郭 原，朱米群，錢一帆，溫明皓，陸宇婷，宋 敏，杭太俊*

1南京中科藥業(yè)有限公司，南京 211102；2中國(guó)藥科大學(xué) 藥物分析系，南京 210009

靈芝孢子粉由多孔菌科真菌赤芝[Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.]的干燥成熟孢子制得[1]。靈芝孢子油（ganoderma lucidum spore oil，GLSO）是靈芝孢子破壁后，經(jīng)超臨界CO2流體萃取得到的脂肪油，GLSO 主要以甘油三酯（triglycerides，TGs）形式存在，同時(shí)還含有少量游離脂肪酸和類固醇酯[2，3]，具有抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抗癌等功效[4-7]。其中，TGs 主要包括1，2-二亞油酸-3-油酸甘油酯（1，2-linolein-3-olein，LLO）、1，2-二亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯（1，2-linolein-3-palmitin，LLP）、1，2-二油酸-3-亞油酸甘油酯（1，2-dioleoyl-3-linolein，OOL）、三油酸甘油酯（triolein，OOO）、1，2-二油酸-3-棕櫚酸甘油酯（1，2-olein-3-palmitin，OOP）、1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯（1，2-olein-3-stearin，OOS）、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯（1-palmitin-2-olein-3-linolein，POL）、1-棕櫚酸-2-油酸-3-硬脂酸甘油酯（1-palmitin-2-olein-3-stearin，POS）等[8]，脂肪酸主要有油酸、亞油酸、棕櫚酸[9]等。靈芝孢子油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)暫未收錄于各國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)中。《浙江省靈芝孢子粉炮制規(guī)范》[1]以乙腈-異丙醇（51∶49）為流動(dòng)相，蒸發(fā)光散射檢測(cè)測(cè)定靈芝孢子粉中TGs 的液相指紋圖譜；有研究[10-12]以乙腈-異丙醇為流動(dòng)相（不同比例）等度洗脫，分離靈芝孢子油中的各類TGs 成分。但這些方法所需分析時(shí)間均較長(zhǎng)（約60 min），樣品分離效能低。本研究利用超高效液相色譜法（UPLC），以乙腈-無水乙醇-甲基叔丁基醚為流動(dòng)相等度洗脫，顯著提高了HPLC-ELSD檢測(cè)靈芝孢子油中甘油三酯類成分含量的效率。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

靈芝孢子油軟膠囊（南京中科藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20220418、20220802、20220902、20220928、20221008、20221018、20221125）；對(duì)照品：LLO（批號(hào)：V067∶12）、LLP（批號(hào)：X867∶12）、OOL（批號(hào)：Y094∶2）、OOO（批號(hào)：Y479∶7）、OOP（批號(hào)：Y103∶2）、OOS（批號(hào)：X510∶9）、POL（批號(hào)：Y595∶9）、POS（批號(hào)：Y578∶9）均購(gòu)自瑞典Larodan AB 公司（純度＞99%）；乙腈、無水乙醇、甲基叔丁基醚均為HPLC 級(jí)（德國(guó)Merck 公司）。

1.2 儀器

Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色譜柱、1260 Infinity 型高效液相儀、1260 Infinity 型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)Agilent 公司）、BT25S 分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）等。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

取各甘油三酯對(duì)照品適量，精密稱定，分別用流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含2.5 mg的溶液，作為各對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別用流動(dòng)相定量稀釋制成每1 mL 含LLO、LLP、OOS、POS 約20 μg，OOL、POL 約50 μg，OOO、OOP 約100 μg 的各對(duì)照品溶液。

分別精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量置同一量瓶中，加流動(dòng)相定量稀釋制成每1 mL 中含LLP、POS、LLO、OOS 約50 μg，OOL、POL 約120 μg，OOO、OOP 約250 μg 的混合溶液，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加流動(dòng)相定量稀釋制成每1 mL 含LLP、POS、LLO、OOS 約20 μg，OOL、POL 約50 μg，OOO、OOP 約100 μg 的混合對(duì)照品溶液。

取本品內(nèi)容物適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含600 μg 的溶液，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 高效液相色譜條件

以Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm ×4.6 mm，2.7 μm）為色譜柱；以乙腈-無水乙醇-甲基叔丁基醚（45∶45∶10）為流動(dòng)相，流速為0.8 mL·min-1，柱溫為25℃，進(jìn)樣量10 μL；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)為霧化器/漂移管溫度70℃，氮?dú)饬魉?.20 L·min-1。

2.3 專屬性與色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.1”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液及供試品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果（圖1）表明以O(shè)OO 為對(duì)照，LLO、LLP、OOL、POL、OOO、OOP、OOS、POS 的相對(duì)保留時(shí)間（relative retention time，RRT）分別約為0.61、0.64、0.78、0.81、1.00、1.04、1.34、1.40，峰形對(duì)稱性和分離度良好，空白溶劑對(duì)各甘油三酯測(cè)定無干擾，且各甘油三酯分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按OOO 計(jì)算不低于3000，該方法專屬性和系統(tǒng)適用性良好。

圖1 空白溶劑（A）、定量限溶液（B）、混合對(duì)照品溶液（C）及供試品溶液（D）中甘油三酯的HPLC-ELSD 色譜圖

2.4 線性和范圍

分別精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量置同一量瓶中，加流動(dòng)相定量稀釋制成每1 mL 中約含各甘油三酯4、10、20、50、100、200 μg 的系列混合對(duì)照溶液。精密量取上述溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以各甘油三酯的峰面積對(duì)數(shù)（lgA）為Y，對(duì)其質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)（lgC，μg·mL-1）為X 進(jìn)行線性回歸。結(jié)果（表1）表明，其蒸發(fā)光散射響應(yīng)均在約4.0～200 μg·mL-1濃度范圍呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r ＞0.999）。不同組分色譜響應(yīng)線性回歸分析的斜率均約為1.5，因此，在建立的色譜條件下，各組分的響應(yīng)因子相當(dāng)。在對(duì)照品不齊全的情況下，可以采用主成分為對(duì)照，外標(biāo)峰面積法直接估算各組分的含量。

