秦士貞,楊敏敏,任志雄,李金錄,唐德富,史兆國(guó)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州 730070)

動(dòng)物腸道是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要場(chǎng)所,也是全身最大的免疫器官,腸道健康與動(dòng)物生產(chǎn)性能的優(yōu)劣和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益息息相關(guān)[1]。動(dòng)物生產(chǎn)中使用的約70%～80%的治療性抗生素被用于治療腸道疾病。因此,維持良好的腸道健康是現(xiàn)代動(dòng)物生產(chǎn)中的主要挑戰(zhàn)。肉雞高密度集約化的養(yǎng)殖方式加之其膽小易受驚嚇的生理特征導(dǎo)致機(jī)體易產(chǎn)生免疫應(yīng)激,引起腸道上皮細(xì)胞破損,腸道形態(tài)發(fā)生改變、腸道通透性增加以及腸道黏膜屏障受損,破壞腸道健康,進(jìn)而影響肉雞生產(chǎn)[2]?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis,BS)是一種能夠產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子的需氧革蘭陽(yáng)性菌[3],是我國(guó)允許在飼料端直接飼喂的飼用益生菌之一,具有極強(qiáng)的抗逆性及較高的穩(wěn)定性,能很好的在腸道中存活、定植[4]。研究表明,枯草芽孢桿菌作為一種優(yōu)質(zhì)、安全且目前應(yīng)用最廣泛的飼用益生菌之一,具有提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、增強(qiáng)機(jī)體免疫及抗氧化功能、緩解熱應(yīng)激和維護(hù)家禽腸道健康等多種功能[5-6]。研究表明,在飼糧中添加BS可以改善肉雞生長(zhǎng)性能,提高肉雞平均日增重、降低料肉比,在熱應(yīng)激條件下,BS可以促進(jìn)老化腸黏膜的恢復(fù)和修復(fù)[7-8]。本實(shí)驗(yàn)室前期采用生產(chǎn)中常見(jiàn)的應(yīng)激源脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)構(gòu)建肉雞應(yīng)激模型,研究了BS對(duì)生產(chǎn)性能等指標(biāo)的影響,結(jié)果表明,在免疫應(yīng)激條件下,肉雞飼糧中添加BS可緩解應(yīng)激造成的肉仔雞生長(zhǎng)性能降低,改善血清抗氧化性能,抑制血清炎性細(xì)胞因子含量的增加,進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫力,從而減輕應(yīng)激對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成的損傷[9]。本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上,繼續(xù)利用LPS建立應(yīng)激模型,進(jìn)一步研究飼糧中添加BS對(duì)腸道免疫因子、腸道形態(tài)以及腸道屏障相關(guān)基因表達(dá)的影響,旨在探究BS對(duì)肉仔雞腸道的保護(hù)作用,為BS在家禽生產(chǎn)中預(yù)防及緩解應(yīng)激的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

BS(活菌數(shù)≥5.0×109CFU·g-1)購(gòu)自福建中基生物工程有限公司;LPS(來(lái)源于大腸桿菌,血清型O55:B5)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;1日齡愛(ài)拔益加(AA)肉雞購(gòu)自西安大成禽業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

采用2×2兩因子安排的完全隨機(jī)設(shè)計(jì),兩因子分別為:日糧處理(基礎(chǔ)日糧或基礎(chǔ)日糧添加200 g·t-1BS的試驗(yàn)日糧)和應(yīng)激處理(口腔灌服LPS或等量生理鹽水)。即試驗(yàn)分為:1)基礎(chǔ)日糧+生理鹽水組;2)基礎(chǔ)日糧+LPS組;3)試驗(yàn)日糧+生理鹽水;4)試驗(yàn)日糧+LPS組。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及管理

選用1日齡愛(ài)拔益加(AA)肉雞240只(公母各半),隨機(jī)分成4個(gè)處理組,每個(gè)處理6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10只雞。試驗(yàn)采用3層籠養(yǎng),分3個(gè)階段:包括應(yīng)激前期(第1～14天)、LPS應(yīng)激期(第15～21天)和恢復(fù)期(第22～28天),為期28 d。于試驗(yàn)第14、16、18、20天早晨8:00空腹,對(duì)基礎(chǔ)日糧和試驗(yàn)日糧組其中的一半肉仔雞用注射器進(jìn)行口腔灌服LPS溶液(500 μg·kg-1BW),同時(shí)對(duì)基礎(chǔ)日糧和試驗(yàn)日糧組中另外一半肉仔雞用注射器進(jìn)行口腔灌服等量的生理鹽水。飼養(yǎng)管理和常規(guī)免疫按照《AA肉仔雞飼養(yǎng)管理手冊(cè)》進(jìn)行。采用24 h恒定光照,雞只自由采食、飲水。按照常規(guī)免疫程序定期進(jìn)行免疫接種。

