陳 鵬，馬茗熙，黃錦鑫，熊 非，汪 豪**

1中國藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，南京 210009；2東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，南京 210000

癌癥已成為全球主要死因之一，原發(fā)性肝癌是第六大常見癌癥和第三大致死性癌癥[1]。對于中晚期肝癌，全身性治療手段如化療、放療都存在較強(qiáng)的副作用，殺傷腫瘤細(xì)胞的同時對全身正常組織、器官和免疫系統(tǒng)造成了巨大損傷。由于肝癌組織的血供特性[2]，經(jīng)導(dǎo)管動脈栓塞術(shù)（transcatheter arterial embolization，TAE）臨床可用于中晚期肝癌治療，通過微導(dǎo)管將栓塞劑輸送至肝動脈及分支動脈，堵塞血管，切斷營養(yǎng)供給而殺死癌細(xì)胞[3，4]。經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）在TAE 的基礎(chǔ)上，將化療藥物與栓塞劑結(jié)合使用，二者的雙重作用可使腫瘤組織在短時間內(nèi)壞死萎縮，而對正常組織或器官造成的影響較小[5]。

與傳統(tǒng)TACE 相比，載藥微球TACE[drug-eluting bead（DEB）-TACE] 可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的藥物緩控釋，全身毒副作用較小[6]，具有更好的臨床應(yīng)用前景。目前，市面上的DEB 多以不可降解的聚乙烯醇等材料合成[7]，如DC Bead、HepaSphere 和國產(chǎn)的CalliSphere 等[5，8]。但此類微球的永久性栓塞不僅阻礙了后續(xù)治療[7]，且存在藥物無法完全釋放等缺陷[9]。

殼聚糖、海藻酸鈉等天然高分子材料因其生物可降解性而被廣泛用于制備可降解栓塞微球[10]。透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是一種陰離子線性雜多糖，單糖組成為D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基-D-葡萄糖單體[11]。HA 廣泛存在于人體器官和組織，具有良好的生物相容性、生物降解性、無免疫原性等特點(diǎn)，在皮膚再生、藥物遞送、組織工程等領(lǐng)域應(yīng)用較廣[12]。HA 分子中的羧基可通過離子吸附負(fù)載帶正電荷的藥物，實(shí)現(xiàn)微球材料的載藥性能[13]。

本研究以HA 為主要基質(zhì)，制備并表征了一種可降解、可載藥的栓塞微球，預(yù)期用于TACE，為臨床提供一種可生物降解的化療栓塞微球新方案。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

RW20 Digital 機(jī)械攪拌器，RCT basic 磁力攪拌器（德國艾卡公司）；CP214 電子分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；E200 光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）；Ultra Plus 掃描電子顯微鏡（德國蔡司公司）；TENSOR27 紅外光譜儀，UV-3600 紫外-分光光度計(jì)（日本島津公司）；THZ-100B 恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；AXS D8 X-射線衍射儀（德國布魯克公司）。

1.2 試藥

1，4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE，阿拉丁生化科技有限公司）；透明質(zhì)酸（MW=20～40 kDa，麥克林生化科技有限公司）；液體石蠟（化學(xué)純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；司盤80（化學(xué)純，南京化學(xué)股份有限公司）；阿霉素（Dox，南京奧多福尼生物有限公司）；戊二醛（50 wt%，上海梯希愛化成工業(yè)有限公司）；生理鹽水（安徽雙鶴藥業(yè)）；無水乙醇等試劑均為分析純，購于上海泰坦有限公司。

2 方 法

2.1 微球制備

改性透明質(zhì)酸微球（BDDE-modified hyaluronic acid microspheres，BHAMs）：用移液槍吸取BDDE 46 μL 注入圓底燒瓶，加入0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液10 mL 活化，隨后加入HA 1.0 g，50℃加熱反應(yīng)2 h合成交聯(lián)HA。在文獻(xiàn)[14，15]和預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用改進(jìn)的W/O 乳化交聯(lián)法制備微球。將上述交聯(lián)HA置于20 mL 純水中，加熱溶解，制備成水相。將水相加入80 mL 含司盤80 的液體石蠟中，機(jī)械攪拌乳化40 min，形成油包水乳液。冷卻至室溫，加入少量的戊二醛繼續(xù)固化。用無水乙醇洗滌，真空干燥12h，即得HA 微球（HAMs）。同時制備非交聯(lián)的HAMs。

阿霉素載藥透明質(zhì)酸微球（doxorubicin-loaded BHAMs，DHAMs）：取BHAMs 45 mg 置于1.5 mL 離心管內(nèi)，加入1 mL 濃度為10 mg·mL-1的阿霉素溶液，室溫下?lián)u勻，靜置12 h 即得。

2.2 形態(tài)觀察

取少量BHAMs 置于光學(xué)顯微鏡下，觀察微球的形態(tài)特征和分散性，是否有粘連、破損和其他雜質(zhì)；微球樣品濺射鍍金處理以獲得導(dǎo)電性，隨后置于掃描電子顯微鏡下評估其微觀形貌[16]。

