喻柯瑤，史瀟璐，王博寒，張曉娜，湯玲玲，孫憲泓，劉 麗，徐艷秋

1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京 210029；2南京市江寧中醫(yī)院，南京 210000

氣道黏液高分泌導(dǎo)致的氣道阻塞是哮喘發(fā)病過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是導(dǎo)致哮喘患者發(fā)病和死亡的重要因素[1]。因此，靶向治療氣道黏液高分泌成為減少哮喘發(fā)作頻率和延緩其進(jìn)展的重要途徑。氣道黏液是由水、糖類、脂質(zhì)、黏蛋白等所組成的混合物，其中黏蛋白是氣道黏液最主要的成分，黏性蛋白5AC（mucin 5AC，MUC5AC）是氣道黏液中最主要的黏蛋白[2，3]。有研究表明[4]，MUC5AC 黏蛋白基因與哮喘的關(guān)系最為密切，在氣道炎癥刺激的情況下，MUC5AC基因表達(dá)上調(diào)，哮喘患者氣道黏蛋白MUC5AC 分泌過度，痰液阻塞氣道，引起患者氣道通氣功能障礙、纖毛清除功能下降、炎癥加重、氣道重塑等，是推進(jìn)氣道炎癥持續(xù)進(jìn)展、哮喘反復(fù)發(fā)作和遷延不愈的重要病理階段。相關(guān)研究表明[5]，白細(xì)胞介素-13（interleukin 13，IL-13）通過激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）形成的IL-13-STAT6-MUC5AC 黏液分泌通路，與哮喘氣道黏液高分泌狀態(tài)密切相關(guān)。

祛風(fēng)宣痹方（平哮合劑）是江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，臨床實踐證明其能夠有效治療和控制哮喘的發(fā)作[6]。前期研究表明[7]，祛風(fēng)宣痹方能夠改善哮喘小鼠病理反應(yīng)，減少哮喘小鼠的肺組織嗜酸性粒細(xì)胞、炎癥細(xì)胞浸潤，下調(diào)炎癥因子IL-4、IL-13、IL-17 及IgE 水平，調(diào)節(jié)T 細(xì)胞平衡等。本實驗通過建立以卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型和IL-13 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞黏液分泌病理模型來探討祛風(fēng)宣痹方對氣道黏液分泌及IL-13/STAT6信號通路的影響。

1 實驗材料

1.1 動物與細(xì)胞

清潔級雌性Balb/c 小鼠24 只，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（上海）2017-0005，實驗動物使用許可證號為SYXK（蘇）2017-0069，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院SPF 級動物實驗室，室溫20～24℃，相對濕度45%～50%。A549 細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.2 倫理審查

本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會審批通過，批件編號為2021 DW-07-02。

1.3 試驗藥物

祛風(fēng)宣痹方（QFXBF）：射干10 g，炙麻黃6 g，制僵蠶10 g，瓜蔞10 g，薤白10 g，海風(fēng)藤20 g，白芍15 g，炙甘草5 g，葶藶子10 g，蛤殼20 g，桃仁10 g，苦杏仁10 g，地龍10 g，黃芩10 g，蛇床子10 g。飲片購于江蘇省中醫(yī)院。所有飲片分次煎制、濃縮至原藥材濃度為1.66 g·mL-1煎劑，4℃保存?zhèn)溆?。祛風(fēng)宣痹方凍干粉由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代制劑中心制作，每克凍干粉相當(dāng)于原藥材5.32 g，使用時以RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度用于細(xì)胞實驗。

1.4 主要試劑與儀器

卵清蛋白（美國Sigma 公司）；氫氧化鋁凝膠（中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司）；IL-13（派普泰克生物科技有限公司）；RMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（德國BI 公司）；青霉素-鏈霉素溶液（美國ThermoFisher Scientific 公司）；IL-13 ELISA 檢測試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）；STAT6 抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；p-STAT6 抗體、β-actin 抗體（美國Affinity Biosciences 公司）；MUC5AC 抗體（美國Abcam 公司）；兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；MTT（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；熒光二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

HERA cell 1501 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國ThermoFisher Scientific 公司）；ELX -800 酶標(biāo)儀、041BR142554 蛋白電泳儀、L520 CHEMIDOC XRS+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Bad 公司）；Heraeus Fresco21 離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；CKX41 倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）；ECLIPSE Ts2R-FL 熒光倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）。

