陳 鎮(zhèn)，向 彪，周 鑫，付子煜，劉 濤，吳金鴻，歐陽林旗，喻 斌，鄧桂明*

湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007

烏藥為樟科山胡椒屬植物烏藥[Lindera aggregata (Sims) Kosterm.]的干燥塊根，主產于浙江、湖南、廣東等地，具有溫腎散寒、行氣止痛的功效。烏藥主要化學成分為揮發(fā)油、生物堿、黃酮類、呋喃倍半萜及其內酯、鞣質等[1]。 現代藥理學研究表明，烏藥具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保肝、降脂、降糖等藥理活性，其對胃腸道疾病、心血管疾病、代謝綜合征、脂肪肝等疾病具有顯著的防治作用[1-4]。 課題組前期對烏藥藥理、藥效作用進行了研究[4-6]，發(fā)現烏藥水提物對腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome, IBS-D）大鼠腹痛、腹瀉等癥狀具有顯著改善作用。前期研究證實，烏藥防治IBSD 大鼠療效確切，但其作用機制仍有待進一步深入研究。

IBS-D 是一種非器質性病變的功能性胃腸道疾病，以持續(xù)或間歇性腹痛或腹部不適、排便頻率、糞便性狀改變等為主要特征[7]。IBS-D 發(fā)病機制尚未完全闡明，研究表明其與內臟高敏感性、胃腸動力異常、腸道菌群失調、免疫功能異常、腸道低度炎癥等有關[8-9]。 為進一步開發(fā)烏藥臨床藥用價值，本研究通過HPLC 方法對10 批不同產地烏藥的質量進行分析和評價；同時，通過構建IBS-D 大鼠模型，進一步研究烏藥對IBS-D 大鼠低度炎癥的作用機制，以期為闡明烏藥防治IBS-D 的作用機制研究提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物

雄性SPF 級SD 大鼠60 只，體質量（200±20） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。 動物合格證號43004700022217，許可證號SCXK（湘）2017-0003。 飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心，室溫（23±2） ℃，相對濕度60%～70%，晝夜交替12 h/12 h。 大鼠適應性飼養(yǎng)一周后進行實驗，動物實驗經湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心倫理委員會批準（倫理編號：ZYFY20170618-11）。

1.2 藥材與試劑

番瀉葉（批號2015112712）購自湖南三湘中藥飲片有限公司；10 批次烏藥購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院和廣州大參林藥店，其來源信息分別為S1：批號20140227，郴州；S2：批號20160531，河北；S3：批號20150321，寧鄉(xiāng)；S4：批號SL15090807，浙江；S5：批號20151028，湖南；S6：批號160406，浙江；S7：批號AM15032602，浙江；S8：批號HD16052602，湖南；S9：批號20150824，湖南；S10：批號160501，廣州。上述中藥材經湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院張裕民教授分別鑒定為樟科植物烏藥Lindera aggregata （Sims） Kosterm 的干燥塊根和豆科植物番瀉葉Cassia angustifolia Vahl 的干燥小葉，均符合《中華人民共和國藥典》收載標準。 匹維溴銨片（批號639288，50 mg/片）購自Abbott Products SAS 公司。色譜級乙腈（批號：14094423，美國Merk 公司）；色譜級醋酸銨（批號：14091246，上海麥克林公司）；β-actin 抗 體（批號：AP0060）、YAP 抗 體 （批號：BZ00449）均購自美國Bioworld 公司；PPAR-γ 抗體（批號：sc-7273）、VCAM-1 抗體（批號：sc-6285）均購自美國SANTA CRUZ 公司；SRC 抗體（批號：11097-1-AP，美國Proteintech 公司）；超純水由FLB00003057超純水制備系統制得。

1.3 儀器

Agilent1290 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；5415R 型冷凍高速離心機（德國艾本德股份公司）；KQ5200D 型超聲儀（東莞市科橋超聲波設備有限公司）；BS124S 型十萬分之一電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；RE-5203 型旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮儀器廠）；DR-200Bs 型多功能酶標儀（Diatek 公司）；WD-9405A 型脫色搖床（北京市六一儀器廠）；A101439 型電泳儀、721BR12725 型凝膠成像系統均購自美國Bio-Rad 公司；205A 型生物顯微鏡（中國Motic 公司）；KD-BM Ⅱ型生物組織包埋機（浙江省金華科迪儀器設備有限公司）；YD-A 型生物組織攤片機（金華市益迪醫(yī)療設備有限公司）；Milli-Q 型超純水凈化系統（美國Billerica 公司）。

