賈藝泉,于夢(mèng)婷,劉衛(wèi)容,方守國(guó),章松柏,3

(1.長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)部,荊州 434023;2.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,荊州 434025;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江中游作物 綠色高效生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(部省共建),長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,荊州 434025)

雞傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)屬于冠狀病毒科Gamma冠狀病毒屬,是具有囊膜的單股正鏈RNA病毒[1]。IBV是一種常見的呼吸道疾病病原體,對(duì)家禽業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。截至目前,已鑒定出多種具有持續(xù)突變能力的IBV毒株,并且由于不同毒株間可以進(jìn)行不斷重組,導(dǎo)致IBV的基因型和血清型更加多樣化和復(fù)雜,這是目前預(yù)防和控制傳染性支氣管炎(infectious bronchitis,IB)面臨的主要難題。因此,制定一些新的策略對(duì)于防治IBV感染,減少與IBV感染相關(guān)的經(jīng)濟(jì)損失迫在眉睫[2-4]。

在抗病毒方面,中草藥因其安全、有效及低成本而備受關(guān)注,多種植物提取物或植物中的有效成分被證實(shí)在體內(nèi)外具有積極的抗病毒作用[5]。黃芩苷是從黃芩(Scutellari)根中分離出的黃酮類化合物[6],具有抗病毒、抑菌、抗腫瘤和抗氧化等多種藥理活性,其中以抗病毒活性著稱[7],對(duì)流感病毒(influenza virus,IV)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、柯薩奇病毒(coxsackieviruses,CV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)以及嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2(SARS-CoV-2)等均具有一定的抑制作用[8-11]。在IB防治方面,黃芩苷的抗病毒作用及其作用機(jī)制仍知之甚少。有報(bào)道指出,黃芩苷在雞胚及雛雞上對(duì)IBV感染具有一定的抑制效果[12-13],但其潛在的作用機(jī)制尚不清楚。另有報(bào)道顯示,黃芩苷可通過靶向Ras-GTPase激活蛋白結(jié)合蛋白1(Ras GTPase-activating protein-binding protein 1,G3BP1)誘導(dǎo)PKR/eIF2α通路磷酸化及應(yīng)急顆粒(stress granules,SG)形成,啟動(dòng)抗病毒反應(yīng),抑制IBV在Vero細(xì)胞中的復(fù)制[14]。在本課題前期研究中,中草藥黃芩乙醇提取物對(duì)IBV在H1299細(xì)胞中的復(fù)制有較明顯的抑制效果[15]。中草藥具有多種化學(xué)成分,其發(fā)揮某種藥效可能是由單個(gè)化學(xué)成分起作用或由多個(gè)化學(xué)成分共同起作用。為確定黃芩提取物中發(fā)揮抗IBV藥理活性的關(guān)鍵藥效物質(zhì),本研究將進(jìn)一步分析黃芩的主要活性成分黃芩苷對(duì)IBV的抑制作用。

先天免疫系統(tǒng)是保護(hù)宿主免受病毒感染的第一道防線,而誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素(interferon,IFN)合成是先天免疫系統(tǒng)的重要抗病毒機(jī)制[16]。越來越多的研究表明,傳統(tǒng)中草藥可以通過調(diào)節(jié)宿主的先天免疫反應(yīng)發(fā)揮抗病毒作用[17-18]。在一項(xiàng)研究中,黃芩苷可通過上調(diào)干擾素的表達(dá),激活其下游JAK-STAT通路,在RSV-感染小鼠中發(fā)揮抗病毒活性[19]。但目前未見黃芩苷參與調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生與IBV感染之間關(guān)系的報(bào)道。本研究擬在分析黃芩苷對(duì)IBV抑制作用的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探究黃芩苷對(duì)宿主細(xì)胞Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的調(diào)控作用,明晰黃芩苷影響IBV復(fù)制的作用機(jī)制,為黃芩苷在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用及相關(guān)靶點(diǎn)藥物的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和病毒 H1299細(xì)胞(人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)系由新加坡南洋理工大學(xué)生物學(xué)院病毒實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)由本實(shí)驗(yàn)室保存。因固有的基因缺陷,Vero細(xì)胞不能表達(dá)抗病毒干擾素,文章中除病毒噬斑分析,其余研究均在能表達(dá)干擾素的H1299細(xì)胞中進(jìn)行。病毒IBV Beaudette 株(IBV-p65)由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存;重組病毒IBV-3ab-luc由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,是利用反向遺傳學(xué)技術(shù),在IBV全基因組的基礎(chǔ)上,用熒光素酶(luciferase)的基因序列替代IBV-p65的3ab片段構(gòu)建而成。