2 實驗方法

2.1 動物造模、分組及給藥

24 只小鼠隨機(jī)分為對照組、哮喘組和祛風(fēng)宣痹方組，每組8 只。在第0 天和第14 天，哮喘組、祛風(fēng)宣痹方組的小鼠通過腹腔內(nèi)注射200 μL 濃度為0.5 mg·mL-1的OVA 和氫氧化鋁混合液致敏。在第14、25、26 和27 天，小鼠鼻內(nèi)給藥OVA 溶液50 μL（2 mg·mL-1），對照組使用同等體積生理鹽水。小鼠在滴鼻前呼吸平穩(wěn)，滴鼻過程中出現(xiàn)撓鼻、咳嗽、煩躁、呼吸加快等表現(xiàn)，激發(fā)后2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)增多表明造模成功。第14 天至第27 天之間，祛風(fēng)宣痹方組小鼠每天灌胃給予祛風(fēng)宣痹方一次（25 g·kg-1）[7]，對照組和哮喘組小鼠接受生理鹽水0.2 mL。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及藥物干預(yù)

A549 細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640、100 mg·L-1鏈霉素和100 mg·L-1青霉素的培養(yǎng)基養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時用胰蛋白酶消化進(jìn)行實驗。

將A549 細(xì)胞以5000 個/孔接種于96 孔板，予不同濃度祛風(fēng)宣痹方（37.5、75、150、300、600 μg·mL-1）干預(yù)24 h 后，加入MTT（5 mg·mL-1）溶液10 μL，培養(yǎng)箱孵育4 h，棄去MTT 液，每孔加入DMSO 150 μL，避光低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀測定每孔在490 nm 處的吸光值（A），按公式（A實驗組-A對照組）/A對照組×100%計算細(xì)胞活力，篩選祛風(fēng)宣痹方最佳作用濃度。

將A549 細(xì)胞以5000 個/孔接種于96 孔板，分為對照組（完全培養(yǎng)基）、IL-13 組（IL-13 終濃度50 ng·mL-1）、IL-13+祛風(fēng)宣痹方組（IL-13 終濃度50 ng·mL-1，祛風(fēng)宣痹方終濃度300 μg·mL-1）和祛風(fēng)宣痹方組（祛風(fēng)宣痹方終濃度300 μg·mL-1），分別處理24 h。

2.3 標(biāo)本采集

實驗結(jié)束后，稱量小鼠體質(zhì)量，麻醉后摘眼球取血，用于檢測血清中IL-13 水平。剪開胸腔，分離氣管，將肺組織置于4%中性甲醛溶液固定后進(jìn)行HE、PAS 染色和MUC5AC、p-STAT6 免疫組化實驗。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 肺組織病理學(xué)觀察 肺組織經(jīng)固定、脫水、透明、石蠟包埋后切片。

HE 染色：切片常規(guī)脫蠟、水化后蘇木素染核，1%鹽酸酒精顯藍(lán)，酒精脫水，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，酒精脫水、二甲苯透明，自然風(fēng)干，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

糖原PAS 染色：上述切片常規(guī)脫蠟至水，阿利新藍(lán)染色液染色，蒸餾水水洗，過碘酸溶液氧化，Schiff 試劑浸染，蘇木素染細(xì)胞核，酸性分化液分化，滴入Scott 藍(lán)化液反藍(lán)，水洗后酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片、固定，光學(xué)顯微鏡下觀察氣道黏液分泌情況。

2.4.2 肺組織MUC5AC、p-STAT6 免疫組化染色石蠟包埋塊，切片，脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液沖洗，H2O2滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水、PBS 清洗，山羊血清封閉，加一抗，4℃孵育過夜。清洗后孵育二抗，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水，透明，中性樹脂封片，應(yīng)用Image J 軟件計算MUC5AC、p-STAT6 染色陽性結(jié)果平均光密度值。

2.4.3 ELISA 檢測 收集小鼠外周血，于4℃以4000 r·min-1離心10 min 取血清。參照IL-13 檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測，酶標(biāo)儀波長450 nm 測量吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算小鼠血清中IL-13 含量。

2.4.4 免疫熒光檢測 96 孔板培養(yǎng)24 h 的A549細(xì)胞，4%免疫熒光固定液30 min，10%的山羊血清封閉1 h，加入抗MUC5AC 抗體（1∶100）、抗p-STAT6 抗體（1∶100）4℃過夜。0.3%Triton 洗滌，二抗孵育1 h，DAPI 染色5 min，加入30 μL 抗熒光淬滅劑后熒光顯微鏡下拍照。用Image J 軟件分割通道得到8 bit 的黑白圖像，在一定的閾值下，分析其熒光強(qiáng)度（以灰度值代替）和面積。平均熒光強(qiáng)度即平均灰度值=積分灰度值/面積。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，GraphPad 9.0 軟件進(jìn)行科研繪圖。免疫組化及免疫熒光計量數(shù)據(jù)以Image J 計算并導(dǎo)出。所有數(shù)據(jù)以（）表示，組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠肺組織病理改變