2 方法

2.1 烏藥水提物供試品溶液制備

參考課題組前期文獻制備方法[10]，將10 批不同產地的烏藥制備成水提物，分別稱取適量烏藥，加入8 倍體積的水，浸泡30 min，武火加熱至沸騰，煎煮1 h，濾取藥物，藥渣繼續(xù)用6 倍水，武火加熱至沸騰，煎煮1 h，濾取藥物，合并續(xù)慮物，減壓回收濃縮，使每毫升藥物相當于1.0 g 生藥，即為烏藥水提物供試品溶液。

2.2 番瀉葉水浸液制備

參考文獻方法[11]，稱取適量番瀉葉，按照1∶4 的料液比加入沸水將番瀉葉浸泡30 min 后，過濾；然后，再按照上述方法分別再浸泡3 次，過濾；合并前后4次濾液、混勻；將番瀉葉水浸液減壓濃縮至0.5 g·mL-1，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 色譜條件

色譜柱：Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；溫度25 ℃；流動相0.1 mol·L-1醋酸銨水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～30 min，2%～9% B；30～70 min，9%～12% B；70～80 min，12%～40% B；80～82 min，40% B；流速0.3 mL·min-1；進樣體積10 μL；檢測波長280 nm。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度 取樣品S9 的供試品溶液，稀釋50倍，離心30 min（12 000 r·min-1，4 ℃），用0.22 μm 微孔濾膜過濾于離心管中待測，按上述色譜條件重復進樣6 次，計算得各主要峰的相對保留時間RSD 為1%以內，峰面積的RSD 均小于3.0%，符合指紋圖譜的檢測要求。

2.4.2 重復性 取樣品S9 6 份，精密稱定，按“2.1”方法制得供試品溶液，并稀釋50 倍，精濾后在上述色譜條件下測定，各主要色譜峰相對保留時間的RSD為1%以內，峰面積的RSD 均小于3.0%，表明該方法的重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性 取樣品S9 1 份，按“2.1”方法制得供試品溶液，并稀釋50 倍，精濾后按上述色譜條件分別在0、2、4、6、8、10 h 進樣。各主要色譜峰的相對保留時間的RSD 為1%以內，峰面積的RSD 均小于3.0%，表明此樣品溶液在10 h 內基本穩(wěn)定。

2.5 造模、分組與給藥

適應性飼養(yǎng)結束后，按照區(qū)組隨機分組法將60只SD 大鼠分成對照組10 只，模型組50 只。采用“番瀉葉灌胃聯合束縛應激”的方法制備IBS-D 大鼠模型[12]：灌胃3.0 g·kg-1番瀉葉水浸液，灌藥1 h 后捆綁其前肢0.5 h，造模持續(xù)2 周。 將造模成功的50只大鼠隨機分為IBS-D 模型組、烏藥低劑量組、烏藥中劑量組、烏藥高劑量組和陽性藥物組，每組各10 只。 烏藥低、中、高劑量組大鼠分別給予0.94、1.88、3.76 g·kg-1烏藥水提物灌胃，陽性藥物組給予1.5 g·kg-1匹維溴銨水溶液灌胃，對照組和IBS-D模型組大鼠給予等體積蒸餾水灌胃，所有大鼠每日灌胃1 次，共持續(xù)2 周。

2.6 樣本收集與處理

末次給藥后，所有大鼠禁食不禁水24 h，麻醉，腹主動脈采血后處死。收集各組大鼠的結腸組織，生理鹽水淋洗干凈后，一部分浸泡于4%多聚甲醛中備用，另外一部分分裝好迅速轉移至-80 ℃冰箱備用。