2.3 粒徑測定

取少量BHAMs，放置在載玻片上攤平，使用裝配有目鏡測微尺的光學(xué)顯微鏡隨機(jī)測量200 個微球的直徑，以頻率直方圖描述尺寸分布[7]，采用粒徑分布系數(shù)表征微球分散特性。

式中，D90、D10和D50分別為微球粒徑分布圖中頻率百分?jǐn)?shù)90%、10%和50%處對應(yīng)的粒徑值。分布系數(shù)值越小，微球粒徑分布越窄，單分散性越好。

2.4 溶脹率

取BHAMs 浸泡在適量生理鹽水中，靜置，分別于0.25、0.5、1、2、3、5、7、14、21、36 h 后取出，用注射器盡量吸除生理鹽水。隨后，溶脹微球置于光學(xué)顯微鏡下，使用目鏡測微尺隨機(jī)測量200 個微球的直徑，按如下公式計(jì)算溶脹率。

2.5 體外降解

精確稱取HAMs 和BHAMs 微球各100mg，置于25 mL 具塞試管，加入pH 7.4 磷酸鹽緩沖液10 mL。隨后將具塞試管密封后放置在恒溫?fù)u床上（37℃，100 r·min-1）。分別于1、3、5、7、14、21、42 和60 d 取出樣品，抽濾，轉(zhuǎn)移至扁形稱量瓶，50℃真空干燥5 h。干燥后稱重，并計(jì)算微球降解率。兩種微球各平行測定3 個樣品。

2.6 載藥性能表征

2.6.1 阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精確稱取阿霉素10 mg，加入生理鹽水配制成10 mg·mL-1的阿霉素對照品儲備液。取阿霉素對照品儲備液，加生理鹽水稀釋，分別得到250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 μg·mL-1的阿霉素對照品溶液。用紫外-可見分光光度計(jì)測定490 nm 處吸光度。以阿霉素的濃度為X 軸，吸光度為Y 軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6.2 載藥量和包封率測定 按照上述DHAMs 制備方法，載藥完成后，將各離心管置于低速離心機(jī)，離心5 min（1500 r·min-1），分離上清液并用少量生理鹽水洗滌微球，直至洗滌液無色透明，合并上清液和洗滌液至10 mL 容量瓶，加生理鹽水定容，搖勻，采用紫外-可見分光光度計(jì)測吸光度。用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算溶液中阿霉素的量，按如下公式計(jì)算載藥量和包封率。

2.6.3 FTIR 分析 采用溴化鉀壓片法測定各樣品的紅外光譜。分別取1 mg 左右的BHAMs、DHAMs、Dox 及Dox 和BHAMs 物理混合物，用溴化鉀壓成薄片后放在測試平臺，掃描范圍4000～400 cm-1。

2.6.4 PXRD 分析分別取BHAMs、DHAMs、Dox及Dox 和BHAMs 物理混合物進(jìn)行PXRD 分析。測試條件：Cu 靶，Kα1 射線（λ=1.5406?），電壓40 kV，電流40 mA；發(fā)射狹縫1/8°，防散射狹縫1/4°；防散射狹縫7.5 mm，2θ 范圍：3°～40°，步長0.02°。

2.6.5 阿霉素的體外釋放 取3 份載藥微球（干燥重量45 mg），分別放入錐形瓶中，加入生理鹽水20 mL，將錐形瓶放置在恒溫?fù)u床（37℃，100 r·min-1）。分別于0.25、0.5、1、2、4、8、10、12、24、36、48、60、72 h 吸取上清液1 mL，并加入等量新鮮的生理鹽水。采用紫外-分光光度計(jì)測定每個時間點(diǎn)上清液阿霉素濃度，按如下公式計(jì)算阿霉素累積釋放率。

式中，Cn為n 次采樣后釋放介質(zhì)中的Dox 濃度，Ci為第1 次至（n-1）次采樣的Dox 濃度，V0為藥物釋放介質(zhì)的初始體積（20 mL），V 為采樣體積（1mL），W 為微球中的Dox 質(zhì)量。

3 結(jié)果

3.1 微球形態(tài)和粒徑

通過乳化交聯(lián)法成功制備BHAMs。光學(xué)顯微鏡下，干燥微球呈棕黃色，形態(tài)圓整，分散性較好，視野內(nèi)基本無破損或粘連。經(jīng)水溶脹后，微球?yàn)楸砻婀饣?、半透明狀的?guī)則球形（圖1）。掃描電鏡顯示出微球的光滑表面結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖1 BHAMs的干燥微球（A）及溶脹微球（B）光學(xué)顯微鏡圖（×40）