表1 8 種甘油三酯的校正曲線

2.5 定量限

以各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度下限（40 μg·mL-1）為其定量限，實(shí)驗(yàn)測(cè)得LLO、LLP、OOL、POL、OOO、OOP、OOS、POS 的濃度分別在約為3.79、4.24、4.27、4.59、4.09、4.36、4.34、3.73 μg·mL-1的情況下，各組分的色譜響應(yīng)信噪比均大于10（圖1）。

2.6 溶液穩(wěn)定性

取供試品溶液和50 μg·mL-1質(zhì)量濃度水平混合對(duì)照溶液，在室溫下分別放置約30 h，于放置不同時(shí)間點(diǎn)精密量取上述溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以“2.4”項(xiàng)下各曲線標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算各甘油三酯濃度。結(jié)果不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得溶液中各甘油三酯的濃度結(jié)果一致（RSD 均小于2.0%），表明該供試品和對(duì)照品溶液在室溫放置30 h 內(nèi)均穩(wěn)定（表2～3）。

表2 甘油三酯混合對(duì)照品溶液穩(wěn)定性（μg·mL-1）

表3 靈芝孢子油供試品溶液穩(wěn)定性（μg·mL-1）

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

本底溶液：取本品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含300 μg 的溶液，過濾，取續(xù)濾液。

加樣回收率試驗(yàn)溶液：取本品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋成儲(chǔ)備液，精密量取適量，置10 mL 量瓶中，分別精密加入“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0、2.0 或3.0 mL，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為低（50%）、中（100%）、高（150%）濃度的溶液。低、高濃度各3 份，中濃度6 份。

精密量取上述溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各甘油三酯的濃度，扣除樣品中的本底濃度，即得各甘油三酯對(duì)照品濃度，與加入濃度相比分別計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明，LLO、LLP、OOL、POL、OOO、OOP、OOS、POS 的平均加樣回收率均在96.63%～107.53%，RSD 均小于5.0%。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》（2020 年版）通則9101[13]中回收率限度的規(guī)定，本品屬于基質(zhì)復(fù)雜及多成分范疇，同時(shí)采用了檢測(cè)響應(yīng)靈敏度相對(duì)較低的蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，回收率限度可適當(dāng)放寬，故本法準(zhǔn)確度良好。

2.8 進(jìn)樣精密度

取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，照“2.2”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各成分保留時(shí)間的RSD 均小于1.0%；濃度的RSD 分別為0.55%、1.71%、0.52%、0.33%、0.48%、0.25%、0.55%和1.09%，均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.9 重復(fù)性

取“2.7”項(xiàng)下中濃度（100%）試驗(yàn)溶液6 份，照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各甘油三酯的濃度，扣除樣品中的本底濃度，即得各甘油三酯對(duì)照品濃度，與加入濃度相比分別計(jì)算加樣回收率。

結(jié)果表明，各甘油三酯的平均加樣回收率為96.32%～106.01%（RSD ＜2.0%）范圍。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》（2020 年版）通則9101[13]中精密度可接受范圍的規(guī)定，本品屬于基質(zhì)復(fù)雜及多成分范疇，同時(shí)采用了檢測(cè)響應(yīng)靈敏度相對(duì)較低的ELSD檢測(cè)器，重復(fù)性RSD 范圍可適當(dāng)放寬。故本法重復(fù)性良好（表4）。

表4 靈芝孢子油中甘油三酯重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品測(cè)定

精密量取“2.1”項(xiàng)下供試品溶液及“2.5”項(xiàng)下系列混合對(duì)照溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以各甘油三酯的峰面積對(duì)數(shù)（lgA）為Y，對(duì)其質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)（lgC，μg·mL-1）為X 進(jìn)行線性回歸，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各甘油三酯的含量。

結(jié)果（表5）表明，不同批次的靈芝孢子油中的甘油三酯總量相對(duì)均一，但各甘油三酯成分的含量，由于受藥材的產(chǎn)地或采收時(shí)期等因素影響而有所差異，其中相對(duì)含量較低的OOS（RSD 8.23%）和LLP（RSD 9.95%）含量波動(dòng)略顯著。

表5 靈芝孢子油中甘油三酯含量測(cè)定結(jié)果（mg·g-1）

3 討論

本研究在非水反相色譜（nonaqueous reverse phase chromatography，NARP）流動(dòng)相體系中加入甲基叔丁基醚，利用其強(qiáng)洗脫性，顯著加快樣品洗脫速度，同時(shí)以Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×4.6 mm，2.7 μm)為色譜柱，相比于常規(guī)ODS 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）填料粒徑更小，有利于降低渦流擴(kuò)散及改變傳質(zhì)路徑，提高柱效，并有效地縮短分析時(shí)間和減少溶劑消耗，更加綠色環(huán)保[14，15]。

本研究建立了一種靈芝孢子油中8 個(gè)甘油三酯類成分含量的HPLC-ELSD 法，具有專屬性好、分析洗脫時(shí)間適宜、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，滿足了靈芝孢子油中甘油三酯類成分質(zhì)量控制的要求，也可適用于其他植物油脂中甘油三酯的測(cè)定。

在建立的ELSD 為檢測(cè)器的色譜條件下，不同甘油三酯類成分的響應(yīng)因子相當(dāng)。在對(duì)照品不齊全的情況下，可以采用主成分為對(duì)照的外標(biāo)峰面積法直接估算各組分的含量。