘患者氣道壁結(jié)構(gòu)改變稱為氣道重塑，是哮喘的主要病理特征[3]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療小兒哮喘主要以激素類(lèi)藥物內(nèi)服或霧化為主，由于兒童對(duì)藥物的新陳代謝水平與成人不同，兒童長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。目前，已有研究證實(shí)應(yīng)用中醫(yī)藥干預(yù)可改善氣道重塑、降低易感基因表達(dá)，可有效治療哮喘[4-6]。湖南省名中醫(yī)張滌從事中醫(yī)藥防治兒童呼吸系統(tǒng)疾病的臨床工作近30 年，結(jié)合哮喘“痰氣搏結(jié)”的病機(jī)原理，創(chuàng)立降氣平喘湯治療兒童哮喘急性發(fā)作期。研究顯示，降氣平喘湯可明顯緩解哮喘急性發(fā)作期患兒臨床癥狀，減少急性發(fā)病次數(shù)及病情程度[7-8]。

本研究通過(guò)構(gòu)建哮喘大鼠模型，觀察哮喘大鼠肺組織中炎癥因子及解整合素金屬蛋白酶33（ADAM33）、E26 轉(zhuǎn)錄因子-1（E26 transformation-specific, ETS-1）表達(dá)的情況，探究降氣平喘湯改善哮喘氣道重塑的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠60 只，鼠齡6 周，體質(zhì)量（200±20） g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（備案編號(hào)：ZYFY20210408），符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理原則。

1.2 藥物及主要試劑

降氣平喘湯（蜜麻黃1 g，桔梗3 g，苦杏仁3 g，桑白皮5 g，地骨皮5 g，白果2 g，紫蘇子2 g，葶藶子2 g，白前3 g，百部3 g，款冬花3 g，紫菀3 g，甘草2 g），所有中藥材均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門(mén)診中藥房，經(jīng)浸泡、煎煮、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至生藥量為0.806 g/mL 的藥液，置于4 ℃冰箱中保存。孟魯司特鈉片（杭州默沙東藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：5 mg/片，批號(hào)：J20130054）為本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照組用藥，給藥前將孟魯司特鈉片劑磨碎，用生理鹽水配制成含藥量為0.26 mg/mL 藥液。

卵蛋白（ovalbumin, OVA）（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：A5253）；大鼠白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1 beta,IL-1β）ELISA 試劑盒（批號(hào)：E-EL-R0012c），大鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin 6, IL-6）ELISA 試劑盒（批號(hào)：E-EL-R0015c），大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor β1, TGF-β1）ELISA 試劑盒（批號(hào)：E-EL-0162c），均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；PierceTM Rapid Gold BCA 蛋白測(cè)定試劑盒（北京蘭杰柯科技有限公司，批號(hào)：69107317）；5×蛋白上樣緩沖液（武漢四維加生物科技有限公司，批號(hào)：8190011128）；TRIS（批號(hào)：115KG001-1KG），甘氨酸（批號(hào)：1275KG2P5-2.5KG）均購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司；SDS（批號(hào)：#S8010-500 g），Tween 20（批號(hào)：#T8220）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；ECL 化學(xué)發(fā)光底物（美國(guó)Bio-Rad 公司，批號(hào)：170-5060）；蛋白Marker（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，批號(hào)：26616）；RNA 提取液（批號(hào)：G3013），ServicebioR○RT First Strand cDNA Synthesis Kit（批號(hào)：G3330），2×SYBR Green qPCR Master Mix（None ROX）（批號(hào)：G3320）均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；HyPure TMMolecular Biology Grade Water（美國(guó)HyClone 公司，批號(hào)：SH30538.02）。

1.3 主要儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱（日本Asone 公司，型號(hào)：ICV-450）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司，型號(hào)：FlexStation 3）；組織研磨器（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，型號(hào)：Tissulyser-24）；電泳槽（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYY-6C）；酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司， 型號(hào)：Rt-6100）；暗匣（廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司，型號(hào)：AX-Ⅱ）；熒光定量PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)：CFX）；超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)：NanoDrop2000）；光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司，型號(hào)：Eclipse E100）；成像系統(tǒng)（日本尼康，型號(hào)：DS-U3）。

2 方法

2.1 分組

60 只大鼠隨機(jī)選取15 只為正常組，其余大鼠造模，造模成功大鼠，隨機(jī)分為模型組、中藥組和西藥組，每組15 只。

2.2 模型制備與干預(yù)

