蘇 丹,文曉賓,馬 騰,鐘儒清*,王 陽,陳 亮

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,青島 266000;2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所 畜禽營養(yǎng)與飼養(yǎng) 全國重點實驗室,北京 100193)

羥基酪醇(Hydroxytyrosol, HT)是一種天然單組分酚類化合物,主要以脂類的形式存在于橄欖果實、橄欖葉以及橄欖油中[1]。HT具有較好的水溶性和脂溶性,在動物胃腸道中被吸收后,可迅速轉移并廣泛分布于體內各組織中,是目前發(fā)現(xiàn)的生物利用度最高的一種酚類[2]。HT具有顯著的藥理學作用[3],能有效抗炎、抗菌、抗腫瘤,有良好的抗氧化性,是天然的抗氧劑之一[1]。當前國內外對HT的研究主要集中在醫(yī)藥學領域和保健行業(yè),在畜禽生產(chǎn)領域也將有重要應用潛力。特別是在后抗生素時代,開發(fā)綠色、天然、高效的飼料“替抗”添加劑已經(jīng)成為畜禽行業(yè)重要的探索課題。前人研究發(fā)現(xiàn),HT對二硫化碳(CS2)誘導的小鼠睪丸組織損傷具有保護作用,其機制主要是HT維持了抗氧化酶的活性,緩解了氧化損傷[4]。本團隊前期研究也發(fā)現(xiàn),飼喂100 mg·kg-1體重(BW)橄欖粗提物的小鼠可以通過改善結腸微生物群落提升機體的抗氧化能力[5]。進一步深入探討揭示,羥基酪醇不僅顯著提高了氧化應激小鼠小腸中Nrf2抗氧化通路相關基因的mRNA水平,還通過影響甘油磷酸以及戊糖和葡萄糖醛酸鹽轉化代謝通路,提高機體的抗氧化能力[6]。然而,目前國內外對HT的研究主要是以小鼠為研究對象,除了本團隊在公豬精液品質提升上的研究等少數(shù)幾個報道外[4],在畜禽養(yǎng)殖領域的研究還較少。而肉雞產(chǎn)業(yè)是我國目前畜禽養(yǎng)殖中集約化養(yǎng)殖程度最高的產(chǎn)業(yè),特別是飼料禁抗以后肉雞養(yǎng)殖對綠色替抗飼料添加劑產(chǎn)品的需求更為迫切。因此,本試驗旨在研究飼糧添加HT對肉雞生長性能、抗氧化能力和腸道炎性因子等的影響,為在畜牧行業(yè)“禁抗、限抗”背景下開發(fā)一種以HT為核心成分的肉雞新型天然綠色添加劑提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗選取初始體重(BW)為(46.0±1.0)g的1日齡健康愛拔益加(AA)肉仔雞126只,隨機分為3個處理組,每個組6個重復,每個重復7只雞。對照組(CON)飼喂玉米-豆粕型基礎飼糧,其為參照《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)配制的粉狀配合飼料,基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1?？股亟M(ANT)飼糧是在基礎飼糧中添加100 mg·kg-1的金霉素,另外的試驗飼糧為在基礎飼糧中添加500 mg·kg-1HT的飼糧,試驗期為21 d。試驗所用HT為杭州唯鉑萊生物科技有限公司提供,純度為99%。

肉雞試驗于中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所/動物營養(yǎng)學國家重點實驗室昌平試驗基地開展,采用三層立體籠養(yǎng),所有籠子配置飲水器,試驗期間自由采食和飲水。試驗期間清洗、消毒、雞只免疫、飼養(yǎng)規(guī)程等按動物營養(yǎng)國家重點實驗室管理規(guī)定執(zhí)行。試驗前1～3 d雞舍溫度控制在33 ℃左右,之后每2 d降低1 ℃,直到雞舍溫度降到26 ℃左右。整個試驗期間每天記錄雞只的數(shù)量,每周記錄采食量,21 d試驗結束時稱重。

1.2 樣品采集

在試驗的第21天,從CON組、ANT組以及HT組中,每個重復里面隨機挑選1只接近平均體重的肉雞進行樣品采集。從翼根靜脈采血至采血管,分離血清,于-20 ℃冰箱保存。頸靜脈放血致死,解剖后快速分離盲腸和空腸,將盲腸縱向切開,用無菌取樣匙取出其中的內容物,放于液氮中保存。將空腸沿腸系膜剪開,輕輕除去食糜,用生理鹽水沖洗干凈,刮取中部黏膜組織,液氮速凍后置于-80 ℃中保存。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 生長性能 試驗第21天稱取每只雞的體重,試驗期間以重復為單位記錄采食量,根據(jù)肉雞體重和采食量計算1～21 d的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料肉比(F/G)等指標。

