張 傲,譚 斌,劉可欣,劉佳利,張淑琴

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,長春 130112)

豬流感病毒(swine influenza virus,SIV)為正黏病毒科、A型流感病毒屬成員,可引起豬的急性、熱性、高度傳染性呼吸系統(tǒng)疾病。目前,世界范圍內(nèi)主要存在的SIV包括H1N1、H1N2和H3N2亞型[1]。豬流感病毒變異速度快,由于豬呼吸道黏膜上皮細(xì)胞表面同時(shí)存在禽流感病毒和人流感病毒的唾液酸受體,使得不同來源的流感病毒可在豬體內(nèi)進(jìn)行基因重排,產(chǎn)生具有新的感染性、致病性及傳播性的基因重排毒株,不僅給全球養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,并且對公共衛(wèi)生造成了嚴(yán)重危害[2-5]。因此,加強(qiáng)對SIV的流行病學(xué)調(diào)查,及時(shí)掌握SIV的生物學(xué)特性及流行情況,不僅對SIV的預(yù)防和控制具有重要作用,更具有深遠(yuǎn)的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本研究在吉林地區(qū)某豬場分離得到一株H1N1亞型SIV,通過對該分離株進(jìn)行全基因組特征分析,了解SIV在吉林地區(qū)豬場中的流行情況,為我國豬流感防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料

犬腎細(xì)胞(MDCK)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所保存;SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;Trizol購自莫納(長春)生物科技有限公司;DNA Marker、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司;PCR試劑、克隆載體pMD18-T均購自TaKaRa公司。

1.2 病毒的分離鑒定

將采集的鼻拭子加入1 mL雙抗PBS溶液(2 000 U·mL-1)稀釋震蕩,在4 ℃條件下8 000 r·min-1離心10 min,取上清以0.22 μm濾膜濾過除菌,接種于9～10日齡SPF雞胚尿囊腔中,37 ℃培養(yǎng)72 h后收集雞胚尿囊液。按照上述方法將尿囊液再次接種雞胚盲傳2代,收集第3代尿囊液進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn),測定其對1%雞紅細(xì)胞的凝集活性并通過RT-PCR鑒定SIV。對鑒定結(jié)果呈陽性的尿囊液參照GB/T 27521—2011豬流感病毒核酸RT-PCR檢測方法對分離病毒進(jìn)行PCR分型鑒定,并按照Reed-Muench法測定病毒的TCID50。

1.3 病毒全基因組擴(kuò)增及特征分析

根據(jù)GenBank查詢到的H1N1亞型SIV基因序列信息,通過比對參考毒株的全基因組序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。應(yīng)用Trizol提取分離株的RNA,通過RT- PCR擴(kuò)增全基因序列并連接至pMD18-T載體后送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果采用BLAST和MegAlign進(jìn)行序列比對及同源性分析,運(yùn)用MEGAX繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹,NetNGlyc-1.0分析預(yù)測潛在糖基化位點(diǎn)。

1.4 吉林省H1N1 SIV的選擇壓力分析

根據(jù)NCBI查詢到的全部吉林省H1N1亞型SIV基因序列信息,結(jié)合分離株的基因序列,采用Datamonkey中的SLAC(Singlelikelihood ancestor counting)及MEME(mixed effects model of evolution)方法計(jì)算每個(gè)密碼子的非同義替換(dN)與同義替換(dS),分析吉林省H1N1 SIVNA和HA基因的選擇壓力、陰性選擇位點(diǎn)和陽性選擇位點(diǎn)。毒株檢索時(shí)間區(qū)間為2008—2022年,數(shù)據(jù)庫采集數(shù)據(jù)時(shí)間為2023年3月9日。P<0.1時(shí),SLAC和MEME的計(jì)算結(jié)果具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 病毒的分離鑒定