2.7 HE 染色觀察結腸組織形態(tài)

取大鼠結腸組織于4%多聚甲醛中固定，切成約0.2 cm 厚的組織塊，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明。 浸蠟：48～52 ℃軟蠟30 min，58～62 ℃硬蠟60 min；包埋：自然冷卻后修整蠟塊置低溫保存?zhèn)溆茫磺衅汉穸燃s5 μm，攤片，撈片，60 ℃溫箱中烘烤；染色。二甲苯中透明5 min，中性樹膠封片，常溫晾干。

2.8 PAS 染色觀察結腸組織杯狀細胞形態(tài)及數量變化

切片、脫蠟后，于N-HCl 液內室溫浸洗1 min。再轉入已預熱到60 ℃的N-HCl 液內8 min。 水解后在N-HCl 液室溫浸洗1 min。 在臨用時新配的亞硫酸溶液內洗3 次，每次2 min。流水沖洗5 min，蒸餾水洗。復染于1%光綠水溶液2 min，復染后水洗。脫水，透明，封片。 最后，根據Kruschewski 法進行組織學指數評分，觀察各組大鼠結腸隱窩上的杯狀細胞數量的變化。

2.9 免疫組織化學檢測YAP、PPAR-γ、SRC、VCAM-1蛋白表達水平

切片、脫蠟后，3%過氧化氫浸泡10 min，蒸餾水洗，PBS 洗2 次，每次3 min。 抗原修復1 次：把切片浸泡在PBS 中，微波爐加熱沸騰即可。隔水冷卻至常溫，PBS 洗2 次，每次3 min。 37 ℃恒溫箱中孵育β-actin 抗體2 h，PBS 洗3 次，每次2 min。 使用中杉金橋PV9000 二抗試劑盒，滴加試劑1，室溫20 min，PBS 洗3 次，每次2 min；滴加試劑2，室溫30 min，PBS 洗3 次，每次2 min；加DAB 顯色，顯微鏡下觀察顯色結果，自來水終止反應。 蘇木素復染3 min，水洗，鹽酸乙醇分色，自來水中促藍。 脫水、透明，中性樹膠封片，常溫晾干。

2.10 Western blot 檢測YAP、SRC 蛋白表達水平

適量結腸組織塊研碎，加入適量裂解液冰上放置20 min，使用超聲破碎儀粉碎20 s，于4 ℃，15 000 r/min 離心10 min，取上清液測量蛋白濃度，酶標儀檢測各個樣品562 nm 波長的吸光度值。分別配制10%分離膠及5%濃縮膠，每孔上樣本蛋白40 μg。 80 V 濃縮膠中電泳30 min，120 V 分離膠中電泳約90 min，溴酚蘭距玻璃板5 mm 左右終止電泳，并以4 ℃，100 V 濕轉1.5 h 后，將PVDF膜取出置TBST 配制的5%脫脂牛奶封閉1 h。 PVDF膜和β-actin 抗體（1∶5 000）放入抗體孵育盒，4 ℃過夜。TBST 緩沖液洗膜3 次，37 ℃孵育山羊抗兔二抗1 h，TBST 緩沖液洗膜3 次。 凝膠成像軟件顯影、定量并計算目標蛋白的相對表達量。

2.11 統計分析

使用SPSS 25.0 軟件對數據進行統計分析，數據用“±s”表示。若滿足正態(tài)性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD，方差不齊用Dunnet T3 分析；若不滿足正態(tài)性檢驗，多組間比較采用秩和檢驗；組間比較采用獨立樣本t 檢驗；P<0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 HPLC 結果

按照“2.1”制備S1-S10 號供試品溶液，并稀釋50 倍，精濾后再按上述色譜條件進行檢測。將10 批烏藥樣品的HPLC 圖譜數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004 版本）”軟件，并生成指紋圖譜，設置S5 為參照圖譜，對色譜峰多點校正后進行全譜峰匹配后標定了14 個共有峰。

3.2 相似度評價

選擇10 批烏藥樣品中色譜峰峰型、分離度良好且基線平整的S5 樣品色譜圖作為參照指紋圖譜。對色譜峰多點校正后進行全譜峰匹配，用中位數法生成對照圖譜。 結果顯示，S6 的相似度為0.868，而其余9 批烏藥樣品相似度均大于0.950。浙江烏藥相似度較其他產地烏藥低，表明它們在化學成分組成上存在一定的差異。

