賀葉青,左百姣,李慶豪,孫 娟,金 鑫,夏 璐*,魏戰(zhàn)勇

(1.河南農業(yè)大學動物醫(yī)學院,鄭州 450046;2.動物病原與生物安全教育部重點實驗室,鄭州 450046)

豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒,屬于尼多病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridaefamily)、α冠狀病毒屬(Alphacoronaviruses)成員,是引起仔豬腹瀉的重要病原[1]。1946年Doyle等首次發(fā)現(xiàn)該病毒是引起豬傳染性胃腸炎的病原,隨后該疾病在許多國家暴發(fā)[2]。我國于1956年發(fā)現(xiàn)該病,并在多個省份相繼報道[3]。TGEV感染通常發(fā)生在寒冷季節(jié),如冬季和早春,主要引起2周齡以內仔豬發(fā)生嘔吐、腹瀉和脫水,對仔豬的致死率高達100%,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。目前疫苗接種是防控TGEV感染的主要措施,但是近年來隨著TGEV變異株的出現(xiàn),使該病無法得到有效控制[4]。

研究表明,TGEV感染仔豬主要引起消化系統(tǒng)癥狀,導致空腸和回腸絨毛萎縮甚至脫落,腸壁滲透壓失衡而腹瀉脫水。最新研究發(fā)現(xiàn)變異的TGEV還可以感染呼吸道,在仔豬肺泡巨噬細胞中復制,造成肺的廣泛損傷[5]。

目前關于TGEV組織嗜性的研究大多集中在感染仔豬的腸道。研究發(fā)現(xiàn)被感染仔豬回腸派伊爾氏結區(qū)域明顯縮小,sIgA陽性細胞、CD3+T細胞和樹突狀細胞數(shù)量顯著降低,并且在淋巴細胞、巨噬細胞中檢測到有病毒顆粒分布,提示TGEV還可感染仔豬的免疫系統(tǒng)[6]。因此,本文對TGEV感染后仔豬的免疫系統(tǒng)進行全面、深入研究,不僅為TGEV的免疫致病機制提供理論依據(jù),同時也對該病的診斷、防治提供指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 從河南某豬場購買10只健康狀況良好的5日齡仔豬,試驗前經反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測仔豬糞便中TGEV、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、豬丁型冠狀病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)、豬輪狀病毒(porcine rotavirus,PoRV)、豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)等常見豬腹瀉傳染病原核酸陰性,采集仔豬血清酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測仔豬血清中TGEV抗體陰性。

1.1.2 病毒、抗體及主要試劑 TGEV HN-2012毒株由河南省動物源性食品安全重點實驗室制備和保存;TGEV N蛋白單克隆抗體由江蘇省農業(yè)科學院李彬研究員饋贈;(鼠/兔)SP試劑盒(貨號KIT-9720)、AEC顯色試劑盒(貨號AEC-0037),購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司;檸檬酸鈉抗原修復液(貨號C1010),購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和感染試驗 10頭5日齡健康仔豬隨機分為空白對照組和TGEV感染組,每組5頭,分別飼養(yǎng)在兩個不同的封閉豬舍內,每隔6 h人工喂奶。感染組仔豬口服10 mL TGEV(TCID50為107·0.1 mL-1),空白對照組仔豬口服相同體積的DMEM培養(yǎng)基,仔豬在感染5 d后逐一進行安樂死剖殺。所有動物試驗程序均按照河南農業(yè)大學動物倫理與使用委員會的指導方針進行。

1.2.2 樣品采集與處理 仔豬處死后,分別采集仔豬的中樞免疫器官(胸腺)和外周免疫器官(脾、扁桃體、腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結、髂下淋巴結、頸淺淋巴結、下頜淋巴結),一式三份,固定在40 g·L-1多聚甲醛中以備后續(xù)使用。

1.2.3 組織切片的制備 仔豬的各臟器固定48 h后,從多聚甲醛中取出修塊,放入包埋盒中流水沖洗過夜,然后依次按照梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、石蠟切片機切片的過程處理,最后進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色和免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)染色。