除正常組外，其余大鼠均參照文獻(xiàn)[9-10]并加以改進(jìn)制備哮喘模型，分別于第0、7 天給大鼠腹腔注射0.2 mL OVA 致敏液，第14 天將大鼠放入霧化器的有機(jī)玻璃盒中，以2.5%OVA 液霧化吸入激發(fā)30 min，每天1 次，連續(xù)霧化14 d。 在第31、34、37、40、44、47、50、53 天以同樣方法霧化激發(fā)，共激發(fā)22次。 正常組以生理鹽水霧化。 激發(fā)時(shí)，觀察大鼠反應(yīng)，若出現(xiàn)咳嗽、呼吸加深加快、聳毛、噴嚏、干嘔、抓耳撓腮、煩躁不安等癥狀中的2 項(xiàng)或2 項(xiàng)以上者，或抽搐、虛脫者，即為造模成功。 剔除造模失敗大鼠，每組保留12 只進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

按照人與大鼠體表面積換算公式計(jì)算給藥劑量[11]，中藥組大鼠每天降氣平喘湯灌胃生藥量為8.06 g/kg，西藥組大鼠每日孟魯司特鈉灌胃給藥劑量為2.6 mg/kg。 從實(shí)驗(yàn)第54 天開(kāi)始，每天灌胃1次，中藥組予降氣平喘湯，西藥組予孟魯司特鈉，正常組和模型組予生理鹽水，給藥劑量均為10 mL/kg，連續(xù)7 d。 各組于末次給藥后禁食12 h，次日處死大鼠，取肺組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

2.3 標(biāo)本制備

用戊巴比妥麻醉大鼠，處死后，開(kāi)胸摘取肺組織，用預(yù)冷的PBS 沖洗。 取部分右肺，浸入10%中性福爾馬林固定液中固定，石蠟包埋，切片行HE 染色，余肺上葉用于ELISA 檢測(cè)，中葉和下葉用濾紙吸干后放于凍存管，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 HE 染色觀察肺組織病理變化 先將肺組織切片脫蠟至水，依次進(jìn)行蘇木精染色、伊紅染色、脫水封片，在顯微鏡下觀察拍照。選擇視野主要觀察肺葉、氣道及伴行血管、肺泡等結(jié)構(gòu)的形態(tài)，有無(wú)炎癥浸潤(rùn)及氣道重塑等。

2.4.2 ELISA 法檢測(cè)肺組織IL-1β、IL-6、TGF-β1濃度 肺組織稱重后剪碎，將剪碎的組織與PBS 加入組織研磨器中，充分冰浴研磨，勻漿液3 000 r/min離心10 min，取上清液檢測(cè)。 嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清液IL-1β、IL-6、TGF-β1 濃度。

2.4.3 Western blot 法檢測(cè)肺組織ADAM33、ETS-1蛋白的表達(dá) 提取各組肺組織蛋白，勻漿后用BCA法測(cè)定蛋白濃度。 10%的分離膠、5%的濃縮膠對(duì)各組蛋白樣品進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，PVDF 膜與一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜5 min×5次，室溫下將PVDF 膜二抗中孵育60 min，TBST 洗膜5 min×5次后，滴加新鮮配制的ECL 混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)?，發(fā)光檢測(cè)。 將膠片掃描存檔，AlphaEaseFC 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

2.4.4 real-time PCR 法檢測(cè)肺組織ADAM33 mRNA 的表達(dá) 按照試劑盒要求抽提大鼠右肺下葉肺組織的總RNA，用蛋白核酸分析儀檢測(cè)RNA 濃度后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，2×SYBR GREEN 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)肺組織ADAM33 mRNA 表達(dá)情況。 real-time PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。 同時(shí)每升溫0.5 ℃，采集1 次熒光信號(hào)，繪制熔解曲線。 引物序列為（232bp）：上游5'-GGCACTGTCAGAATGCTACCTCC-3'，下游5'-CCAGGAAGTAGAGGCAGCAGAAA-3'。 采用2-△△ct方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 造模情況

正常組大鼠反應(yīng)靈敏，行動(dòng)敏捷，無(wú)呼吸肌痙攣表現(xiàn)。 模型組大鼠在激發(fā)時(shí)出現(xiàn)呼吸急促甚至困難、輕度發(fā)紺、腹肌緊張、抓鼻等癥狀，多次激發(fā)后出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、行動(dòng)遲滯甚至仆臥不動(dòng)、皮毛無(wú)光澤、體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢。 西藥組、中藥組大鼠給藥前癥狀與模型組相似，給藥后氣促、打噴嚏等癥狀有不同程度的改善。