1.3.2 器官重量及器官指數(shù) 將肉雞放血后進行屠宰解剖,采集肝、脾、法氏囊、腎,用濾紙擦去血漬,去除脂肪后稱取器官重。器官指數(shù)按照如下公式計算:

器官指數(shù)(g·kg-1)= 器官重量(g)/活體重量(kg)。

1.3.3 血清抗氧化指標測定 將保存的血清進行抗氧化指標的測定,試劑盒購自南京建成生物工程研究所,所有操作均按照試劑盒說明書進行,采用酶標儀(Tecan Infinite 200 Pro,瑞士)測定血清中的總抗氧化能力(T-AOC,AO15-1-2)、丙二醛(MDA,A003-1-1)含量、總超氧化物歧化酶(T-SOD,A001-1-1)和過氧化氫酶(CAT,A007-1-1)的活性。

1.3.4 盲腸內容物短鏈脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA)含量的測定 稱取0.5 mg盲腸內容物于1 mL的生理鹽水中,混勻后取0.8 mL的上清液,按照5∶1的比例加入25%的偏磷酸繼續(xù)混合均勻,室溫靜置反應3～4 h后離心,45 μm微孔濾膜(尼龍系)過濾,加入上機瓶(600 μL以上),在色譜質譜聯(lián)用儀(Agilent 5975C,美國)中主要檢測乙酸(acetic acid)、丙酸(propionic acid)、異丁酸(isobutyric acid)、丁酸(butyric acid)、異戊酸(isovaleric acid)、戊酸(valeric acid)等,具體操作參考Tang等[7]的方法執(zhí)行。

1.3.5 基因表達檢測

1.3.5.1 肉雞腸道黏膜總RNA的提取:將腸道黏膜從-80 ℃冰箱中取出,稱取約10 mg組織,RNA提取按照Qiagen RNesay Kit試劑盒(QIAGEN,德國)的說明書在超凈臺內進行。取1 μL總RNA使用超微量蛋白核酸分析儀(BioDrop-μLite,英國)進行定量,確保RNA樣品的檢測數(shù)值A260/280=1.8～2.0即可。提取的總RNA通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量,確定RNA條帶清晰明亮且無拖尾現(xiàn)象后進行定量、反轉錄和定量操作。

1.3.5.2 反轉錄及定量:采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒(TaKaRa,日本),對1 μg的總RNA進行反轉錄,獲得cDNA用于熒光定量PCR。熒光定量PCR采用TB Green Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus, TaKaRa,日本)試劑盒在7500 Real-time PCR System (ABI,美國)進行,熒光定量PCR操作均按照說明書進行。組織中各基因相對表達量以β-actin和GAPDH雙管家基因為內參,基因表達量采用2-ΔΔct法進行計算。以上操作均在超凈臺中完成。

1.3.5.3 PCR引物的設計合成:所有引物均使用Primer-BLAST(NCBI的引物設計和特異性檢驗工具)在線設計并檢驗其特異性,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。Toll樣受體4(TLR-4)、核轉錄因子-κB(NK-κB)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-10、轉化生長因子-β(TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及內參基因(β-actin)所有引物均由模板梯度稀釋后做標準曲線計算擴增效率,經(jīng)測試所有引物擴增效率均在90%～100%。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以JMP10.0軟件(A Business Unit of SAS SAS Campus Drive Cary, NC 27513)進行數(shù)據(jù)分析。試驗數(shù)據(jù)采用平均值及標準誤(SEM)表示,采用單因素方差分析對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析,采用Tukey法對不同處理的均值進行多重比較。結果以P<0.05為差異顯著性判斷標準,P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 羥基酪醇對肉雞生長性能的影響

從表2可知,在21 d試驗結束時,HT組和ANT組肉雞的BW分別為855.35和859.23 g,相較于CON組(824.86 g)分別提高了3.70%和4.17%,但差異未達到顯著水平(P=0.285)。類似地,HT組和ANT組肉雞的ADG比CON組分別提高了1.36和1.73 g,亦未達到顯著水平。飼喂羥基酪醇肉雞的ADFI為57.17 g,顯著高于CON組和ANT組(P=0.007)。三組肉雞的料重比數(shù)據(jù)具有差異趨勢(P=0.069),分別為1.39(CON組)、1.34(ANT組)和1.48(HT組)。