1.4 試驗(yàn)日糧

基礎(chǔ)日糧參照NRC(1994)和《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)配制玉米-豆粕型日糧,其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.5 樣品采集

分別于試驗(yàn)第21和28日齡,從每個(gè)處理組隨機(jī)選取6只雞(公母各半,每重復(fù)1只雞)。頸部放血處死,迅速剖開(kāi)腹腔,分離出十二指腸、空腸和回腸,分別取各腸段中段約1～2 cm,用生理鹽水將腸道內(nèi)食糜沖洗干凈,放入4%的多聚甲醛溶液中固定保存,將固定好的腸道組織送至武漢塞維爾生物科技有限公司制作組織切片,組織切片的制作參考孫曉[10]的方法。同時(shí),取剩余的十二指腸、空腸和回腸,用生理鹽水沖洗腸道食糜內(nèi)容物,冰浴上用滅菌的載玻片刮取腸黏膜放于無(wú)RNA酶的凍存管中,放入液氮中暫存,之后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存,用于測(cè)定mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.6.1 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)測(cè)定 將制作好的組織切片放置在顯微鏡下,每張切片選取走向良好的6個(gè)視野,采用Motic-BA210Digital數(shù)碼顯微鏡測(cè)量絨毛高度(VH)和隱窩深度(CD),并計(jì)算絨毛高度與隱窩深度的比值(V/C)。

1.6.2 腸道組織中免疫相關(guān)因子以及腸道屏障相關(guān)基因mRNA測(cè)定 按試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)步驟提取各腸道總RNA,用微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(NanoDrop2000)測(cè)定RNA濃度和純度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT re-agent Kitwith gDNA Eraser)說(shuō)明書(shū)對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中備用。利用Light Cycler 480Ⅱ Systems熒光定量基因擴(kuò)增儀,采用SYBR GreenI染料法,以肌動(dòng)蛋白(beta actin,β-actin)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為雙內(nèi)參,參照SYBR? Green ProTaq HS預(yù)混型qPCR試劑盒(湖南艾克瑞生物工程有限公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,用2-△△Ct法計(jì)算基因表達(dá)量。目的基因?yàn)?白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis actor-α,TNF-α);白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6);白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10);Toll樣受體4 (Toll like rececptor 4,TLR4);髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88);核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa,NF-κB);閉鎖蛋白(Occludin);緊密連接蛋白1(Zonulaoccludons-1,ZO-1);閉合蛋白1(Claudin-1);黏蛋白2(MUC2),引物序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,詳見(jiàn)表2。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行初步整理,利用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件中的一般線性模型(general linear models, GLM)進(jìn)行兩因子方差分析,每個(gè)重復(fù)作為1個(gè)試驗(yàn)單元,主效應(yīng)包括飼糧和LPS應(yīng)激以及兩者互作。方差分析差異顯著時(shí)用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,所有數(shù)據(jù)均以P<0.05作為顯著性檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn),試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示。

2 結(jié) 果

2.1 BS對(duì)LPS肉仔雞腸道中免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

2.1.1 BS對(duì)LPS應(yīng)激肉仔雞十二指腸中免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響 由表3可知,在第21天,日糧添加BS與LPS應(yīng)激對(duì)肉仔雞十二指腸IL-1β、TLR4 mRNA的表達(dá)量有顯著的交互作用(P<0.05)。無(wú)LPS應(yīng)激條件下,與基礎(chǔ)日糧組相比,日糧添加BS對(duì)IL-1β、TLR4 mRNA的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P> 0.05);而在LPS應(yīng)激條件下,BS日糧組顯著下調(diào)了IL-1β和TLR4 mRNA的表達(dá)量(P<0.05)。LPS應(yīng)激顯著提高了IL-6、TNF-α、NF-κB、MyD88 mRNA的表達(dá)(P<0.05)。由表4可知,在第28天,日糧添加BS與LPS應(yīng)激對(duì)基因TLR4和NF-κBmRNA的表達(dá)有顯著交互作用(P<0.05)。在無(wú)LPS應(yīng)激條件下,與基礎(chǔ)日糧組相比,BS日糧組對(duì)TLR4和NF-κBmRNA的表達(dá)量無(wú)顯著影響(P> 0.05);在LPS應(yīng)激條件下,BS日糧組顯著降低了TLR4和NF-κBmRNA的表達(dá)(P<0.05)。LPS應(yīng)激顯著增加了TNF-αmRNA的表達(dá)量(P<0.05)。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