3.3 聚類分析和主成分分析

10 批烏藥的HPLC 指紋圖譜中共有14 個共有峰（見表1、圖1），將14 個共有峰的相對峰面積數據進行聚類分析和主成分分析（見圖2）。 結果顯示，樣品S6 偏離原點較遠，自成一類；而其余批次，不同產地的烏藥聚集成同一類。由此說明，浙江烏藥與其余批次烏藥在化學成分組成上具有較大的差異，而湖南、河北、廣東烏藥在化學組成上差異不大。 上述分析結果與相似度結果一致，說明烏藥飲片質量相對穩(wěn)定。 基于上述實驗結果，本文選取產于湖南的烏藥（批號20150824）作為被試藥材水提物對IBS-D大鼠進行干預治療。

表1 10 批烏藥14 個共有峰的峰面積

圖1 10 批不同產地烏藥水提物的HPLC 圖譜

圖2 聚類分析結果和主成分分析

3.4 烏藥水提物對IBS-D 大鼠結腸組織形態(tài)及杯狀細胞的影響

HE 染色結果顯示，與對照組相比，模型組可見炎性細胞浸潤，但未見充血、壞死、潰瘍等情況。 用IPP6.0 軟件分析結腸隱窩深度，并根據Kruschewski法進行組織學指數評分。與對照組相比，模型組中隱窩深度顯著變淺；與模型組相比，烏藥水提物低、中、高劑量組和陽性藥物組中隱窩深度顯著加深（圖3A、B）。 PSA 染色結果（圖3A、C）顯示，IBS-D 模型組大鼠結腸組織隱窩杯狀細胞數目顯著少于對照組（P＜0.01），而在中、高劑量的烏藥水提物和陽性藥物干預下，IBS-D 大鼠隱窩杯狀細胞顯著增加（P＜0.05）。上述研究結果表明，采用“番瀉葉灌胃聯合束縛應激”造模方法可成功制備IBS-D 大鼠模型；烏藥水提物能顯著改善IBS-D 大鼠腸道低度炎癥的癥狀。

圖3 烏藥水提物對IBS-D 大鼠結腸組織形態(tài)及杯狀細胞的影響

3.5 烏藥水提物對IBS-D 大鼠PPAR-γ/VCAM-1及SRC/YAP 通路的影響

免疫組化結果顯示，模型組大鼠結腸黏膜上皮細胞中YAP、PPAR-γ 和SRC 的平均光密度顯著低于對照組（P＜0.01），VCAM-1 顯著高于對照組（P＜0.01）。與IBS-D 模型組相比，烏藥低、中、高劑量組和陽性藥物組大鼠結腸黏膜上皮細胞中YAP、PPAR-γ 和SRC 的平均光密度顯著升高（P＜0.05），VCAM-1 顯著降低（P＜0.05）。 詳見圖4。

圖4 烏藥水提物對IBS-D 大鼠結腸組織YAP、PPAR-γ、SRC 和VCAM-1 表達的影響

Western blot 結果顯示與免疫組化一致。 與對照組相比，模型組YAP 和SRC 蛋白相對表達量顯著低于對照組（P＜0.01）。與模型組相比，烏藥水提物低、中、高劑量組和陽性藥物組蛋白相對表達量顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。 詳見圖5。

圖5 烏藥水提物對IBS-D 大鼠結腸組織YAP、PPAR-γ、SRC 和VCAM-1 蛋白表達的影響

4 討論

本研究基于HPLC 法對湖南、河北和浙江等省10 批烏藥進行分析、檢測，通過建立特征圖譜，標定出14 個共有峰。 方法學考察結果表明，該分析方法穩(wěn)定可靠、重現性較好。相似度分析結果顯示，10 批烏藥樣品與對照指紋圖譜相似度為0.868～1.0，其中湖南、河北、廣東產烏藥與對照指紋圖譜相似度較高（0.950～1.0），浙江產烏藥與對照指紋圖譜相似度較低（0.868～0.950）。 通過聚類分析和主成分分析，可將10 批烏藥分為浙江烏藥與其他產地烏藥兩類。聚類分析結果顯示，湖南、河北、廣東等不同地區(qū)的烏藥聚為一類。由此可見，中藥材烏藥具有一定的產地適應性，各產地烏藥質量基本穩(wěn)定、可控。