收獲雞胚尿囊液進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn),結(jié)果顯示,有12份雞胚尿囊液具有血凝性,其中最高血凝價(jià)為1∶128。取最高血凝價(jià)分離毒株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn),將該毒株命名為A/swine/Jilin/25/2008(H1N1)。利用亞型鑒定引物對分離病毒進(jìn)行PCR分型鑒定,結(jié)果顯示分離株為H1N1亞型SIV。TCID50測定結(jié)果顯示分離株在MDCK 細(xì)胞上的TCID50為10-4.88·mL-1。

2.2 病毒全基因組序列特征分析

2.2.1 病毒全基因組同源性分析 分離株全基因組的8個(gè)基因節(jié)段(GenBank登錄號為OQ740141～OQ740148)與GenBank登錄的基因序列比對結(jié)果顯示,HA基因與A/turkey/IA/21089-3/1992(H1N1)核苷酸相似性為98.94%;NA基因與A/swine/Iowa/24297/1991(H1N1)核苷酸相似性為99.29%。內(nèi)部基因PB2、PA、NP、M、NS基因與2008年在中國出現(xiàn)的A/swine/Hubei/02/2008(H1N1)病毒具有高度相似性,核苷酸序列相似性為98.58%～99.64%;PB1基因與A/swine/Iowa/24297/1991(H1N1)核苷酸相似性最高,為99.49%。

2.2.2 HA 序列分析 HA蛋白由SIV第4節(jié)段的RNA編碼,其開放閱讀框(open reading frame,ORF)全長為1 701 bp,共編碼566個(gè)氨基酸,其中HA1由326個(gè)氨基酸組成,HA2由223個(gè)氨基酸組成。利用SignalP 4.0信號肽預(yù)測軟件對分離株HA蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測,結(jié)果顯示HA信號肽序列位于1～17位氨基酸。經(jīng)Lasergene分析,HA基因的裂解位點(diǎn)位于339～347位氨基酸處,序列為339PSIQSR↓GLF347,該位點(diǎn)未發(fā)生氨基酸突變或插入,符合低致病性SIV的分子特征。利用NetNGlyc-1.0預(yù)測HA潛在糖基化位點(diǎn),結(jié)果顯示HA蛋白具有6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn),分別為28NSTD、40NVTV、104NGTC、304NTSL、498NGTY和557NGSL。

2.2.3 NA 序列分析 NA蛋白由SIV第6節(jié)段的RNA編碼,其ORF全長為1 410 bp,共編碼470個(gè)氨基酸。其潛在糖基化位點(diǎn)有6個(gè),分別為44NHSE、63NOTY、68NISN、88NSSL、146NGTV和235NGSC。通過對NA氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),分離株出現(xiàn)H275K抗神經(jīng)氨酸酶抑制劑(neuraminidase inhibitor,NAI)耐藥性相關(guān)氨基酸位點(diǎn)突變,表明該病毒可能對奧司他韋(oseltamivir)等NAI具有抗藥性[6-7]。

2.2.4 病毒HA基因和NA基因遺傳進(jìn)化分析 將分離株的8個(gè)基因節(jié)段核苷酸序列與GenBank中的經(jīng)典型H1N1、歐亞類禽型H1N1、類人型H1N1和2009H1N1分支代表毒株進(jìn)行比對分析(圖1)。結(jié)果顯示,分離株的全基因組均屬于經(jīng)典型H1N1進(jìn)化分支,未出現(xiàn)流感病毒不同基因型之間的基因重排。

2.2.5 分離株功能性氨基酸位點(diǎn)突變分析 對分離株進(jìn)行功能性氨基酸位點(diǎn)突變分析,毒株出現(xiàn)SIV致病性、毒力及復(fù)制能力增強(qiáng)的相關(guān)位點(diǎn)突變,結(jié)果見表1。

2.3 吉林省H1N1 SIV的選擇壓力分析

通過SLAC和MEME方法對NCBI檢索到的吉林省現(xiàn)有H1N1 SIV毒株及本研究分離得到的H1N1 SIV進(jìn)行選擇壓力分析,HA篩選出4個(gè)正向選擇位點(diǎn)及20個(gè)負(fù)向選擇位點(diǎn),NA篩選出6個(gè)正向選擇位點(diǎn)及11個(gè)負(fù)向選擇位點(diǎn),二者的選擇壓力分別為0.123和0.138,結(jié)果見表2。SIVHA和NA基因在吉林省的自主變異進(jìn)化明顯,NA的突變率高于HA。