2.1.2 BS對(duì)LPS應(yīng)激肉仔雞空腸中免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響 由表5可知,在第21天,日糧中添加BS與LPS應(yīng)激對(duì)空腸MyD88 mRNA的表達(dá)有顯著的交互作用(P<0.05)。在無(wú)LPS應(yīng)激條件下,與基礎(chǔ)日糧組相比,日糧中添加BS對(duì)MyD88 mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05);在LPS應(yīng)激條件下,BS日糧組中MyD88 mRNA的表達(dá)量著降低(P<0.05)。LPS應(yīng)激顯著增加了IL-1β、TNF-α、NF-κBmRNA的表達(dá)豐度(P<0.05)。由表6可知,在試驗(yàn)第28天,BS日糧與LPS應(yīng)激及兩者交互作用對(duì)空腸中免疫相關(guān)因子mRNA的表達(dá)均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

2.1.3 BS對(duì)LPS應(yīng)激肉仔雞回腸中免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響 由表7可知,在第21天,BS日糧與LPS應(yīng)激對(duì)回腸TNF-αmRNA的表達(dá)有明顯的交互作用(P<0.05)。在無(wú)LPS應(yīng)激條件下,基礎(chǔ)日糧組添加BS對(duì)TNF-αmRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05);在LPS應(yīng)激條件下,BS日糧顯著下調(diào)了TNF-αmRNA的表達(dá)(P<0.05)。LPS應(yīng)激顯著提高了IL-1β、NF-κB和MyD88 mRNA的表達(dá)量(P<0.05)。由表8可知,在第28天,BS日糧與LPS應(yīng)激以及兩者交互作用對(duì)回腸中免疫相關(guān)基因mRNA的表達(dá)均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表3 枯草芽孢桿菌對(duì)脂多糖應(yīng)激肉仔雞第21天十二指腸中免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響Table 3 Effects of Bacillus subtilis on expression levels of immune related genes in duodenum of broilers challenged with lipopolysaccharide at 21st day

表4 枯草芽孢桿菌對(duì)脂多糖應(yīng)激肉仔雞第28天十二指腸中免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響Table 4 Effects of Bacillus subtilis on expression levels of immune related genes in duodenum of broilers challenged with lipopolysaccharide at 28th day

表5 枯草芽孢桿菌對(duì)脂多糖應(yīng)激肉仔雞第21天空腸中免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響

表6 枯草芽孢桿菌對(duì)脂多糖應(yīng)激肉仔雞第28天空腸中免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響Table 6 Effects of Bacillus subtilis on expression levels of immune related genes in jejunum of broilers challenged with lipopolysaccharide at 28th day

2.2 BS對(duì)LPS應(yīng)激肉仔雞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 BS對(duì)LPS應(yīng)激肉仔雞十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 由表9可知,在第21天,日糧中添加BS與LPS應(yīng)激對(duì)十二指腸VH及V/C的比值有顯著性交互作用(P<0.05)。無(wú)論有無(wú)LPS應(yīng)激,與基日糧組相比,日糧中添加BS可顯著提高VH及V/C的比值(P<0.05)。LPS應(yīng)激顯著增加了CD(P<0.05)。在第28天,BS日糧與LPS應(yīng)激對(duì)VH、CD及V/C的比值均無(wú)顯著性交互作用(P>0.05)。與基礎(chǔ)日糧組相比,BS日糧顯著提高了VH及V/C的比值(P<0.05)。LPS應(yīng)激顯著降低VH及V/C的比值(P<0.05)。BS和LPS對(duì)CD均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表7 枯草芽孢桿菌對(duì)脂多糖應(yīng)激肉仔雞第21天回腸免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響

表8 枯草芽孢桿菌對(duì)脂多糖應(yīng)激肉仔雞第28天回腸免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響Table 8 Effects of Bacillus subtilis on expression levels of immune related genes in ileum of broilers challenged with lipopolysaccharide at 28th day

