管藝同，朱 淵，陸益紅

江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，南京 210019

蔗糖由一分子葡萄糖和一分子果糖的半縮醛羥基彼此縮合脫水而構(gòu)成，為自然界中分布最廣泛的非還原性二糖，有旋光性，但無變旋光作用。作為一種常見的輔料，其在藥品和生物制品中應用廣泛，不僅可以作為矯味劑或賦形劑應用于糖漿劑、顆粒劑、片劑、口服溶液劑、注射劑等劑型的生產(chǎn)[1]，還可在生物制品中充當冷凍干燥保護劑[2]。蔗糖通過改變生物制品在凍干過程中的物理化學環(huán)境，可以減輕細胞的損傷和一些蛋白質(zhì)的鈍化，盡可能保持原有的生物學活性，并提高制劑穩(wěn)定性[3]。因此，蔗糖在制劑制備過程中發(fā)揮著十分重要的作用。

蔗糖的含量往往對制劑的有效性、穩(wěn)定性和安全性存在著一定程度的影響，例如在生物制品中，蔗糖對蛋白質(zhì)的保護作用有時依賴于濃度。一般來說，在特定的濃度范圍內(nèi)，蔗糖的保護作用隨著濃度升高而增強。然而，當達到一定濃度后，保護作用達到最大值，進一步提高蔗糖濃度則不再增加保護效果，甚至可能降低保護作用[4]。此外，蔗糖的含量還會影響制劑的滲透壓，且由于不同個體耐糖量存在顯著差異，過量攝入蔗糖可能對身體產(chǎn)生不利影響。故為使蔗糖充分發(fā)揮藥用輔料的作用，有必要建立方法以準確測定其在藥品和生物制品中的含量，從而指導生產(chǎn)工藝的優(yōu)化和調(diào)整。

蔗糖含量的測定方法包括基于氧化還原反應的經(jīng)典化學方法、旋光法、色譜法、近紅外光譜法、毛細管電泳法等。由于蔗糖在各類制劑產(chǎn)品中存在的形式各有不同，且不同產(chǎn)品中的蔗糖含量差異較大。因此，應針對各類產(chǎn)品的不同特性以及蔗糖含量的水平差異，選擇最合適的方法。本文列舉了目前較為常用的各類蔗糖含量測定方法，并對各方法的優(yōu)缺點及適用情況進行了闡述，以期為實際工作中蔗糖含量檢測技術(shù)的選用提供一定參考。

1 基于氧化還原反應的經(jīng)典化學方法

蔗糖本身不具有還原特性，但一分子蔗糖在酸或蔗糖酶的作用下，可以水解為一分子D-葡萄糖和一分子D-果糖，兩者均為還原性糖。蔗糖的水解產(chǎn)物與3，5-二硝基水楊酸[5]、間苯二酚[6，7]或斐林試劑[8]等在一定條件下能夠發(fā)生氧化還原反應，產(chǎn)生顏色或沉淀?？苫诖嗽恚帽壬ɑ虻味ǚ▽φ崽呛窟M行測定。

這類方法成本較低，但操作步驟繁瑣，費時費力，精密度和靈敏度均不佳，且易受到多種因素的干擾，如其他還原性糖類、色素、蛋白質(zhì)等的存在均可能導致測定結(jié)果不準確，因而不適合用于檢測蔗糖含量較低、基質(zhì)復雜的樣品。

2 旋光法

蔗糖具有旋光性，可以采用旋光法測定。2020年版 《中國藥典》 四部藥用輔料蔗糖的質(zhì)量標準[9]中，比旋度被作為性狀項列出。楊燁等[10]開發(fā)了一種基于旋光法的蔗糖含量測定方法，用于定量測定b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗中的蔗糖。該方法在蔗糖濃度為2～10 mg·mL-1的范圍內(nèi)與旋光度具有良好的線性關系（r=0.999 9），且準確性、重復性均良好。

采用旋光法測定蔗糖操作簡單、成本低廉。但專屬性較差，對蔗糖不具有選擇性，且靈敏度低，不適用于微量蔗糖測定，在用于測定規(guī)格較小的疫苗等生物制品時存在局限性，因此目前應用較少。