1.1.2 主要試劑 黃芩苷(批號(hào):N15GB167969),購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;胎牛血清FBS、0.25% 胰酶、基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM 購(gòu)自Gibco 公司;2×TaqPCR StarMix為GenStar公司產(chǎn)品;苯甲基磺酰氟PMSF、RIPA 組織/細(xì)胞裂解液購(gòu)自Solarbio公司;IBV N多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存;IL-6抗體、IFN-β抗體、STAT1抗體、p-STAT1抗體、SOCS3抗體購(gòu)自ABclonal公司;IRF3抗體、p-IRF3抗體購(gòu)自Abcam公司;ExFect 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Vazyme 公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega 公司。

1.2 黃芩苷對(duì)H1299細(xì)胞活性影響分析

稱取黃芩苷粉末500 μg溶于1 mL的無血清DMEM培養(yǎng)液中,制成濃度為500 μg·mL-1的黃芩苷母液,隨后用一定體積的DMEM將黃芩苷母液倍比稀釋成500、250、125、62.5、31.3 μg·mL-15個(gè)不同濃度。H1299細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)至覆蓋率達(dá)90%左右時(shí),加入不同濃度的黃芩苷,100 μL·孔-1,每濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,留一列細(xì)胞作為正常細(xì)胞對(duì)照,每孔只加100 μL DMEM,37 ℃,50 mL·L-1CO2條件下培養(yǎng)24 h。每孔加10 μL MTT溶液和90 μL DMEM培養(yǎng)液,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 1 000 r·min-1離心5 min,再用150 μL 甲瓚溶液孵育10 min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490 nm處測(cè)量各孔的吸光值,并計(jì)算不同濃度藥物處理下對(duì)應(yīng)的細(xì)胞抑制率。計(jì)算公式如下:抑制率(%)=(1-加藥組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。本試驗(yàn)中,對(duì)細(xì)胞的抑制率低于10%的黃芩苷濃度被選為無毒濃度,被用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 黃芩苷對(duì)IBV的抑制作用分析

1.3.1 病毒感染前加藥 在12孔板中,待H1299細(xì)胞覆蓋率達(dá)90%左右時(shí),去掉上清液,加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液1 mL,先用黃芩苷預(yù)處理細(xì)胞3 h,再用 MOI=0.5 的IBV-3ab-luc感染細(xì)胞,每濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照,即只用病毒感染不加黃芩苷處理。24 h后觀察病毒感染情況,按照熒光素酶檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行病毒熒光值檢測(cè),分析病毒復(fù)制情況。

1.3.2 病毒感染后加藥 在12孔板中,待H1299細(xì)胞覆蓋率達(dá)90%左右時(shí),去掉上清液,加入1 mL不含血清的DMEM培養(yǎng)液,先用 MOI=0.5 的IBV-3ab-luc病毒感染細(xì)胞3 h,再加入黃芩苷,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照。按“1.3.1”方法檢測(cè)病毒熒光值,分析病毒復(fù)制情況。