2.2.2 BS對(duì)LPS應(yīng)激肉仔雞空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 由表10可知,在第21天,BS日糧與LPS應(yīng)激對(duì)空腸CD有顯著性交互作用(P<0.05)。在無(wú)LPS應(yīng)激條件下,BS日糧組空腸的CD顯著的低于基礎(chǔ)日糧組(P<0.05);在LPS應(yīng)激條件下,基礎(chǔ)日糧組添加BS對(duì)CD無(wú)顯著影響(P>0.05)。與基礎(chǔ)日糧組相比,BS日糧組顯著提高了VH和V/C的比值(P<0.05)。LPS應(yīng)激顯著降低了VH和V/C的比值(P<0.05)。在第28天,BS日糧與LPS應(yīng)激對(duì)VH和V/C的比值有顯著的交互作用(P<0.05)。在無(wú)LPS應(yīng)激條件下,BS日糧組與基礎(chǔ)日糧對(duì)VH和V/C的比值均無(wú)顯著影響(P>0.05);在LPS應(yīng)激條件下,BS日糧組較基礎(chǔ)日糧組顯著增加了VH和V/C的比值(P<0.05)。

表9 枯草芽孢桿菌對(duì)脂多糖應(yīng)激肉仔雞十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Table 9 Effects of Bacillus subtilis on intestinal morphology in duodenal of broilers challenged with lipopolysaccharide

表10 枯草芽孢桿菌對(duì)脂多糖應(yīng)激肉仔雞空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Table 10 Effects of Bacillus subtilis on intestinal morphology in jejunum of broilers challenged with lipopolysaccharide

2.2.3 BS對(duì)脂多糖應(yīng)激肉仔雞回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 由表11可知,在第21天,BS日糧與LPS應(yīng)激對(duì)回腸VH、CD和V/C的比值均無(wú)顯著交互作用(P>0.05)。LPS應(yīng)激顯著降低了VH和V/C的比值(P<0.05),對(duì)CD無(wú)顯著影響(P>0.05)。在第28天,BS日糧與LPS應(yīng)激及兩者互作對(duì)VH、CD和V/C的比值均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表11 枯草芽孢桿菌對(duì)脂多糖應(yīng)激肉仔雞回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Table 11 Effects of Bacillus subtilis on intestinal morphology in ileum of broilers challenged with lipopolysaccharide

2.3 BS對(duì)LPS應(yīng)激肉仔雞腸道屏障相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3.1 BS對(duì)LPS應(yīng)激肉仔雞十二指腸緊密連接蛋白mRNA表達(dá)的影響 由表12可知,在整個(gè)試驗(yàn)期,BS日糧與LPS應(yīng)激對(duì)十二指腸Claudin-1、Occludin、ZO-1和MUC2 mRNA的表達(dá)量均無(wú)顯著交互作用(P>0.05)。在第21天,與基礎(chǔ)日糧組相比,BS日糧顯著提高了Occludin、ZO-1的mRNA的表達(dá)量(P<0.05)。LPS應(yīng)激顯著降低了Claudin-1、Occludin、ZO-1和MUC2的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。在第28天,BS日糧與LPS應(yīng)激以及兩者交互對(duì)上述指標(biāo)均無(wú)顯著性影響(P>0.05)。

表12 枯草芽孢桿菌對(duì)脂多糖應(yīng)激肉仔雞十二指腸緊密連接蛋白mRNA表達(dá)量的影響Table 12 Effects of Bacillus subtilis on gene expression of intestinal barrier in duodenal of broilers challenged with lipopolysaccharide

2.3.2 BS對(duì)LPS應(yīng)激肉仔雞空腸緊密連接蛋白mRNA表達(dá)的影響 由表13可知,在整個(gè)試驗(yàn)期,BS日糧與LPS應(yīng)激對(duì)空腸Claudin-1、Occludin、ZO-1和MUC2 mRNA的表達(dá)量無(wú)顯著交互作用(P>0.05)。在第21天,BS日糧組較基礎(chǔ)日糧組顯著提高了Occludin、ZO-1和MUC2 mRNA的表達(dá)量(P<0.05),對(duì)Claudin-1 mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05)。LPS應(yīng)激顯著降低了Claudin-1、Occludin、ZO-1和MUC2 mRNA的表達(dá)量(P<0.05)。在第28天,在LPS應(yīng)激下,肉雞空腸中MUC2 mRNA的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