3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）的原理是基于不同組分同時進入色譜柱后，在流動相及固定相之間的溶解度、吸附作用、滲透作用等均有一定區(qū)別，導致各個組分的移動速度產(chǎn)生區(qū)別，在移動一定距離后依次進入特定檢測器，從而實現(xiàn)不同組分的分離。可根據(jù)色譜峰的保留時間對化合物進行定性，根據(jù)峰面積對化合物實現(xiàn)定量。HPLC 在分離和分析方面具有高度的靈活性和可調(diào)性，除了調(diào)整流動相的相關參數(shù)外，選擇恰當?shù)纳V柱和檢測器同樣可以優(yōu)化分離效果和靈敏度，以滿足特定的分析要求，這使得HPLC 適用于各種復雜樣品和不同含量的蔗糖定量分析。下文將從目前蔗糖含量測定常用的檢測器和色譜柱方面對HPLC 進行介紹。

3.1 檢測器

HPLC 可根據(jù)待測物質(zhì)的理化性質(zhì)適配不同的檢測器。蔗糖本身不具有生色官能團，無法直接用紫外檢測器檢測。在目前可采用的各類檢測器中，應用最為廣泛的是示差折光檢測器（refractive index detector，RID）和蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light scattering detector，ELSD）。

3.1.1 示差折光檢測器 示差折光檢測器是通過連續(xù)監(jiān)測參比池和測量池中溶液的折射率之差來測定試樣濃度的檢測器。由于每種物質(zhì)都具有專屬的折射率，因而RID 屬于通用型檢測器，適用于蔗糖的檢測。雒麗紅等[11]采用HPLC-RID 法同時測定了乙型腦炎減毒活疫苗等4 種生物制品中的蔗糖和乳糖含量，該方法能將兩種糖完全分離，特異性較好，在0.50～20.00 mg·mL-1范圍內(nèi)，相關系數(shù)r2均達到0.999 9 以上，蔗糖的最低檢測限和定量限分別為0.01 mg·mL-1和0.10 mg·mL-1。強鵬俠等[12]采用HPLC-RID 法測定凍干b 型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗中的蔗糖含量，方法準確度、重現(xiàn)性及專屬性均較好，系統(tǒng)適用性驗證表明葡萄糖的存在對蔗糖出峰無干擾（圖1）。蔗糖在2.5～40.0 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好（r2＞0.999）。

圖1 HPLC-RID 法測定凍干b 型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗中蔗糖含量的典型色譜圖[12]

RID 對外界環(huán)境的變化十分敏感，溫度、壓力、濃度、流速、pH 值的變化都會引起待測物質(zhì)密度變化，從而導致折射率的改變，進而影響測定結(jié)果的準確性，因此不能使用梯度洗脫，可能導致分離時間較長，不利于分離一些成分復雜的樣品。同時，RID 的操作原理和結(jié)構(gòu)特點使其對流動相及溶劑的純度要求較高，并容易受到污染物的影響，故在耐用性方面存在一定不足，且相對其他檢測器而言靈敏度較低。

3.1.2 蒸發(fā)光散射檢測器 蒸發(fā)光散射檢測器也屬于通用型檢測器，同樣適用于沒有紫外吸收的組分測定，其工作原理包括霧化、流動相蒸發(fā)和激光束檢測三個過程。樣品從色譜柱后流出，進入霧化器形成微小液滴，與通入的氣體（通常是氮氣，有時也可用空氣）混勻，隨后經(jīng)過加熱的漂移管，蒸發(fā)除去流動相，使樣品組分形成氣溶膠。最后利用強光或激光照射氣溶膠，產(chǎn)生光散射，并通過光電二極管檢測散射光的強度。吳國真等[13]采用HPLC-ELSD 法同時測定天麻中活性成分天麻素及風味物質(zhì)果糖、葡萄糖和蔗糖的含量。該方法分析時間較短，能夠?qū)崿F(xiàn)各成分的基線分離，其中蔗糖在0.12～1.50 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關系良好（r2≥0.999），定量限和檢測限分別為0.45 μg 和0.15 μg。陳夢等[14]采用HPLC-ELSD法同時測定微膠囊中阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的含量，其中蔗糖在0.32～5.00 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關系良好（r2＞0.999），檢出限為0.02 mg·mL-1。在方法摸索過程中發(fā)現(xiàn)在流動相中添加適量的氨水能夠顯著提高分離度并改善峰形，因此選取1%氨水和乙腈作為流動相。由于等度模式難以將色譜柱上保留的成分完全洗脫，因此實驗中采用了梯度模式，實現(xiàn)了各成分的完全洗脫和有效分離（圖2）。