各組小鼠肺組織病理改變結(jié)果（圖1）顯示，對照組小鼠肺組織、氣道黏膜上皮及肺泡結(jié)構(gòu)相對完整。與對照組比較，哮喘組小鼠支氣管黏膜部分損失，氣道管壁周圍可見較多炎癥細(xì)胞浸潤；與哮喘組比較，祛風(fēng)宣痹方組小鼠支氣管管壁形態(tài)趨于正常，支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤減少。

圖1 對照組（A）、哮喘組（B）及祛風(fēng)宣痹方組（C）小鼠肺臟組織HE 染色圖（×200）

3.2 各組小鼠氣道黏液物質(zhì)的變化

PAS 染色可使多糖類及糖蛋白如黏蛋白MUC5AC 呈紫紅色[8]，黏蛋白MUC5AC 陽性呈紫紅色區(qū)。本實驗中，對照組小鼠氣道組織中幾未見紫紅色區(qū)域；哮喘組小鼠較多處區(qū)域呈現(xiàn)出紫紅色，說明氣道黏液分泌增多；祛風(fēng)宣痹方組氣道黏液物質(zhì)分泌可見明顯減少（圖2）。

圖2 對照組（A）、哮喘組（B）及祛風(fēng)宣痹方組（C）小鼠肺臟組織PAS 染色圖（×200）

3.3 各組小鼠肺組織中MUC5AC、p-STAT6 表達(dá)情況

鏡下觀察MUC5AC、p-STAT6 蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞可呈黃色或棕黃色。結(jié)果顯示，正常組小鼠肺組織中幾未見MUC5AC 蛋白表達(dá)；哮喘組小鼠肺組織中可見MUC5AC 較高表達(dá)（P ＜0.05），祛風(fēng)宣痹方組小鼠肺組織中棕黃色陽性表達(dá)較哮喘組明顯減少（P ＜0.05）。與對照組相比，哮喘組小鼠肺組織中p-STAT6 蛋白陽性顆粒明顯增多（P ＜0.01）；與哮喘組相比，祛風(fēng)宣痹方組p-STAT6 蛋白陽性顆粒則明顯減少（P ＜0.01）。見圖3、表1。

表1 各組小鼠中MUC5AC、p-STAT6 蛋白免疫組化平均光密度值表達(dá)結(jié)果（，n=3）

表1 各組小鼠中MUC5AC、p-STAT6 蛋白免疫組化平均光密度值表達(dá)結(jié)果（，n=3）

注：與OVA組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

圖3 對照組（A）、哮喘組（B）及祛風(fēng)宣痹方組（C）小鼠中MUC5AC、p-STAT6 蛋白表達(dá)（×200）

3.4 各組小鼠血清中IL-13 的表達(dá)情況

與對照組相比，哮喘組小鼠血清中IL-13 含量明顯增高（P ＜0.01）；與哮喘組相比，祛風(fēng)宣痹方組IL-13 含量顯著減少（P ＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠血清中IL-13 含量（ng·L-1，，n=4）

表2 各組小鼠血清中IL-13 含量（ng·L-1，，n=4）

注：與OVA組比較，**P ＜0.01。

3.5 不同濃度祛風(fēng)宣痹方對A549 細(xì)胞活力的影響

結(jié)果顯示，與正常對照組比較，37.5、75、150、300 μg·mL-1[6]祛風(fēng)宣痹方對細(xì)胞活力無顯著影響（P ＞0.05），而600 μg·mL-1祛風(fēng)宣痹方則能降低A549細(xì)胞活力（P ＜0.05），提示過高濃度祛風(fēng)宣痹方可能具有一定程度細(xì)胞毒性，因此選擇300 μg·mL-1進(jìn)行后續(xù)實驗。見表3。