1.3.3 不同濃度的黃芩苷對(duì)IBV的抑制作用 將黃芩苷以最大無毒濃度為起點(diǎn),倍比稀釋成不同濃度,在12孔板中,待H1299細(xì)胞覆蓋度達(dá)90%左右時(shí),去掉上清液,加入1 mL不含血清的DMEM培養(yǎng)液,再分別加入MOI=0.5 的重組病毒IBV-3ab-luc和不同濃度的黃芩苷,各濃度均設(shè)復(fù)孔。按前述步驟進(jìn)行病毒熒光值檢測(cè),分析病毒復(fù)制情況。

1.4 病毒噬斑分析

將Vero細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞覆蓋率達(dá)90%左右時(shí)棄去培養(yǎng)液,用1%的PBS緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞2次,加入1 mL無血清的DMEM培養(yǎng)液。將“1.3”中收集到的各組病毒原液梯度稀釋101倍～106倍,每孔中加入200 μL病毒稀釋液,每個(gè)稀釋梯度3個(gè)重復(fù),放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待病毒吸附細(xì)胞2～3 h,棄去6孔板中培養(yǎng)液,往每孔中加入3 mL含0.4%瓊脂糖的稀釋液覆蓋細(xì)胞,培養(yǎng)72 h,10%的甲醛液固定10 min,結(jié)晶紫染色。選取噬斑清楚且便于計(jì)數(shù)的視野統(tǒng)計(jì)噬斑數(shù),計(jì)算病毒滴度。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)干擾素通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

1.5.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中IL-6、IRF3、IFN-β、SOCS3基因序列,利用Premier3.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物,引物信息見表1。引物均由華大基因有限公司合成。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因的mRNA表達(dá)水平 將試驗(yàn)設(shè)為4組:空白組(normal)、IBV組、病毒感染前加藥組(pre-treatment)、病毒感染后加藥組(post-treatment),在病毒感染細(xì)胞24 h后收集各組細(xì)胞,提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照表1設(shè)計(jì)的引物以合成的cDNA為模板,qPCR擴(kuò)增相關(guān)基因片段。PCR反應(yīng)體系20 μL: 2×TSINGKE Master qPCR Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,模板cDNA 1.0 μg ,ddH2O 補(bǔ)足總體積至20 μL。PCR反應(yīng)程序: 95 ℃ 3 min,95 ℃ 10 s,61 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.6 Western blot檢測(cè)干擾素通路相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平

試驗(yàn)分組同“1.5.2”,按照分組加入病毒和藥物。病毒感染細(xì)胞24 h后棄去培養(yǎng)液,采用一定體積RIPA與PMSF(體積比100∶1)混合液裂解各組細(xì)胞提取總蛋白,經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離,低溫下轉(zhuǎn)至PVDF膜上,采用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,TBST 清洗PVDF膜。將PVDF膜與IL-6、SOCS3、IRF3、p-IRF3、IFN-β、STAT1、p-STAT1一抗4 ℃孵育過夜,次日TBST清洗3次。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗,37 ℃條件下?lián)u床孵育2 h,TBST 清洗3次,ECL發(fā)光底液進(jìn)行顯色。

1.7 IBV對(duì)干擾素治療的敏感性分析

將重組人IFN-α(100 ng·mL-1)在病毒感染細(xì)胞2 h后加入IBV組和加藥組細(xì)胞培養(yǎng)體系中。18 h后,間接免疫熒光檢測(cè)IBV N蛋白的表達(dá),分析各組在IFN-α處理后病毒的復(fù)制情況。

1.8 間接免疫熒光檢測(cè)p-STAT1核移位

將H1299細(xì)胞接種于24孔板,按分組加入病毒和藥物。病毒感染細(xì)胞24 h后棄去培養(yǎng)液,PBS潤(rùn)洗2遍,4%多聚甲醛固定15 min,0.5% Triton-100透膜15 min。加入含3% BSA的封閉液室溫封閉1 h,滴加特異性一抗(p-STAT1,l∶200稀釋度),4 ℃過夜,PBS漂洗3次,每次5 min。滴加與第一抗體種屬匹配的熒光素標(biāo)記二抗,37 ℃避光孵育30 min,PBS漂洗3次,每次5 min,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染細(xì)胞核15～20 min,甘油磷酸緩沖液封片,熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.9 RNA干擾試驗(yàn)分析STAT1沉默對(duì)病毒復(fù)制的影響