表13 枯草芽孢桿菌對(duì)脂多糖應(yīng)激肉仔雞空腸緊密連接蛋白mRNA表達(dá)量的影響Table 13 Effects of Bacillus subtilis on gene expression of intestinal barrier in jejunum of broilers challenged with lipopolysaccharide

2.3.3 BS對(duì)LPS應(yīng)激肉仔雞回腸緊密連接蛋白mRNA表達(dá)的影響 由表14可知,在整個(gè)試驗(yàn)期,BS日糧與LPS應(yīng)激兩者的交互作用對(duì)回腸黏膜Claudin-1、Occludin、ZO-1和MUC2 mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05)。在第21天,LPS應(yīng)激顯著下調(diào)了Claudin-1、Occludin、ZO-1和MUC2 mRNA的表達(dá)量(P<0.05)。在第28天,ZO-1 mRNA的表達(dá)量在BS日糧組中顯著高于基礎(chǔ)日糧組(P<0.05)。LPS應(yīng)激對(duì)上述指標(biāo)無(wú)顯著影響(P>0.05)。

3 討 論

3.1 BS對(duì)LPS應(yīng)激肉仔雞腸道免疫相關(guān)基因的影響

研究表明,LPS可通過(guò)增加促炎細(xì)胞因子的水平使肉仔雞處于免疫應(yīng)激狀態(tài)[11]。大量研究表明,LPS應(yīng)激顯著提高肉雞腸道IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)量[12-15]。李昆[16]研究發(fā)現(xiàn),LPS應(yīng)激顯著提高了肉仔雞十二指腸、空腸中TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOSmRNA的表達(dá)量,顯著提高了回腸中MyD88、NF-κB、IL-1β、IL-6、iNOSmRNA的表達(dá)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在LPS應(yīng)激條件下,肉仔雞十二指腸、空腸和回腸中IL-1β、TNF-α、NF-κB、MyD88以及十二指腸IL-1β和TLR-4 mRNA的表達(dá)量均顯著升高,而飼糧中添加BS顯著降低了上述基因的表達(dá),這表明飼糧中添加BS可抑制LPS應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。其原因可能是BS作為非特異性的免疫因子,在體內(nèi)具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性,可以激活巨噬/單核細(xì)胞,刺激宿主建立完整的免疫系統(tǒng)[6]。TLR4是一種模式識(shí)別受體,可識(shí)別多種病原體相關(guān)的分子模式,啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,激活體內(nèi)NF-κB途徑,介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子基因表達(dá),進(jìn)而使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在LPS應(yīng)激條件下,TLR4在十二指腸中過(guò)表達(dá),TLR4下游信號(hào)分子MyD88和NF-κB在不同腸道中的表達(dá)量也顯著升高,導(dǎo)致腸道中炎性物質(zhì)增多,造成腸道損傷,這一結(jié)果與上述研究一致。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),在LPS應(yīng)激條件下,日糧中添加BS顯著降低了TLR4、MyD88和NF-κB基因的過(guò)表達(dá),且BS日糧與LPS應(yīng)激對(duì)不同腸道中免疫相關(guān)基因的表達(dá)量均有顯著的交互作用,說(shuō)明BS通過(guò)抑制TLR4的過(guò)表達(dá),抑制了LPS與跨膜受體的結(jié)合,使LPS不能將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi),無(wú)法介導(dǎo)其下游信號(hào)通路激活,進(jìn)而減少對(duì)機(jī)體造成損傷。此外,芽孢桿菌可以改善腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境,增強(qiáng)腸道屏障功能,減少腸道中內(nèi)外抗原,降低抗原(如LPS)與炎癥通路上的特異性受體TLR4結(jié)合,減少TLR4的活化,進(jìn)而抑制NF-κB核移位誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子,減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生[17-19]。