圖2 BHAMs 的掃描電子顯微鏡圖

圖3 所示，微球的粒徑分布圖近似正態(tài)分布，說明粒徑較均勻?？瞻孜⑶虻钠骄綖椋?11.83±12.21）μm，粒徑分布系數(shù)為0.49，尺寸分布較窄。本批次微球用于之后的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

圖3 BHAMs 的粒徑分布圖

3.2 溶脹率

室溫下測試了BHAMs 的動態(tài)溶脹，得到微球36 h 內(nèi)的溶脹變化圖（圖4）。從圖中可以看出，BHAMs 達(dá)到完全溶脹的時間較長，且溶脹率隨時間呈階梯狀增加，21 h 之后基本不再變化。HAMs 初始溶脹率（0.25 h）為152.61%，21 h 溶脹率達(dá)到199.04%，36 h 時最終溶脹率為201.81%。

圖4 BHAMs 的動態(tài)溶脹曲線圖

3.3 體外降解

在37℃下，測定HAMs 和BHAMs 56 d 內(nèi)的降解率，得到兩種微球的體外降解曲線。從圖5 可看出，HAMs 可在21 d 左右完全降解，而BHAMs 可隨降解時間的增加而緩慢降解。7 d 后BHAMs 的降解率為20.47%，隨后保持緩慢速率繼續(xù)降解，56 d 后仍有65.69%剩余。以上結(jié)果表明BDDE 的交聯(lián)增加了HA 的抗降解能力。

圖5 BHAMs 和HAMs 的體外降解圖（n=3）

3.4 載藥量和包封率

阿霉素的的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合方程為Y=0.009 6X+0.081 5（r2=0.999 9）。平行測定3 組樣品，最終得微球的平均載藥量和包封率分別為（22.09%±0.05%）和（99.41%±0.21%）。由結(jié)果可知，45 mg 左右的微球可載藥10 mg，基本滿足了栓塞微球?qū)d藥量的要求（一次性栓塞5～45 mg）[9]。

3.5 FT-IR 分析

圖6 比較了BHAMs、DHAMs、Dox 及Dox 和BHAMs 物理混合物的FT-IR 圖。HAMs 峰形較為明顯的為透明質(zhì)酸羧酸根C=O 伸縮振動（1610 cm-1和1415 cm-1）[17]。對比DHAMs 和兩者物理混合物的圖譜，DHAMs 中Dox 的-NH3+伸縮振動與HA 羧酸根C=O 伸縮振動缺失，提示Dox 質(zhì)子化的氨基與HA 羧酸根之間存在離子絡(luò)合，證實(shí)了微球通過離子吸附負(fù)載Dox。另一方面，DHAMs 和Dox 的羧基和羥基基團(tuán)特征峰的消失提示微球和藥物之間存在氫鍵作用力。

圖6 BHAMs、DHAMs、Dox 及Dox 和BHAMs 物理混合物FT-IR 圖

3.6 PXRD 分析

Dox 主要的2θ 衍射峰為13.04°、14.80°、16.67°、17.59°、18.36°、19.32°、20.63°、21.94°等，提示原料藥Dox 以特定的晶體形態(tài)存在；Dox 和BHAMs 物理混合物的PXRD 圖譜中，Dox 的特征衍射峰基本存在；BHAMs 和DHAMs 的PXRD 圖中未見特征衍射峰，而是一些無序結(jié)構(gòu)的駝形峰，提示DHAMs 中的藥物存在形式為無定形態(tài)（圖7）[18]。

圖7 BHAMs、DHAMs、Dox 及Dox 和BHAMs 物理混合物的PXRD 圖

3.7 阿霉素體外釋放率

DHAMs 體外藥物累積釋放曲線如圖8 所示。第一階段（0～2h）是藥物的突釋，2h 釋放量為（39.96%±6.39%），這一部分藥物吸附在微球的最表面，由濃度差導(dǎo)致釋放。第二階段為緩慢釋放（2～72 h），此時微球?qū)Π⒚顾氐奈阶饔煤蛿U(kuò)散作用逐漸達(dá)到動態(tài)平衡，72 h 釋藥量為（51.40%±5.89%）。剩余藥物可在微球降解過程中持續(xù)釋放。

圖8 DHAMs 中Dox 體外釋放曲線（n=3）

4 討論

本研究使用BDDE 交聯(lián)HA 制備的微球成球性良好，各項(xiàng)性能包括粒徑范圍、載藥量和包封率等均滿足TACE 的需求。透明質(zhì)酸微球主要通過羧酸根離子吸附帶正電荷的藥物。FT-IR 和PXRD 分析可知，阿霉素主要以無定形態(tài)通過離子鍵和氫鍵作用力吸附于微球表面，藥物不與微球表面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。體外釋藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿霉素可在短時間內(nèi)釋藥，同時由于HA 本身的生物可降解性，剩余藥物可在微球降解后緩慢持續(xù)釋放。綜上所述，透明質(zhì)酸微球有較好的載阿霉素性能，理化性能良好，具有良好的動脈化療栓塞應(yīng)用前景。