根據(jù) GenBank中STAT1基因序列,以其mRNA轉(zhuǎn)錄本不同區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn)設(shè)計(jì)兩對(duì)STAT1 shRNA序列:pLKO.1-STAT1-1(Forwards:5′-GATCCGCAGGTTCACCAGCTTTATGATTCAAGAG-ATCATAAAGCTGGTGAACCTGCTTTT-TTG-3′,Reverses:5′-AATTCAAAAAAGCAGGTTCA-CCAGCTTTATGATCTCTTGAATCATAAAGC-TGGTGAACCTGCG-3′),pLKO.1-STAT1-2(Forwards:5′-GATCCGCTGAATGTCACTGAACTT-ACTTCAAGAGAGTAAGTTCAGTGACATTCA-GCTTTTTTG-3′,Reverses:5′-AATTCAAAAAA-GCTGAATGTCACTGAACTTACTCTCTTGAA-GTAAGTTCAGTGACATTCAGCG-3′)。用T4 DNA連接酶將載體pLKO.1和shRNA過夜連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后挑取單菌落進(jìn)行測(cè)序鑒定,將鑒定正確的菌落搖菌后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞,使用Western blot鑒定表達(dá)。用重組病毒IBV-3ab-luc分別感染正常H1299細(xì)胞和干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的H1299細(xì)胞后用黃芩苷處理,分析STAT1沉默對(duì)黃芩苷抗病毒作用的影響。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量,ImageJ軟件計(jì)算蛋白灰度值,GraphPadPrism8.0軟件繪圖,SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,組間差異采用t檢驗(yàn),結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的黃芩苷對(duì)H1299細(xì)胞活性的影響

黃芩苷按濃度500、250、125、62.5、31.3 μg·mL-1加入H1299細(xì)胞培養(yǎng)體系中,MTT法檢測(cè)不同濃度黃芩苷對(duì)細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示,黃芩苷在31.3、62.5和125 μg·mL-1濃度下對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響,細(xì)胞活性均在90%以上,而250和500 μg·mL-1濃度對(duì)H1299細(xì)胞活性具有顯著影響(圖1)。因此,選擇濃度為125 μg·mL-1的黃芩苷用于后續(xù)研究。

2.2 黃芩苷抑制IBV在Vero細(xì)胞及H1299細(xì)胞中的復(fù)制

本研究主要利用重組病毒IBV-3ab-luc研究黃芩苷對(duì)IBV的抑制作用及作用機(jī)制。采用細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE)、噬斑分析、病毒熒光值測(cè)定分析黃芩苷對(duì)IBV復(fù)制的影響。結(jié)果顯示,IBV感染H1299細(xì)胞24 h后觀察到明顯的合胞體細(xì)胞,即由病毒復(fù)制而產(chǎn)生的CPE。當(dāng)分別在病毒感染前或感染后經(jīng)黃芩苷處理后由病毒感染形成的CPE明顯減輕(圖2A)。病毒熒光值檢測(cè)顯示,感染前加藥組及感染后加藥組所測(cè)得的病毒熒光值均極顯著低于IBV組(P<0.01)(圖2B)。進(jìn)一步,將上述各試驗(yàn)組收集的病毒原液連續(xù)稀釋后接種于Vero細(xì)胞上,觀察噬斑形態(tài)并定量病毒滴度。與IBV組相比,黃芩苷處理后病毒噬斑數(shù)量、大小和病毒滴度均極顯著降低(P<0.01)(圖2C)。上述結(jié)果表明,黃芩苷在體外對(duì)IBV的復(fù)制具有明顯的抑制作用。