圖2 HPLC-ELSD 法測定微膠囊中6 種糖含量的典型色譜圖[14]

相較于RID，ELSD 靈敏度更高，對流動相系統(tǒng)及溫度變化不敏感，可以進行梯度洗脫，且不必嚴格控制環(huán)境溫度。由于流動相及其中的揮發(fā)性成分在蒸發(fā)器內(nèi)揮發(fā)氣化，因此消除了前溶劑峰的干擾，可以使基線更平穩(wěn)，分離時間更短，定量精度更高，不受溶劑成分影響。但蒸發(fā)光散射檢測器要求組成流動相的各組分必須具有揮發(fā)性，不能使用磷酸鹽等非揮發(fā)性物質(zhì)。

3.1.3 電噴霧檢測器 電噴霧檢測器（charged aerosol detector，CAD）是一種新型的通用型檢測器，可用于蔗糖含量檢測。與HPLC 聯(lián)用時，HPLC 的洗脫液在霧化器中霧化形成含有待測物的較小液滴，經(jīng)過蒸發(fā)管干燥后與帶電氮氣碰撞，使得待測物質(zhì)顆粒表面帶上正電荷，最后通過高靈敏度的靜電檢測計測量待測物質(zhì)的電荷量并形成電信號，該信號強度與待測物質(zhì)的質(zhì)量成正比。近年來，CAD 在藥物分析領域的應用越來越廣泛，國外藥典已收載多個采用CAD 的液相色譜分析方法[15]。孫亞靈等[16]建立了測定蔗糖含量的HPLC-CAD 方法，并對色譜柱、流動相和檢測器參數(shù)的優(yōu)化過程進行了討論。所建立的方法專屬性強，分離效果好，受環(huán)境影響?。▓D3），在質(zhì)量濃度為4.95～99.10 μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關系良好（r ＞0.999）。張素紅等[17]建立了利用HPLC-CAD 同時測定白茅根樣品中果糖、葡萄糖和蔗糖的方法，在建立的液相色譜條件下，上述3個糖類成分分離完全，其中蔗糖進樣量在5.274～31.650 μg 范圍內(nèi)線性良好（r=0.999 6），檢測下限為5.285 μg·mL-1。

圖3 HPLC-CAD 法測定蔗糖含量的系統(tǒng)適用性溶液（A）和空白溶劑（B）典型色譜圖[16]

CAD 在原理和特征上與ELSD 有相似之處，均無需嚴格控制環(huán)境溫度，但流動相不可使用非揮發(fā)性成分。CAD 對于高鹽濃度的樣品也有一定的限制，可能需要進行前處理或使用低鹽流動相。與ELSD 相比，CAD 具有更高的檢測靈敏度、更好的重復性和更寬的線性范圍，通?？蛇_3～4 個數(shù)量級。此外，CAD 的測定參數(shù)基本已在出廠時設定好，每次分析的條件相對固定，因此重現(xiàn)性較好[18]。

3.1.4 離子色譜-脈沖安培檢測器 離子色譜法（ion chromatography，IC）是高效液相色譜法的一種，應用于蔗糖含量測定時一般采用脈沖安培檢測器（pulsed amperometric detector，PAD），故本文將IC-PAD 法列入檢測器方面進行介紹。該方法的原理是根據(jù)不同的離子態(tài)物質(zhì)在離子交換柱上具有不同的遷移速率，將物質(zhì)進行分離，隨后離子態(tài)物質(zhì)在PAD 的工作電極表面發(fā)生氧化還原反應，引起電流變化而被自動檢測[19]。由于中性糖類化合物的酸離解常數(shù)在12～14 之間，在強堿淋洗液中可部分或全部解離成陰離子形式，從而在陰離子交換柱上被保留并分離[20]。陰離子態(tài)的蔗糖在脈沖安培檢測器的金電極上發(fā)生氧化反應而產(chǎn)生電流信號，因此可以采用離子色譜法對樣品中的蔗糖進行分離分析。