2.2 羥基酪醇對肉雞器官重量及器官指數(shù)的影響

如表3所示,從數(shù)值上看,相較于CON組和ANT組,HT組肉雞肝重(22.48 g)、肝臟指數(shù)(28.5 g·kg-1)、腎臟重量(2.87 g)、腎臟指數(shù)(7.28 g·kg-1)以及法氏囊重量(1.75 g)最高,但差異未達到顯著水平。HT組肉雞的脾重(0.70 g)和

表2 羥基酪醇對肉雞生長性能的影響Table 2 Effects of hydroxytyrosol on growth performance of broilers

脾臟指數(shù)(0.89 g·kg-1)在數(shù)值上低于另外兩個組,但差異不顯著。

2.3 羥基酪醇對肉雞血清抗氧化指標的影響

由表4可知,與CON組相比,飼糧中添加HT和添加ANT均顯著降低肉雞血清中MDA含量(P<0.01)。添加HT的肉雞血清中CAT值為0.23 U·mL-1,遠高于CON組(0.03 U·mL-1)和ANT組(0.06 U·mL-1,P<0.01)。與CON組相比,飼糧中添加HT和ANT還有提高血清中T-SOD的趨勢(P=0.068)。各組肉雞血清的T-AOC值沒有統(tǒng)計上的差異性。

表4 羥基酪醇對肉雞血清抗氧化能力的影響Table 4 Effect of hydroxytyrosol on serum antioxidant capacity of broilers

2.4 羥基酪醇對肉雞空腸炎性因子的影響

由圖1A可知,與CON組和ANT組相比,添加HT顯著降低空腸黏膜TLR4/NF-κB信號通路中TLR-4的mRNA水平(P<0.05)。HT組肉雞空腸黏膜NF-κB的mRNA表達量也低于ANT組(圖1B,P<0.05),但是與CON組沒有顯著差異。與CON組和ANT組相比,添加HT均能不同程度地降低致炎性因子IL-1β、IL-6的mRNA表達量(圖1C、1 D,P<0.05)。TNF-α的mRNA表達量在HT和ANT組間沒有顯著性差異,但是均顯著低于CON組(圖1F,P<0.05)。抑炎性因子TGF-β和IL-10的mRNA在HT組肉雞空腸黏膜中的表達量也顯著低于CON組和ANT組(圖1E、1 G,P<0.05)。

2.5 羥基酪醇對肉雞盲腸內容物揮發(fā)性脂肪酸的影響

由表5可知,三個處理組肉雞盲腸內容物中的揮發(fā)性脂肪酸主要是乙酸、丙酸、丁酸,異丁酸、異戊酸和戊酸含量較低。以上不同揮發(fā)性脂肪酸含量在三個不同處理間差異并不顯著。

3 討 論

HT主要提取自橄欖果實、橄欖葉及橄欖相關加工品,我國亦有較為豐富的橄欖品種資源[8]。此外,使用合成生物學技術、化學合成法和光催化合成法是獲得HT的重要途徑[9]。大量文獻報道,HT具有抗氧化、抗炎、預防癌癥、降脂等多方面生物學功能[10],目前多應用于生物醫(yī)藥、食品保健等行業(yè)上。在養(yǎng)殖行業(yè),對維護畜禽動物腸道健康、保護肝、促進骨骼發(fā)育等方面也具有巨大應用潛力[8]。畜禽養(yǎng)殖業(yè),首先關注的就是對畜禽動物的生長性能及對飼料養(yǎng)分的消化吸收效率。Leskovec等[11]添加了10%的發(fā)酵橄欖葉于肉雞飼料中,發(fā)現(xiàn)可以顯著提升肉雞對飼料中蛋白質的利用效率。在以海鯛為對象的研究中發(fā)現(xiàn),飼料中添加橄欖殘渣提取物,具有提高其生長性能的趨勢[12]。Vazquez-Gomez等[13]在豬的研究中表明,母體補充HT可以改善子代產(chǎn)前和產(chǎn)后的生長性能。本試驗發(fā)現(xiàn),添加HT可以顯著提高肉雞采食量,但是肉雞的終體重差異并不顯著。可能是因為本試驗周期較短,其促進生長的功能效果還沒有完全體現(xiàn)出來[14]。大量文獻報道,HT可以通過抑制機體炎性反應,減少細胞凋亡,增加抗氧化活性等途徑發(fā)揮保護機體肝功能的作用[15-16]。本試驗發(fā)現(xiàn),500 mg kg-1HT處理組肉雞的肝重量和肝臟指數(shù)在數(shù)值上均高于CON組和ANT組,這與HT調控肉雞肝組織健康是否相關以及其具體作用途徑還需要進一步驗證探究。