圖1 不同濃度的黃芩苷對(duì)H1299細(xì)胞活性影響Fig.1 Effects of different concentrations of baicalin on the viability of H1299 cells

A.不同試驗(yàn)組IBV感染后H1299細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。箭頭表示CPE;B.不同試驗(yàn)組病毒熒光值檢測(cè);C.不同試驗(yàn)組IBV感染Vero細(xì)胞后病毒噬斑形成和滴度測(cè)定。與IBV組相比,**. P<0.01A. Morphological changes of IBV-infected H1299 cells in different experimental groups. Arrows represent CPE;B. Detection of virus fluorescence value in different experimental groups;C. Virus plaque formation and titer determination of IBV-infected Vero cells in different experimental groups. Compared with IBV group,**. P<0.01圖2 黃芩苷抑制IBV在Vero細(xì)胞及H1299細(xì)胞中的復(fù)制Fig.2 Baicalin inhibits IBV replication in Vero cells and H1299 cells

2.3 黃芩苷對(duì)IBV的抑制作用呈濃度依賴性

將黃芩苷倍比稀釋成不同濃度后處理IBV感染的H1299細(xì)胞,24 h 后檢測(cè)各組病毒熒光值,分析病毒復(fù)制情況。結(jié)果顯示,黃芩苷濃度越高,病毒熒光值越低,說明黃芩苷對(duì)IBV的抑制呈濃度依賴性(圖3)。

2.4 黃芩苷上調(diào)IBV感染細(xì)胞中IRF3誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)

利用qRT-PCR和Western blot方法檢測(cè)干擾素相關(guān)基因IRF3、p-IRF3和IFN-β的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。PCR結(jié)果顯示,IBV感染會(huì)降低宿主細(xì)胞IFN-β的mRNA表達(dá)水平(P<0.05),用黃芩苷處理后,IRF3和IFN-β的mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)(圖4A)。Western blot結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,IBV組p-IRF3和IFN-β的蛋白表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01),用黃芩苷處理后,病毒感染前加藥組IRF3(P<0.05)、p-IRF3(P<0.01)和IFN-β(P<0.05)的蛋白表達(dá)水平均顯著增加,病毒感染后加藥組p-IRF3和IFN-β的蛋白表達(dá)水平也極顯著增加(P<0.01)(圖4B)。這些結(jié)果表明黃芩苷可通過IRF3途徑促進(jìn)宿主細(xì)胞內(nèi)IFN-β的表達(dá)。

圖3 不同濃度的黃芩苷對(duì)IBV抑制作用Fig.3 Inhibiting effect of IBV by baicalin with different concentration

A. qRT-PCR檢測(cè)IBV感染細(xì)胞中IRF3、IFN-β mRNA表達(dá);B. Western blot檢測(cè)IBV感染細(xì)胞中IRF3、p-IRF3和IFN-β 蛋白表達(dá)。IBV組與正常對(duì)照組相比,#.P<0.05,##.P<0.01;黃芩苷組與IBV組相比,*. P<0.05,**. P<0.01A. The mRNA expressions of IRF3 and IFN-β were detected by qRT-PCR in IBV-infected cells;B. The protein expressions of IRF3, p-IRF3 and IFN-β were detected by Western blot in IBV-infected cells. When IBV group compared with normal control group,#.P<0.05,##.P<0.01; When baicalin and ribavirin groups compared with IBV group, *. P<0.05,**. P<0.01圖4 黃芩苷上調(diào)IBV感染細(xì)胞中IRF3誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)Fig.4 Baicalin promotes IRF3-mediated IFN-β production in IBV-infected cells