郭雅娟等[21]建立IC-PAD 法同時對甘露醇中的葡萄糖、甘露糖、蔗糖和果糖含量進行測定。該方法采用CarboPacPA20 分析柱（3.0mm×150mm）與CarboPac PA20 保護柱（3.0mm×30mm），以100mmol·L-1氫氧化鈉溶液作為淋洗液，進行梯度洗脫。結(jié)果表明，在0.025～2.500 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，各成分峰面積均分別與質(zhì)量濃度呈良好的線性關系，相關系數(shù)r 均大于0.999。

李曉東等[3]以口服輪狀病毒疫苗中蔗糖組分為分析對象，分別采用旋光法、HPLC-RID 法、IC-PAD法進行測定和對比（圖4）。其中HPLC-RID 法檢測蔗糖的最小檢出限為5 mg·L-1，而IC-PAD 法的最小檢出限為6 μg·L-1，最小定量限為30 μg·L-1。上述結(jié)果表明，在靈敏度方面，IC-PAD 法是HPLC-RID法的將近1000 倍。

圖4 HPLC-RID 法（A）和IC-PAD 法（B）測定疫苗制品中蔗糖含量的典型色譜圖[3]

IC-PAD 法的分析時間短、專屬性強、靈敏度高、樣品無需衍生化。但由于流動相為強堿介質(zhì)，可能造成樣品中某些組分降解，因此在選擇和優(yōu)化分析條件時需要特別注意，以避免可能的降解影響。此外，離子色譜儀價格相對昂貴，分析條件較為苛刻，對實驗室要求較高。

3.1.5 質(zhì)譜檢測器 質(zhì)譜檢測器（mass spectrometry detector，MS）具有高靈敏度和高專屬性的特點。樣品經(jīng)過色譜分離后，首先在接口中被電離，生成的氣相離子通過質(zhì)量分析器按m/z 的大小順序分離，并通過離子檢測器將離子信號轉(zhuǎn)化為電信號。MS常用的離子源主要為電噴霧離子源（electrospray ionization source，ESI）和大氣壓化學離子源（atmospheric pressure chemical ionization source，APCI）。目前在生物代謝研究中已較為廣泛地利用高效液相色譜或氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜檢測器測定生物樣品中的蔗糖，但在藥品及生物制品領域仍應用較少?？蓪⒃撍悸愤w移至藥品及生物制品領域的蔗糖含量測定，以滿足更高的靈敏度需求。

GEORGELIS N 等[22]采用ESI 負離子模式下的選擇離子監(jiān)測（selected ion monitoring，SIM），可同時快速測定植物組織中葡萄糖、果糖和蔗糖。經(jīng)驗證，該方法測定蔗糖的檢測限為0.05 ng，定量限為0.10 ng。MIAH MK 等[23]采用ESI 負離子模式下的多重反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）進行三重四級桿質(zhì)譜分析，可用于測定腦、血漿和血液中穩(wěn)定同位素修飾的[13C12]蔗糖。結(jié)果表明，蔗糖在1.0～200.0 ng·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性良好（r2≥0.99），方法定量限達到柱上注射0.5 pg。

質(zhì)譜檢測器在靈敏度和專屬性方面存在顯著優(yōu)勢，可以在不必實現(xiàn)色譜峰完全分離的情況下檢測待測物質(zhì)，大大縮短了分析時間，也降低了液相方法的開發(fā)難度。但在聯(lián)用質(zhì)譜檢測器時，需注意流動相中不能存在鹽和表面活性劑等非揮發(fā)性的物質(zhì)。此外，質(zhì)譜檢測器使用和維護的成本較高，對實驗室環(huán)境也存在一定要求。