3 討 論

SIV可引起豬的高度傳染性呼吸系統(tǒng)疾病,該病毒的傳播給我國畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,并對人類構(gòu)成潛在的大流行威脅。自1918年以來,經(jīng)典型H1N1 SIV在豬群中傳播并以重組的形式在人類中出現(xiàn),導(dǎo)致了2009年H1N1流感大流行[8]。本研究對分離出的經(jīng)典型H1N1 SIV全基因組進(jìn)行了系統(tǒng)分析,并對吉林省H1N1 SIV的選擇壓力進(jìn)行了分析評估。

之前的研究報(bào)道中指出,直至1998年,經(jīng)典型H1N1 SIV作為主要的流行毒株在北美豬群中持續(xù)傳播。在1918—1919年大流行期間,經(jīng)典型H1N1 SIV可能由北美傳播至中國沿海城市的豬群中,該病毒于1991年首次從中國大陸分離出來,流感監(jiān)測分析顯示,自1996年以來,我國豬群中經(jīng)常分離出經(jīng)典型H1N1 SIV[9-10]。本研究于2008年在吉林地區(qū)分離得到一株經(jīng)典型H1N1 SIV,并命名為A/swine/Jilin/25/2008(H1N1)。同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析表明,該病毒與此前在北美和中國分離的經(jīng)典型H1N1病毒有著密切的親緣關(guān)系,這表明它們可能屬于同一進(jìn)化分支,與之前流感病毒研究與監(jiān)測分析結(jié)果相一致。

先前的研究表明,H1N1亞型SIV對NAI具有高耐藥性的突變?yōu)镠275Y,該位點(diǎn)突變使NA活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,并降低了NAI與NA的結(jié)合[7-8]。本研究中分離株出現(xiàn)H1N1亞型SIV NAI高耐藥性氨基酸位點(diǎn)突變,表明該病毒可能對奧司他韋等NAI具有抗藥性。目前,僅有少數(shù)毒株具有神經(jīng)氨酸酶抑制性突變,故該毒株的序列分析對后續(xù)抗流感藥物研究具有參考意義。

由于SIV聚合酶復(fù)合物缺乏校對活性,HA和NA基因易發(fā)生點(diǎn)突變,常以dN/ dS評估氨基酸位點(diǎn)所受的自然選擇壓力[11]。自發(fā)突變在負(fù)向選擇壓力下會(huì)被清除,而在正向選擇壓力下則可以積累并穩(wěn)定遺傳,導(dǎo)致蛋白功能的變化。本研究篩選出

HA基因及NA基因較多的負(fù)向選擇位點(diǎn)表明SIVHA和NA基因在吉林省的自主變異進(jìn)化明顯,已超越免疫選擇壓力的作用。在我國豬的壽命約為6個(gè)月,且豬場幾乎不使用流感疫苗,流感病毒被引入豬體內(nèi)后,病毒所受的免疫選擇壓力較小。因此,這些基因的自主變異進(jìn)化會(huì)超越免疫選擇壓力的作用,導(dǎo)致其進(jìn)化速度比人類和禽類流感病毒慢。

表1 分離株功能性氨基酸位點(diǎn)突變分析Table 1 Analysis of functional amino acid mutations of the SIV isolates

表2 吉林省H1N1 SIVs的選擇壓力分析Table 2 Analysis of the selection pressure of Jilin H1N1 SIVs

4 結(jié) 論

本研究成功分離出一株SIV,通過對分離株全基因組進(jìn)行系統(tǒng)分析確認(rèn)該毒株為經(jīng)典型H1N1 SIV,并命名為A/swine/Jilin/25/2008(H1N1)。本研究獲得的H1N1亞型SIV分離株全基因組序列分析結(jié)果對SIV流行病學(xué)調(diào)查及后續(xù)疫苗研發(fā)具有一定意義。