2.5 黃芩苷增加了IBV對(duì)IFN治療的敏感性

用重組人IFN-α處理黃芩苷組和IBV組病毒感染的細(xì)胞后,以間接免疫熒光檢測(cè)IBV N的蛋白表達(dá)水平,分析病毒的復(fù)制情況。結(jié)果顯示,在未經(jīng)黃芩苷處理的IBV感染細(xì)胞中加入IFN-α對(duì)病毒的復(fù)制影響較小,而黃芩苷處理后再加入IFN-α,病毒復(fù)制明顯減弱(圖5)。因此,黃芩苷可以增加IBV對(duì)IFN治療的敏感性。

圖5 黃芩苷增加了IBV對(duì)干擾素治療的敏感性Fig.5 Baicalin increases the sensitivity of IBV to interferon therapy

2.6 黃芩苷促進(jìn)IBV感染細(xì)胞中STAT1的磷酸化和p-STAT1核移位

Western blot檢測(cè)STAT1及p-STAT1的蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示,STAT1總蛋白的表達(dá)在各組間差異無顯著性,而p-STAT1的表達(dá)在各組間差異具有顯著性。與正常組相比,IBV組p-STAT1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),用黃芩苷處理后,在感染前加藥組及感染后加藥組p-STAT1表達(dá)水平顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)增加(圖6A)。進(jìn)一步,間接免疫熒光分析顯示,黃芩苷處理能顯著增加p-STAT1的核移位(P<0.01)(圖6B)。因此,黃芩苷可以促進(jìn)STAT1的磷酸化和p-STAT1核移位。

2.7 黃芩苷負(fù)調(diào)控IBV感染細(xì)胞中SOCS3和IL-6的表達(dá)

SOCS3是JAK-STAT信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子,IL-6是SOCS3的刺激因子。Western blot檢測(cè)SOCS3和IL-6的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與正常組相比,IBV組SOCS3和IL-6表達(dá)水平極顯著增加(P<0.01)。用黃芩苷處理后,感染前加藥組及感染后加藥組SOCS3和IL-6表達(dá)水平均極顯著降低(P<0.01)(圖7)。因此,黃芩苷能負(fù)調(diào)控SOCS3和IL-6的表達(dá),從而拮抗SOCS3對(duì)干擾素通路的抑制作用。

2.8 STAT1沉默減弱了黃芩苷對(duì)IBV的抑制作用

用真核表達(dá)質(zhì)粒pLKO.1-STAT1轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞對(duì)STAT1進(jìn)行敲低,分析敲低STAT1對(duì)黃芩苷抗病毒作用的影響。結(jié)果顯示,敲低STAT1后再用黃芩苷處理病毒感染的細(xì)胞,與敲低前相比病毒的復(fù)制能力明顯增加,說明敲低STAT1會(huì)減弱黃芩苷的抗病毒藥理活性,從而促進(jìn)病毒復(fù)制(圖8)。

3 討 論

IB、禽流感、新城疫等由病毒感染引起的呼吸道疾病給世界范圍內(nèi)的家禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,疫苗接種是預(yù)防IBV感染和控制IB最有效的策略。然而,一些商業(yè)疫苗對(duì)異種血清型IBV毒株提供的保護(hù)作用有限[20],因此,IB的防治仍然是一個(gè)挑戰(zhàn),有必要開發(fā)一些新的有效的抗病毒策略或藥物來對(duì)抗IBV感染。中醫(yī)藥在病毒病防治方面受到了許多研究者的關(guān)注,一些有效的中藥產(chǎn)品已被用于預(yù)防或治療病毒性疾病。如蛇肝地龍顆粒聯(lián)合強(qiáng)力霉素可預(yù)防IBV感染[21];植物精油通過抑制病毒增殖和調(diào)控宿主免疫功能在肉雞中發(fā)揮抗IBV作用[22]。黃芩苷是從黃芩根中分離出的黃酮類化合物,黃酮類化合物可通過抑制病毒感染周期的不同階段發(fā)揮直接的抗病毒作用,也可通過調(diào)節(jié)宿主與病毒之間的相互作用產(chǎn)生間接抗病毒作用[23]。本研究對(duì)黃芩苷在Vero細(xì)胞和H1299細(xì)胞中對(duì)IBV的抗病毒活性進(jìn)行了評(píng)價(jià),結(jié)果顯示黃芩苷在體外對(duì)IBV的復(fù)制具有顯著的劑量依賴性抑制作用,這表明黃芩苷可能是一種潛在的用于家禽業(yè)防治IBV感染的藥物。