3.2 色譜柱

色譜柱是HPLC 分離過程的核心部件，決定著分離的效果和效率。由于蔗糖極性較高，若不經(jīng)過衍生，在C18柱等普通反相色譜柱上難以獲得較好的保留效果，故應用較少。根據(jù)分離原理的不同，常用于蔗糖分析的色譜柱包括氨基柱、陰離子交換柱、分子排阻色譜柱、親水作用色譜柱等。

3.2.1 氨基柱 氨基柱全稱為氨丙基鍵合硅膠色譜柱，既可以用于正相，也可以用于反相，還可以作為弱陰離子交換柱應用于離子交換色譜。在分析碳水化合物時，氨基柱采用的是親水的反相分離模式，可用于分離同時含有單糖、二糖、三糖等不同聚合度的混合糖分子的樣品。氨基柱的價格相對較低，但其鍵合相氨丙基易水解，尤其是在反相色譜條件下，所以使用過程中需注意保護。酸性或高比例水相條件會加速氨丙基水解，因此氨基柱應盡量避免在酸性或者高水相的流動相中使用，建議流動相中水相比例不超過40%。當樣品顯酸性時，可通過調(diào)節(jié)流動相pH 來提高氨基柱柱效和延長使用壽命。

3.2.2 陰離子交換柱 用于糖類離子色譜分析的陰離子交換柱也稱糖分析柱、糖柱，常見的有戴安CarboPac PA 系列和瑞士萬通的Metrosep Carb 系列。一般采用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基質(zhì)，金屬離子對為官能團，二者通過磺酸基鍵合形成填料。糖分析柱的分離原理是基于配體交換反應，糖分子上每一個羥基都帶有一個非常弱的負電荷，而端基異構(gòu)碳上所帶的羥基可被去質(zhì)子化，從而帶上一個很強的負電荷。糖分子上的這些負電荷與樹脂表面上的金屬離子正電荷之間的相互作用使糖被保留，從而達到分離目的。

3.2.3 分子排阻色譜柱 分子排阻色譜柱的固定相采用多孔凝膠，也被稱為凝膠色譜柱、空間排阻色譜柱。其原理是根據(jù)凝膠孔隙大小與樣品分子尺寸之間的相對關系而對待測組分進行分離，尤其適用于分離生物制品中的大分子與蔗糖。張理火等[24]建立分子排阻色譜法測定豬凝血酶中的蔗糖含量，以親水硅膠高效體積排阻色譜柱PL aquagel-OH 20（7.5 mm×30 cm，5 μm）進行分離，采用示差折光檢測器測定蔗糖含量。豬凝血酶分子尺寸較大，較蔗糖早出峰，從而實現(xiàn)分離，專屬性較好。

3.2.4 親水作用色譜柱 親水作用色譜（hydrophilic-interaction chromatography，HILIC）柱類似于正相色譜柱的變體，填料為極性固定相，采用高有機相的含水流動相體系，有機相比例約占60%～95%。HILIC 在分析極性和親水性物質(zhì)方面具有極大的優(yōu)勢[25]。孫亞靈等[16]比較了3 種HILIC 色譜柱，最終選擇分離效果最佳的Waters XBridge Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）酰胺鍵合的雜化硅膠色譜柱測定蔗糖及其有關物質(zhì)的含量，解決了硅膠氨基柱存在的柱流失嚴重、方法不耐用等缺點。

總的來說，與經(jīng)典化學方法和旋光法相比，HPLC 具有較好的專屬性、準確度和靈敏度，也提升了檢驗的便捷性。HPLC 可以適配多種檢測器，以滿足不同的靈敏度需求。同時，通過選擇不同的色譜柱或調(diào)節(jié)流動相的組成、pH 值、溫度、流速等條件，可以實現(xiàn)對不同化合物的選擇性分離，因而能夠有效排除樣品中其他化合物對蔗糖測定的干擾。因此，目前HPLC 在蔗糖含量測定領域中的應用最為廣泛。