1.2.4 HE染色 為了解TGEV感染仔豬后免疫器官的病理變化,對免疫系統(tǒng)的各組織樣品進行HE染色。制作好的石蠟切片依次經二甲苯脫蠟、梯度酒精復水后,用HE染色,中性樹膠封片后進行觀察和分析。

1.2.5 免疫組化染色 為了分析TGEV在仔豬免疫系統(tǒng)中的分布,用TGEV N蛋白單克隆抗體進行染色。采集的各組織經脫蠟、水化和流水沖洗后,用0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=6.0)對組織進行抗原修復,過氧化氫溶液室溫孵育10 min阻斷內源性過氧化物酶的干擾,50 g·L-1牛血清白蛋白溶液室溫封閉10 min阻斷抗體的非特異性結合。接著,將TGEV N蛋白單克隆抗體(1∶500)在4 ℃條件下孵育過夜,生物素標記的羊抗小鼠IgG聚合物與樣本室溫孵育10 min,鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶室溫孵育10 min,最后用AEC顯色試劑盒對樣品進行顯色。

2 結 果

2.1 組織病理學分析

2.1.1 中樞免疫器官的病理變化 胸腺組織的HE染色結果顯示,空白對照組仔豬胸腺的結構未見異常,皮質和髓質邊界清晰,胸腺小體清晰可見(圖1A);TGEV感染組仔豬胸腺髓質區(qū)域增大,淋巴細胞減少(圖1B)。

2.1.2 外周免疫器官的病理變化 脾組織的HE染色結果顯示,空白對照組仔豬脾的結構未見異常,紅髓、白髓和邊緣區(qū)結構清晰,淋巴細胞染色正常(圖2A);TGEV感染組仔豬脾被膜和小梁增厚,紅髓增多,脾索和脾竇界限不清晰,淋巴細胞減少,紅髓中有大量紅細胞浸潤(圖2B)。

扁桃體組織的HE染色結果顯示,空白對照組仔豬扁桃體的結構未見異常,扁桃體被膜、結締組織和淋巴濾泡染色清晰(圖2C);TGEV感染組仔豬扁桃體細胞淡染,淋巴濾泡和淋巴細胞均減少(圖2D)。

淋巴結組織的HE染色結果顯示,空白對照組仔豬淋巴結結構未見異常,淋巴小結結構清晰完整(圖2E、2G、2I、2K和2M);TGEV感染組仔豬的淋巴結均有不同程度的損傷,顯微鏡觀察均可見淋巴結腫大,淋巴竇中有大量血細胞浸潤并伴有鐵銹色顆粒,提示巨噬細胞吞噬作用增強。頸淺淋巴結髓質中髓索和髓竇界限不清,髓竇中充滿淡紅色紅染物質(圖2F);腹股溝淋巴結可見淋巴細胞增生,呈團島狀分布,淋巴竇擴張,髓質的髓索變粗(圖2H);下頜淋巴結可見淋巴小結邊界模糊(圖2J);腸系膜淋巴結可見細胞淡染,淋巴細胞減少(圖2L);髂下淋巴結淋巴細胞增多,小梁增厚(圖2N)。

2.2 TGEV在仔豬免疫系統(tǒng)的分布

2.2.1 中樞免疫器官TGEV的分布 胸腺的IHC染色結果顯示,空白對照組仔豬胸腺未見明顯陽性著色(圖3A);TGEV感染組仔豬胸腺的被膜和皮質中看到少量特異性紅色著色點(圖3B)。

2.2.2 外周免疫器官TGEV的分布 脾組織的IHC染色結果顯示,空白對照組仔豬脾未見明顯陽性著色(圖4A);TGEV感染組仔豬脾紅髓和邊緣區(qū)可見大量淋巴細胞呈特異性紅色著色點(圖4B)。

扁桃體組織的IHC結果顯示,空白對照組仔豬扁桃體未見明顯陽性著色(圖4C);TGEV感染組仔豬扁桃體被膜下方的彌散淋巴組織呈特異性紅色著色點(圖4D)。

淋巴結組織的IHC結果顯示,空白對照組仔豬淋巴結未見明顯陽性著色(圖4E、4G、4I、4K和4M);TGEV感染組仔豬頸淺淋巴結和腹股溝淋巴結被膜下淺層皮質區(qū)有大量淋巴細胞呈特異性紅色著色點,大多分布在鐵銹色沉積周圍(圖4F和4H),下頜淋巴結可見淋巴小結周圍有特異性紅色著色點(圖4J),腸系膜淋巴結和髂下淋巴結淺層皮質區(qū)有少量特異性紅色著色點,與對照組對比不明顯(圖4L和4N)。

TGEV存在于多種免疫器官,病毒載量以脾為最高,其他器官病毒載量由高到低依次為頸淺淋巴結、腹股溝淋巴結、扁桃體、下頜淋巴結、腸系膜淋巴結、髂下淋巴結、胸腺(圖5)。