A. Western blot檢測(cè)IBV感染細(xì)胞中STAT1和p-STAT1蛋白表達(dá);B.間接免疫熒光分析IBV感染細(xì)胞中p-STAT1的核表達(dá)。IBV組與正常對(duì)照組相比,#.P<0.05,##.P<0.01;黃芩苷組與IBV組相比,*. P<0.05,**. P<0.01A. The protein expressions of STAT and p-STAT1 were detected by Western blot in IBV-infected cells;B. Immunofluorescence detection of p-STAT1 nuclear expression in IBV-infected cells. When IBV group compared with normal control group, #.P<0.05,##.P<0.01; When baicalin and ribavirin groups compared with IBV group, *. P<0.05,**. P<0.01圖6 黃芩苷促進(jìn)IBV感染細(xì)胞中STAT1的磷酸化和p-STAT1核移位Fig.6 Baicalin promotes STAT1 phosphorylation and nuclear translocation of p-STAT1 in IBV-infected cells

IBV組與正常對(duì)照組相比,#.P<0.05,##.P<0.01;黃芩苷組與IBV組相比,*. P<0.05,**. P<0.01 When IBV group compared with normal control group, #.P<0.05,##.P<0.01; When baicalin and ribavirin groups compared with IBV group, *. P<0.05,**. P<0.01圖7 Western blot檢測(cè)IBV感染細(xì)胞中SOCS3和IL-6蛋白的表達(dá)Fig.7 The protein expressions of SOCS3 and IL-6 were detected by Western blot in IBV-infected cells

IBV Beaudette株最初只適應(yīng)雞胚,后經(jīng)多次連續(xù)傳代適應(yīng)了雞原代腎細(xì)胞 (chicken kidney cell,CKC)和Vero細(xì)胞,進(jìn)而Vero細(xì)胞適應(yīng)株IBV經(jīng)傳代也可感染人類細(xì)胞系H1299和Huh[24]。在感染宿主細(xì)胞的過程中,IBV編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(S、E、M和N)和15種非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein,nsp)參與病毒復(fù)制、吸附、入侵和釋放[25]。吸附是病毒感染細(xì)胞的第一步,RNA病毒借助S蛋白與宿主細(xì)胞受體結(jié)合進(jìn)入宿主細(xì)胞,隨后,在S蛋白介導(dǎo)下病毒-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞融合形成合胞體細(xì)胞,即CPE,CPE形成是病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞并向鄰近細(xì)胞傳播感染的必要條件[26]。在本研究中,IBV感染Vero細(xì)胞和H1299細(xì)胞后觀察到明顯的CPE形成,隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng),CPE逐漸蔓延至幾乎整個(gè)單層細(xì)胞。在黃芩苷處理后,IBV感染細(xì)胞中CPE的形成顯著降低,與此同時(shí),病毒噬斑數(shù)量也減少。這提示,黃芩苷可抑制IBV感染后S蛋白介導(dǎo)的合胞體細(xì)胞的形成,阻止病毒向鄰近細(xì)胞的傳播,抑制IBV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。有報(bào)道顯示,黃酮類化合物可通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制S蛋白與宿主細(xì)胞受體結(jié)合從而阻止病毒吸附進(jìn)入宿主細(xì)胞[27-28]。本研究中,黃芩苷在IBV感染前預(yù)處理對(duì)病毒復(fù)制也起到抑制作用,該抑制作用是否與阻止病毒吸附進(jìn)入宿主細(xì)胞有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