表3 不同濃度祛風(fēng)宣痹方對A549 細(xì)胞活力的影響（，n=6）

表3 不同濃度祛風(fēng)宣痹方對A549 細(xì)胞活力的影響（，n=6）

注：與對照組比較，**P ＜0.01。

表4 各組細(xì)胞中MUC5AC、p-STAT6 蛋白平均熒光強(qiáng)度變化（，n=3）

表4 各組細(xì)胞中MUC5AC、p-STAT6 蛋白平均熒光強(qiáng)度變化（，n=3）

注：與IL-13組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

3.6 A549 細(xì)胞中MUC5AC、p-STAT6 表達(dá)情況

在免疫熒光染色中，A549 細(xì)胞胞漿中MUC5AC蛋白陽性呈綠色熒光。對照組細(xì)胞內(nèi)MUC5AC 有少量陽性表達(dá)；IL-13 組MUC5AC 表達(dá)量明顯增多，且多于正常組及IL-13+祛風(fēng)宣痹方組（P ＜0.05）。

A549 細(xì)胞核內(nèi)p-STAT6 蛋白表達(dá)呈綠色熒光。與對照組比較，IL-13 組綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P ＜0.01）；與IL-13 組比較，IL-13+祛風(fēng)宣痹方組細(xì)胞核內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度則有較為明顯的降低（P ＜0.05）。見圖4。

圖4 對照組（A）、IL-13 組（B）、IL-13+祛風(fēng)宣痹方組（C）及祛風(fēng)宣痹方組（D）A549 細(xì)胞MUC5AC、p-STAT6 蛋白表達(dá)（×200）

4 討論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，哮喘屬于“哮證、喘證”的范疇，其基本病機(jī)為“痰伏于內(nèi)”。氣道黏液高分泌狀態(tài)與中醫(yī)學(xué)的“伏痰”關(guān)系密切，二者有著共同的物質(zhì)基礎(chǔ)“痰”。祛風(fēng)宣痹方具有祛風(fēng)宣痹、化痰通陽、肅肺平喘之功效，臨床療效表明，祛風(fēng)宣痹方可有效緩解患者咳嗽痰鳴、胸悶等“伏痰于內(nèi)”相關(guān)臨床表現(xiàn)[9]。因此，祛風(fēng)宣痹方可能通過改善氣道黏液高分泌減輕哮喘發(fā)作。在本研究中，相較于哮喘組小鼠，祛風(fēng)宣痹方組小鼠氣道黏液分泌明顯減輕，MUC5AC 蛋白表達(dá)也明顯降低；同時，祛風(fēng)宣痹方能減輕A549 細(xì)胞MUC5AC 蛋白表達(dá)，證明祛風(fēng)宣痹方可以通過抑制MUC5AC 的表達(dá)從而減少哮喘氣道黏液分泌。

IL-13 是一種主要由活化的Th2 細(xì)胞分泌免疫的調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，被認(rèn)為是哮喘發(fā)病過程中的關(guān)鍵介質(zhì)[10]。相關(guān)文獻(xiàn)指出[11，12]，IL-13 在誘導(dǎo)哮喘包括氣道高反應(yīng)性、黏液分泌增加等的病理特征中起重要作用。KIM S 等[13]的實驗表明，IL-13 可增加A549細(xì)胞中STAT6 的磷酸化以及MUC5AC mRNA 和蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)黏液分泌。

STAT6 是STAT 蛋白家族成員之一，STAT 蛋白可以被激活后的Janus 激酶（JAKS）磷酸化形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[14]。JAK/STAT 途徑與哮喘的發(fā)生密切相關(guān)，而IL-13是STAT6 信號通路激活的重要信號因子[15]。IL-13可通過與IL-13Ra 亞基結(jié)合，形成IL-13Ra/IL4Ra受體復(fù)合物，激活JAK/STAT6 信號通路后引起STAT6 的磷酸化[16-18]。p-STAT6 進(jìn)入細(xì)胞核誘導(dǎo)MUC5AC 基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)，導(dǎo)致哮喘的氣道黏液分泌增加。本實驗發(fā)現(xiàn)，祛風(fēng)宣痹方能降低哮喘小鼠外周血中IL-13 水平及其肺組織中的p-STAT6 蛋白量，這與細(xì)胞實驗中p-STAT6 表達(dá)趨勢相一致。這表明祛風(fēng)宣痹方可能是通過抑制IL-13/STAT6 通路的激活來減輕哮喘黏液過度分泌，從而緩解哮喘發(fā)作。

綜上所述，祛風(fēng)宣痹方能通過抑制哮喘黏液高分泌，從而治療哮喘。其機(jī)制可能與抑制IL-13/STAT6 通路的表達(dá)相關(guān)，進(jìn)一步的機(jī)制探索還需課題組展開后續(xù)實驗，以期為臨床提供更多實驗依據(jù)。