3 討 論

TGEV是一種腸致病性冠狀病毒,主要引起仔豬嘔吐、腹瀉、脫水等臨床癥狀,剖檢可見感染仔豬的胃中充滿著未消化的凝乳塊,腸壁明顯變薄,腸腔內充滿大量黃色液體內容物,同時伴有腸系淋巴結出血[7-9]。鏡檢發(fā)現(xiàn)TGEV感染主要引起仔豬腸絨毛萎縮,上皮細胞空泡化并出現(xiàn)脫落,最終導致仔豬的營養(yǎng)吸收障礙和腹瀉[7]。深入研究發(fā)現(xiàn),TGEV主要感染仔豬的腸上皮細胞,包括腸細胞、干細胞和杯狀細胞[6]。目前,TGEV感染仔豬的相關研究大多集中于腸道,而TGEV對仔豬全身免疫系統(tǒng)影響的研究報道較少[10-11]。免疫系統(tǒng)是機體執(zhí)行免疫功能的機構,在抵御病原微生物入侵機體中發(fā)揮重要作用。因此,開展TGEV對仔豬免疫系統(tǒng)的研究有助于全面了解該病毒的致病性,對臨床指導TGEV的防控具有重要的理論和實踐意義。本試驗通過HE染色對TGEV感染仔豬后免疫器官的病理變化進行分析,并且通過IHC染色檢測了病毒粒子在免疫器官內的分布。

HE結果表明,TGEV感染仔豬可引起中樞免疫器官免疫細胞減少;外周免疫器官腫大、出血,免疫細胞減少。相關研究發(fā)現(xiàn)TGEV感染后病豬脾腫大、充血,部分淋巴結腫脹、充血,顏色變深呈紫紅色[8]。引起仔豬腹瀉的豬腸道冠狀病毒還包括PEDV、PDCoV等。PEDV感染仔豬后也發(fā)現(xiàn)仔豬的免疫系統(tǒng)受到損傷,如免疫細胞減少,腸系膜淋巴結毛細血管充血或輕微出血,脾內有大量嗜酸性粒細胞浸潤[12]。新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)引發(fā)的新冠肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)嚴重威脅人類健康。調查發(fā)現(xiàn)COVID-19患者免疫功能受損在臨床中表現(xiàn)非常突出,主要表現(xiàn)為脾體積明顯縮小,紅髓脾竇擴張、充血,白髓呈不同程度萎縮,嗜血細胞增多,中性粒細胞、漿細胞數(shù)量增多,嗜酸性粒細胞數(shù)量下降[13]。進一步研究發(fā)現(xiàn),COVID-19患者外周血T淋巴細胞(CD4+和CD8+)過度激活,表現(xiàn)為CCR4+CCR6+Th17細胞的增加和CD8+T淋巴細胞的高細胞毒性,提示患者遭受了嚴重的免疫系統(tǒng)損傷[14]。上述結果表明冠狀病毒可以對機體的免疫系統(tǒng)造成損傷,今后應重視冠狀病毒對免疫系統(tǒng)的影響。

IHC的結果顯示,TGEV存在于多種免疫器官,并且脾中的病毒載量最高(圖8P)。間接免疫熒光方法也在仔豬腸系膜淋巴結中檢測到了TGEV[15]。RT-PCR方法也在仔豬的脾、扁桃體、腹股溝淋巴結等免疫器官內檢測到了PDCoV和豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的存在[16-17]。IHC和原位雜交等方法也在COVID-19患者脾淋巴細胞和巨噬細胞內檢測到SARS-CoV-2[13]。這些研究說明了冠狀病毒可以感染免疫系統(tǒng)。豬氨肽酶N(porcine aminopeptidase N, pAPN)是TGEV感染的主要功能性受體[18]。TGEV分布于多個免疫器官,作者猜測這些免疫器官中存在pAPN的表達。作者還發(fā)現(xiàn)感染仔豬脾的紅髓中有大量血細胞浸潤,淋巴組織中有大量血細胞浸潤和鐵黃素沉積,推測TGEV感染仔豬后引起病毒血癥,通過血液循環(huán),到達脾、淋巴結等免疫器官,促使機體啟動一系列免疫應答,造成免疫器官損傷。

綜上,TGEV感染仔豬后,引起各免疫器官不同程度的損傷,且在各免疫器官內均有TGEV分布,表明TGEV能夠感染仔豬免疫系統(tǒng)并引起仔豬各免疫器官組織損傷,降低機體的免疫功能。今后的研究中應關注豬腸道冠狀病毒對仔豬免疫系統(tǒng)的影響,在臨床治療中采取相應的干預措施。

4 結 論

TGEV感染損傷仔豬免疫器官,降低機體免疫功能。