4 氣相色譜法

由于蔗糖極性較大，沸點高達697.1℃，因此不適宜直接采用氣相色譜法（gas chromatography，GC）分析，可通過衍生反應取代蔗糖的極性基團羥基以增加其揮發(fā)性，從而實現(xiàn)氣相色譜法檢測。用于碳水化合物衍生的試劑主要包括甲醚、乙酸鹽、三氟乙酸酯和硅醚化試劑等。其中，三甲基硅醚衍生產(chǎn)物具有良好的揮發(fā)性和穩(wěn)定性，非常適用于氣相色譜法分析，因而應用最廣[26]。衍生反應完成后，可根據(jù)待測樣品中的蔗糖含量選用氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）或質(zhì)譜檢測器，以滿足不同的靈敏度要求。FID 的電信號來源于有機物在氫火焰中燃燒產(chǎn)生的離子流，該信號與有機物的量成正比。目前藥品和生物制品領域較少采用氣相色譜法測定蔗糖含量，下文列舉本方法在煙草、植物中的部分應用，可為藥品和生物制品中的蔗糖含量測定提供一定參考。

張峻松等[27]建立了以三甲基氯硅烷為衍生化試劑，利用GC-FID 法定量分析煙草中葡萄糖、果糖和蔗糖含量的方法。該方法線性、重復性、加標回收率均良好。但相較而言，質(zhì)譜檢測器的靈敏度更高。GOMEZ-GONZALEZ S 等[28]建立GC-MS/MS 法對橄欖果實、葉和莖中的糖進行了定性定量分析。通過超聲輔助將待測組分提取至二氯甲烷-甲醇（2∶1）后，利用N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷進行衍生，最后采用質(zhì)譜Full Scan模式測定。本研究用該方法測定了50 種糖類組分，其中蔗糖的檢測限為0.015 μg·mL-1，定量限為0.050 μg·mL-1。

氣相色譜法測定糖類的主要優(yōu)點是能在相對短的分析時間內(nèi)獲得良好的分離度，適用于多種糖類組分的分離和基質(zhì)復雜的樣品。但該方法通常需要經(jīng)過衍生化反應，不僅耗時較長，而且衍生化的復雜操作也可能影響測定的準確度。

5 近紅外光譜法

近紅外光（near infrared，NIR）是介于可見光和中紅外光間的電磁波，波長通常介于780～2526nm范圍內(nèi)。由于物質(zhì)的含量與近紅外區(qū)內(nèi)多個不同的波長點吸收峰呈線性關系，結(jié)合化學計量學的多元校正技術(shù)，可利用待測組分結(jié)構(gòu)中含氫基團X-H（X=C、N、O）振動的合頻和倍頻吸收信息，對待測組分進行定性和定量分析。蔗糖結(jié)構(gòu)中含有在近紅外區(qū)域具有特征吸收的含氫基團，因此可利用近紅外光譜法快速定量分析。近紅外光譜法測定物質(zhì)含量的過程一般包括以下步驟：首先收集足夠數(shù)量的樣品，分為校正集和驗證集兩組，采用可靠的分析方法獲得所有樣品的待測組分含量數(shù)據(jù)；接著采集校正集樣品的圖譜，經(jīng)過圖譜預處理后，利用化學計量學方法提取數(shù)據(jù)并建立預測模型；隨后通過該模型獲得驗證集樣品的預測值，與實測值比較，確定模型可行；最后進行樣品分析。

郝遠等[29]采用近紅外光譜法結(jié)合化學計量學快速測定葉酸片中輔料蔗糖的含量。剔除異常樣本后，選擇樣品化學信息隨濃度變化顯著的5901～5862 cm-1和8327～8284 cm-1為建模區(qū)間建立偏最小二乘模型，隨后利用該模型預測5 個未知樣品，預測值和參考值誤差均小于5%，證明利用近紅外光譜定量測定葉酸片中蔗糖含量的方法可行。值得注意的是，選擇具有代表性的樣本是建模成功的前提和關鍵，因此用偏最小二乘法建立定量模型前，必須選擇合適的校正集和驗證集。目前常用的樣品集劃分方法有Ranksel 法、SPXY 法、Kennard-Stone法、Randsel 法、Duplex 法等。