3.2 BS對(duì)LPS應(yīng)激肉仔雞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

LPS應(yīng)激會(huì)造成腸黏膜損傷,包括組織形態(tài)發(fā)生改變,如腸絨毛萎縮、隱窩深度增加以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和腸道通透性增加[20-21]。馮焱等[22]研究發(fā)現(xiàn),肉雞在LPS應(yīng)激條件下,十二指腸、空腸和回腸VH以及V/C的比值顯著降低,CD顯著增加。李悅等[23]研究也發(fā)現(xiàn),LPS應(yīng)激能夠損傷肉仔雞腸黏膜,表現(xiàn)為空腸和回腸的VH以及V/C比值降低,CD加深。本研究結(jié)果表明,LPS應(yīng)激顯著降低了21、28 d十二指腸和空腸中VH以及V/C的比值,降低了21 d回腸VH及V/C的比值,且增加了十二指腸CD。本研究結(jié)果與上述報(bào)道一致,表明LPS應(yīng)激破壞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu),腸道絨毛的生長(zhǎng)發(fā)育以及機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收功能也隨之受到影響。BS能夠促進(jìn)腸道絨毛發(fā)育,增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與腸道的接觸面積,提高動(dòng)物機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力,還能有效地提高抗感染能力,可有效維護(hù)腸道健康[24-26]。本研究發(fā)現(xiàn),在應(yīng)激條件下,日糧中添加BS顯著提高了21 d十二指腸和28 d空腸VH及V/C的比值,表明日糧中添加BS可以改善應(yīng)激造成的腸道組織結(jié)構(gòu)損傷,促進(jìn)腸道絨毛的生長(zhǎng)發(fā)育,維護(hù)腸道黏膜的完整性。

3.3 BS對(duì)LPS應(yīng)激肉仔雞腸道屏障功能的影響

腸道健康是機(jī)體健康的前提,是動(dòng)物機(jī)體發(fā)揮生產(chǎn)潛能的關(guān)鍵。在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中,改善其腸道屏障功能和維持腸道健康是提高生產(chǎn)水平的根本保障。腸道機(jī)械屏障主要由腸上皮細(xì)胞和連接復(fù)合物組成[27-28],是維持腸上皮細(xì)胞通透性及其屏障功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[29]。腸上皮細(xì)胞間的緊密連接由Claudins、Occludin、ZO以及連接黏附分子(JAM)構(gòu)成[30]。ZO是支撐與維持緊密連接結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ),參與連接跨膜蛋白、物質(zhì)轉(zhuǎn)用以及信號(hào)傳遞的作用;Claudin-1和Occludin是跨膜蛋白家族的主要蛋白,Claudin-1對(duì)腸道通透性的穩(wěn)定起著重要作用,Occludin主要參與維持緊密連接的穩(wěn)定性[31]。LPS應(yīng)激能夠增加腸黏膜上皮細(xì)胞間的通透性,破壞緊密連接蛋白之間的結(jié)構(gòu)和功能,緊密連接蛋白表達(dá)降低,腸黏膜屏障受損。LPS作為應(yīng)激源刺激機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激,機(jī)體通過(guò)MyD88信號(hào)通路激活NF-κB,大量的炎性細(xì)胞因子釋放于機(jī)體,腸道緊密連接蛋白表達(dá)下降,進(jìn)而導(dǎo)致腸道黏膜屏障功能受損[32]。在肉雞試驗(yàn)上,研究發(fā)現(xiàn),LPS應(yīng)激能夠降低空腸和回腸黏膜Claudin-1、Occludin、ZO-1基因的表達(dá)[33-34]。同樣的,在仔豬試驗(yàn)上也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果,康保聚等[35]研究發(fā)現(xiàn),LPS應(yīng)激降低了仔豬十二指腸和空腸黏膜ZO-1、Claudin-1和OccludinmRNA的表達(dá)豐度,降低了空腸黏膜Occludin、Claudin-1 mRNA 的表達(dá)豐度。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),LPS應(yīng)激顯著降低了十二指腸、空腸和回腸黏膜Claudin-1、Occludin、ZO-1以及MUC2 mRNA的表達(dá)量。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。日糧中添加BS可顯著提高羅斯肉雞腸道緊密連接蛋白的表達(dá),緩解LPS應(yīng)激對(duì)腸道屏障的破壞。類似的研究也表明,日糧中添加鼠李糖桿菌MLGA可顯著提高回腸緊密連接蛋白的表達(dá)[34]。本試驗(yàn)中,飼糧中添加BS未能緩解LPS應(yīng)激引起的腸道緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào),造成這一差異的原因可能是肉雞的品種、BS的添加量不同所致,亦或是芽孢桿菌的菌種或菌株功能差異引起[36]。

4 結(jié) 論

日糧添加BS可顯著降低LPS應(yīng)激誘導(dǎo)的小腸促炎細(xì)胞因子的表達(dá),降低緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1和MUC2 mRNA的表達(dá)量,增加了腸絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度的比值,有效緩解了免疫應(yīng)激對(duì)腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷,促進(jìn)了小腸的生長(zhǎng)發(fā)育,維持了腸道的健康。