Hippo 信號通路是一條能夠調控細胞分裂、增殖、分化和凋亡的信號通路，YAP 是該通路上的一個效應因子，具有啟動Hippo 通路基因轉錄、翻譯的能力[13]。Hippo 信號通路與器官發(fā)育、細胞增殖分化、免疫調節(jié)等生理活動密切相關。 研究發(fā)現，Hippo 信號通路上的關鍵激酶YAP 在LGR5+腸道干細胞增殖分化，維持腸道干細胞穩(wěn)態(tài)的生理過程中扮演著重要角色[14]。 LGR5+腸道干細胞是一類特異性表達LGR5、具有持續(xù)增殖分化功能的細胞，當LGR5+腸道干細胞增殖分化失衡或功能缺失可造成機體腸上皮修復障礙，從而誘發(fā)炎癥性腸病、結直腸癌等一系列腸道疾病[15]。 FALLAH S 等[16]研究發(fā)現，YAP 能夠抑制杯狀細胞、吸收性細胞等腸上皮細胞分化，該抑制作用與SRC 家族激酶對Hippo 通路介導有關。 此外，TANIGUCHI K 等[17]研究發(fā)現，增強YAP 和SRC蛋白表達能夠促進炎癥破壞后的腸道修復。 由此提示，Hippo/YAP/SRC 信號通路對修復腸道的破壞及改善腸道低度炎癥癥狀具有重要意義。

PPAR-γ 為核受體超家族成員可在血管平滑肌、內皮細胞、巨噬細胞中表達[18]。 PPAR-γ 在炎癥因子刺激下，其相對表達量會降低[19]。此外，PPAR-γ可調節(jié)VCAM-1、ICAM-1 等細胞黏附分子和其他炎癥介質的分泌和釋放，從而對炎癥反應起到一種負調控作用[20]。研究表明，PPAR-γ 與NF-κB 之間存在一種雙向拮抗作用[21]。 PPAR-γ 低表達會削弱了其對NF-κB 信號通路的抑制作用，從而增強VCAM-1蛋白表達，導致腸道炎癥的發(fā)生、發(fā)展[22]。

課題組前期基于網絡藥理學研究發(fā)現，烏藥對Hippo/YAP 和PPAR-γ 信號通路具有調節(jié)作用[6]。因此，本文在前期研究基礎上，采用“番瀉葉灌胃聯合束縛應激”的方法制備IBS-D 大鼠模型，進一步探討烏藥對IBS-D 大鼠的作用機制。 HE 和PAS 染色結果表明，IBS-D 大鼠腸道存在低度炎癥，而烏藥水提物能顯著改善IBS-D 大鼠腸道低度炎癥的癥狀。免疫組織化學和Western blot 研究結果表明，烏藥水提物能夠增強YAP 和SRC 蛋白表達。由此提示，烏藥水提物可能是通過增強YAP 和SRC 蛋白表達，抑制杯狀細胞分化，促進腸道炎癥的修復，最終改善IBS-D 大鼠腸道低度炎癥癥狀。此外，免疫組織化學結果顯示，IBS-D 大鼠結腸黏膜上皮細胞中PPAR-γ平均光密度顯著減少，VCAM-1 平均光密度顯著增加；而烏藥水提物能夠顯著升高IBS-D 大鼠結腸黏膜上皮細胞中PPAR-γ 光密度，顯著降低VCAM-1光密度。 由此提示，烏藥水提物還可能通過PPARγ/VCAM-1 通路改善IBS-D 大鼠腸道炎癥癥狀。

綜上所述，本文通過HPLC 技術對不同產地的烏藥進行質量評價，證實被試的不同批次烏藥質量穩(wěn)定、可靠。 此外，研究發(fā)現烏藥治療IBS-D 大鼠低度炎癥的作用機制可能與PPAR-γ/VCAM-1 信號通路有關。