3.2 各組肺組織病理變化

正常組肺組織內(nèi)氣道黏膜上皮和肺泡結(jié)構(gòu)完整，無(wú)充血或水腫，肺組織無(wú)明顯異常炎癥反應(yīng)，氣道平滑肌平緩而薄，偶有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔距離較窄。 模型組肺小葉結(jié)構(gòu)破環(huán)，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂融合，黏膜充血水腫，肺組織的氣道腔、氣管壁及伴行的血管周?chē)写罅苛馨图?xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及大量黏性分泌物，氣道、肺泡上皮損傷脫落、氣道平滑肌層和網(wǎng)狀基底膜層增生，氣道黏膜襞增多、氣道壁明顯增厚。 西藥組采用孟魯司特鈉處理后，大鼠肺部炎癥較模型組相對(duì)減輕，肺葉結(jié)構(gòu)仍不完整，仍可見(jiàn)肺組織的氣道腔、氣管壁及伴行的血管周?chē)械攘康难装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌層厚度輕度增生，纖維結(jié)締組織增生減少。 中藥組經(jīng)降氣平喘湯處理后，大鼠肺部炎癥較模型組程度減輕，支氣管腔的部位僅有少量散在的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌層厚度基本正常，纖維結(jié)締組織接近正常組。 詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE 染色結(jié)果（×400）

3.3 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TGF-β1 濃度比較

與正常組比較，模型組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TGF-β1 濃度明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組及中藥組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TGFβ1 濃度明顯降低（P＜0.05）；與西藥組比較，中藥組大鼠肺組織中IL-1β 濃度降低（P＜0.05），IL-6、TGFβ1 濃度升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TGF-β1 濃度比較（±s）

表1 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TGF-β1 濃度比較（±s）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。

組別正常組模型組西藥組中藥組n 12 12 12 12 IL-1β/（pg·mL-1）2 383.97±513.59 3 814.85±381.89#3 346.90±521.92*3 185.10±1 129.83*△IL-6/（pg·mL-1）136.80±16.72 209.02±26.23#158.84±21.09*179.84±16.86*TGF-β1/（ng·mL-1）1.84±0.15 2.42±0.26#2.16±0.14*2.28±0.23*

3.4 各組大鼠肺組織ADAM33、ETS-1 蛋白表達(dá)水平比較

與正常組比較，模型組大鼠肺組織ADAM33、ETS-1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組、中藥組大鼠肺組織ADAM33、ETS-1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與西藥組比較，中藥組大鼠ADAM33 蛋白表達(dá)水平略降低，ETS-1 蛋白表達(dá)水平略升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組大鼠肺組織ADAM33、Est-1 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織ADAM33、Est-1 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別正常組模型組西藥組中藥組n 12 12 12 12 ADAM33/β-actin 0.51±0.06 1.00±0.09#0.34±0.02*0.29±0.03*ETS-1/β-actin 0.74±0.18 0.95±0.14#0.37±0.10*0.43±0.07*

圖2 各組大鼠肺組織AMAD33、ETS-1 蛋白表達(dá)電泳圖

3.5 各組大鼠肺組織ADAM33 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較

與正常組比較，模型組大鼠肺組織ADAM33 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組、中藥組大鼠肺組織ADAM33 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；與西藥組比較，中藥組大鼠肺組織ADAM33 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。 詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠肺組織ADAM33 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織ADAM33 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。

ADAM33 mRNA 相對(duì)表達(dá)量0.80±0.26 4.05±0.36#2.81±0.19*1.91±0.13*△組別正常組模型組西藥組中藥組n 12 12 12 12

4 討論

哮喘是氣道炎癥、氣道重塑、氣道高反應(yīng)性及遺傳因素共同作用的結(jié)果，氣道重塑的特征之一是氣道平滑肌增厚，是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）分子的過(guò)度產(chǎn)生和堆積導(dǎo)致的病理改變[12]。IL-1β 和IL-6 作為常見(jiàn)的促炎因子，前者主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可上調(diào)黏蛋白MUA5AC 表達(dá)，促使黏液分泌[13]；后者來(lái)源于體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等，可介導(dǎo)多種炎癥因子浸潤(rùn)于支氣管黏膜[14]，二者都能促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增生，使氣道平滑肌增厚。TGF-β1 由體內(nèi)多種細(xì)胞分泌，可使炎癥因子在氣道內(nèi)聚集和大量釋放，推動(dòng)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，并可能引起氣道平滑肌的上皮下纖維化和增殖[15]。研究表明，ADAM33 在氣道平滑肌與成纖維細(xì)胞中均有表達(dá)，通過(guò)水解細(xì)胞表面的黏附分子，釋放表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor, EGF）、肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子（heparin-binding epithelial growth factor, HB-EGF）等生長(zhǎng)因子，導(dǎo)致氣道平滑肌與成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，誘發(fā)氣道重塑[16-17]。 研究證實(shí)，ADAM33 過(guò)表達(dá)與哮喘發(fā)病密切相關(guān)，與兒童哮喘的早期起源、氣道高反應(yīng)性及小氣道重塑密切相關(guān)[18]。 ETS-1 能夠調(diào)控許多哮喘相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，如IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A、TGF-β 等，進(jìn)而參與哮喘的發(fā)病過(guò)程，同時(shí)在氣道重塑中發(fā)揮重要作用[19]。