干擾素作為主要的抗病毒分子,在宿主被病毒感染的靶細(xì)胞和器官中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,限制病毒的傳播。然而,冠狀病毒已經(jīng)進(jìn)化出多種策略拮抗宿主的先天免疫反應(yīng),為病毒復(fù)制創(chuàng)造有利的環(huán)境。SARS-CoV、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)和IBV的結(jié)構(gòu)蛋白(M和N)、非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp1和nsp3)以及輔助蛋白均可以作為IFN拮抗劑,抑制宿主天然免疫反應(yīng)[29-31]。此外,IBV可通過抑制STAT1的磷酸化和核移位阻斷干擾素下游信號(hào)通路,促進(jìn)病毒復(fù)制[32]。因此,研究病毒與宿主之間的互作并尋找有效的干預(yù)措施對(duì)冠狀病毒相關(guān)疾病的防治也至關(guān)重要。本研究在對(duì)黃芩苷抗病毒的作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn)黃芩苷處理上調(diào)了宿主細(xì)胞IFN-β的表達(dá),增加了IBV對(duì)干擾素治療的敏感性,提示黃芩苷對(duì)IBV的抑制作用與干擾素通路的調(diào)控有關(guān)。隨后對(duì)干擾素下游的STAT信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn),干擾素介導(dǎo)的STAT1磷酸化在黃芩苷處理組的感染細(xì)胞中顯著增加。磷酸化是干擾素誘導(dǎo)STAT1核移位的關(guān)鍵步驟,只有p-STAT1才能與STAT2和IRF9結(jié)合形成干擾素刺激基因因子3 (interferon stimulator gene factor 3,ISGF3),ISGF3轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核后,結(jié)合到ISG啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)的干擾素刺激應(yīng)答元件上,啟動(dòng)ISG的轉(zhuǎn)錄[33],發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。作者的研究也證實(shí)了黃芩苷處理后p-STAT1核移位增加。因此,黃芩苷影響IBV對(duì)干擾素治療的敏感性與其促進(jìn)STAT1磷酸化和p-STAT1核移位有關(guān)。利用RNA干擾技術(shù)對(duì)STAT1進(jìn)行沉默后發(fā)現(xiàn),STAT1沉默減弱了黃芩苷對(duì)IBV的抑制作用,這進(jìn)一步說明,黃芩苷對(duì)IBV的抑制作用與STAT1通路的調(diào)控有關(guān)。綜上所述,黃芩苷可通過誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生并進(jìn)一步激活干擾素下游的信號(hào)通路而發(fā)揮抗病毒作用(圖9)。

細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)是SOCS家族的重要分子之一,可以通過負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制抑制JAK-STAT信號(hào)通路,在病毒免疫逃避中發(fā)揮重要作用[34]。SOCS3的表達(dá)受多種炎癥因子的調(diào)控,其中IL-6是主要因子之一,IL-6可通過激活STAT3誘導(dǎo)SOCS1和SOCS3基因表達(dá)[35]。在本研究中,黃芩苷處理顯著下調(diào)了宿主細(xì)胞SOCS3和 IL-6蛋白表達(dá)水平,這說明,黃芩苷不僅能正向調(diào)控干擾素信號(hào)通路,同時(shí)也能負(fù)調(diào)控干擾素信號(hào)通路的抑制因子,通過不同途徑促進(jìn)宿主天然免疫反應(yīng),抑制IBV復(fù)制(圖9)。

圖9 黃芩苷抗IBV作用的分子機(jī)制Fig.9 The molecular mechanism for the anti-IBV properties of baicalin

4 結(jié) 論

黃芩苷可通過誘導(dǎo)宿主細(xì)胞Ⅰ型干擾素產(chǎn)生、激活干擾素下游信號(hào)通路而抑制IBV復(fù)制,減輕病毒感染對(duì)細(xì)胞造成的免疫損傷。該研究為尋找抗IBV的天然藥物提供了新的思路。