若機體內自由基產(chǎn)生過多或者清除能力下降,機體氧化和抗氧化防御系統(tǒng)之間的動態(tài)平衡會被破壞,進而產(chǎn)生氧化應激。氧化應激會損傷機體DNA、蛋白質及組織結構,進而誘發(fā)多種疾病,甚至導致動物死亡[17]。MDA是氧化應激的主要標志物,其含量可以直接反映體內自由基的反應程度,也間接反映細胞的受損程度[18]。而SOD、CAT等則共同構成機體的抗氧化防御系統(tǒng),能夠一定程度上清除過量產(chǎn)生的氧自由基,發(fā)揮抗氧化作用[17,19]。研究表明,HT可直接清除機體內源性和外源性自由基和氧化物,又可通過調節(jié)Nrf2和JNK-p62/SQSTM1抗氧化系統(tǒng)間接抑制氧化應激[20],其抗氧化能力是茶多酚的15倍、輔酶Q的3倍[16,21]。本試驗也發(fā)現(xiàn),飼喂HT顯著降低肉雞血清中的MDA含量,提高了CAT的活性,對SOD活性也有提升的趨勢,這與本團隊前期以小鼠和公豬為模式動物的研究結果也相一致[4-6]。

TLR-4/NF-κB信號通路是介導免疫應答和機體炎癥反應的經(jīng)典通路。本試驗發(fā)現(xiàn)飼喂HT能夠不同程度地降低肉雞腸道黏膜的TLR-4和NF-κB的mRNA水平,抑制下游炎性因子的產(chǎn)生,這與Wang等[22]的報道相一致。本試驗中,500 mg·kg-1HT添加組肉雞下游的致炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α等均不同程度的降低,也再次驗證HT的抗炎的作用。IL-10和TGF-β是體內重要的抑炎細胞因子。有趣的是,本試驗也同時發(fā)現(xiàn),飼喂HT肉雞腸道黏膜的IL-10和TGF-β表達量較CON和ANT組顯著降低,這與Wang等[23]及Shan和Miao[24]的研究結果不完全一致。推測,這可能由于HT一定程度上影響了抑炎因子和促炎因子的動態(tài)平衡,未來可以通過肉雞的腸道炎癥模型試驗或者細胞試驗進一步深入研究。

本試驗還分析了HT對肉雞后腸SCFA的影響。SCFA是腸道微生物碳水化合物發(fā)酵的代謝產(chǎn)物,其含量與腸道菌群的數(shù)量和組成密切相關。前期本團隊研究發(fā)現(xiàn),腸道微生物在HT發(fā)揮機體抗氧化功能過程中存在重要的介導作用[4-6],但是本研究并沒有發(fā)現(xiàn)飼喂HT對SCFA含量有顯著性的影響。這可能是HT大多在前消化道被吸收,少部分進入后腸的HT通過改變關鍵菌的相對豐度發(fā)揮功能調節(jié)作用,而對微生物總量影響有限導致的[6]。后續(xù)還需要進一步開展微生物多樣性和功能分析,以驗證HT對肉雞腸道微生物的調節(jié)作用。

A.G. 分別為空腸TLR-4、NF-κB、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β mRNA相對表達量。柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) A-G. The relative expression levels of TLR-4, NF-κB, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α, TGF-β mRNA, respectively. Bars with different lowercase letters mean significant different(P<0.05)圖1 羥基酪醇對肉雞空腸炎性因子相對表達量的影響Fig.1 Influence of hydroxytyrosol on the mRNA relative expression level of jejunal inflammatory factors of broilers

表5 飼料添加羥基酪醇對肉雞盲腸內容物揮發(fā)性脂肪酸的影響Table 5 Effects of dietary hydroxytyrosol on volatile fatty acids in cecum content of broilers μmol·g-1

4 結 論

在本試驗條件下,肉雞飼糧中添加羥基酪醇可以提高機體抗氧化能力,降低炎性因子水平,并可能通過此改善肉雞的生長性能,一定程度上實現(xiàn)抗生素替代。其具體作用機制及在畜禽養(yǎng)殖行業(yè)上的應用前景還需要進一步探討評估。