小兒哮喘發(fā)病常因外感風(fēng)寒之邪，又因小兒肺常不足，表邪未散，入里化熱，形成寒熱夾雜之候。小兒易感外邪，多隨風(fēng)而入，感邪之后易從熱化，或宿根痰飲內(nèi)伏，積久化熱，痰熱壅塞氣道。 結(jié)合湖南省地理位置、氣候特點(diǎn)，及小兒飲食生活習(xí)慣，張滌教授在治療上遵從“因時(shí)制宜，因地制宜，因人制宜”的思想，將患兒的疾病、飲食習(xí)慣、體質(zhì)狀態(tài)、氣候環(huán)境等與辨證論治思想相結(jié)合，臨床用自擬降氣平喘湯治療小兒哮喘急性發(fā)作期外寒肺熱證[7]。 降氣平喘湯據(jù)《攝生眾妙方》中的定喘湯化裁而來(lái)，其藥物組成為蜜麻黃、桔梗、苦杏仁、桑白皮、地骨皮、白果、紫蘇子、葶藶子、白前、百部、款冬花、紫菀、甘草等。 蜜麻黃宣肺散邪平喘，又能解外感風(fēng)寒之證，白果斂肺定喘祛痰，共為君藥，一散一收，既加強(qiáng)平喘之功，又防麻黃耗散肺氣；苦杏仁以降為主、潤(rùn)燥下氣為臣藥；桑白皮清瀉肺熱、止咳平喘，地骨皮瀉肺火、退虛熱，兩藥入肺經(jīng)共解肺熱；紫蘇子、葶藶子降氣平喘；桔梗為舟楫之劑載藥上行為佐使，與苦杏仁一升一降順暢氣機(jī)。佐白前、百部、款冬花、紫菀潤(rùn)肺化痰止咳；甘草調(diào)和諸藥為使。諸藥合用，表寒得解，肺熱清泄，共奏降氣平喘，止咳化痰之功，則肺氣宣降得當(dāng)、痰熱得化，咳喘得止。孟魯司特鈉是白三烯受體拮抗劑，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合半胱酸受體，抑制白三烯的活性，發(fā)揮舒張支氣管平滑肌、減輕黏膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、降低氣道高反應(yīng)性的作用[20]，具有良好的抗炎和降低氣道阻塞的作用[21]，研究發(fā)現(xiàn)孟魯司特鈉可降低氣道平滑肌細(xì)胞上清液中TGF-β1 和IL-6 水平[22]，同時(shí)抑制氣道平滑肌細(xì)胞增殖、改善氣道重塑、減輕炎癥反應(yīng)[23]。

本研究結(jié)果顯示，降氣平喘湯可明顯減輕哮喘模型大鼠肺部炎癥程度，降低支氣管腔炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，抑制平滑肌肌層厚度及纖維結(jié)締組織改變，證明降氣平喘湯對(duì)哮喘模型大鼠氣道炎癥及氣道重塑的抑制作用。 降氣平喘湯可降低哮喘模型大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TGF-β1 等炎癥因子濃度，下調(diào)ADAM33、ETS-1 的蛋白表達(dá)水平，與孟魯司特鈉組無(wú)顯著差異。本研究尚缺乏對(duì)降氣平喘湯緩解氣道炎癥與抑制哮喘易感基因表達(dá)之間的機(jī)制研究，有待進(jìn)一步探索。

綜上所述，降氣平喘湯抑制氣道重塑的機(jī)制與減少I(mǎi)L-1β、IL-6、TGF-β1 等炎癥因子釋放及抑制ADAM33、ETS-1 表達(dá)相關(guān)，為降氣平喘湯治療哮喘的推廣使用提供了理論支撐。