近紅外光譜法具有快速、準確、高效、廉價等優(yōu)點[30]，且無破壞性，屬于無損檢測技術(shù)，可用于樣品快速分析和原位在線分析，特別適用于含蔗糖藥品及生物制品的生產(chǎn)控制和快速檢驗。但本方法前期需要收集大量樣品用以建立和驗證模型，且檢測準確度受建模所用樣品的數(shù)量及代表性影響較大。

6 毛細管電泳法

毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）是一種由經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的分析方法。其基本原理是以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細管為分離通道，根據(jù)樣品中各組分在和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離。CE 有多種分離模式，其中毛細管區(qū)帶電泳法最為基礎，也是糖類分析中應用最廣泛的一種模式。由于蔗糖結(jié)構(gòu)本身不含有共軛基團，因此無法直接采用紫外檢測，目前常用的分析方法包括將毛細管電泳聯(lián)用安培檢測器、質(zhì)譜檢測器等，或采用間接紫外檢測法。因安培檢測器和質(zhì)譜檢測器前文均有提及，故此處主要介紹紫外間接檢測法。

蔗糖本身不帶電荷，在電泳條件下不具備遷移能力，但可利用強堿性緩沖液（pH ＞11）或硼酸鹽緩沖液使蔗糖解離[31]，使其能夠在電泳條件下向陽極遷移。同時由于蔗糖無法用紫外直接定量，可將蔗糖置換為具有強紫外吸收的背景電解質(zhì)溶液從而獲得負峰，常見的背景電解質(zhì)如2，6-吡啶二羧酸、2，6-二甲基苯酚[32]等。通常需要在背景電解質(zhì)溶液中加入十六烷基三甲基溴化銨，使電滲流方向向陽極反轉(zhuǎn)，縮短分析時間。吳克等[33]建立了毛細管電泳-紫外間接檢測法，用于定量測定四價輪狀病毒減毒活疫苗原液中的蔗糖含量。背景電解質(zhì)為含0.3 mmol·L-1CTAB 的60 mmol·L-1PDC 溶液，分離電壓為-12×103V，壓力進樣50 mbar×6 s，柱溫25℃，檢測波長和參比波長分別為350 nm 和275 nm。該方法專屬性良好（圖5），蔗糖的遷移時間約為18.0 min，在2.0～10.0 mg·mL-1范圍內(nèi)標準曲線r=0.999 9，檢測限為0.2 mg·mL-1，定量限為1.0 mg·mL-1。

圖5 CE 法測定四價輪狀病毒減毒活疫苗原液中蔗糖含量的典型色譜圖[33]

毛細管電泳法采用毛細管作為分離載體，相較高效液相色譜柱而言分離效能更高，且成本低廉，可以在發(fā)生吸附污染后舍棄，尤其適用于分析病毒原液等成分復雜、易污染色譜柱的樣品。

7 小 結(jié)

本文對目前在藥品及生物制品領域常用的各種蔗糖含量測定方法進行了歸納。綜上所述，當待測樣品中蔗糖含量相對較高，且不存在其他干擾物質(zhì)時，可采用基于氧化還原反應的經(jīng)典化學方法或旋光法測定。當待測樣品中蔗糖含量相對較低或存在其他干擾物質(zhì)時，可采用HPLC 法、GC 法或CE法，通過選用恰當?shù)纳V柱和檢測器以達到檢測目的。其中，HPLC 法應用最為廣泛，各類常用的檢測器按照靈敏度由低到高排序一般為：示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電噴霧檢測器、離子色譜-脈沖安培檢測器、質(zhì)譜檢測器，其中質(zhì)譜檢測器可以達到10-12級靈敏度；GC 法通常需要柱前衍生化，操作相對較為繁瑣；CE 法適用于分析成分復雜、易污染色譜柱的生物制品。此外，針對大批量樣品中蔗糖的快速定量分析需求，可考慮采用近紅外光譜法結(jié)合化學計量學，通過建立適當模型來預測未知樣品中的蔗糖含量。