張祺琪,王俊梅,岳子奇,郭逸芯,施麗媛,張曉紅,鄒華圍,彭全輝,薛 白, 王立志,王之盛,胡 瑞

(四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所 肉用牛低碳養(yǎng)殖創(chuàng)新團隊 四川省牛低碳養(yǎng)殖與安全生產(chǎn)高校重點實驗室, 成都 611130)

牦牛是青藏高原優(yōu)勢畜種,是當?shù)刂饕男竽廉a(chǎn)業(yè),也是農(nóng)牧民重要經(jīng)濟收入來源。高原牧區(qū)漫長而嚴寒的冷季使得飼草料缺乏,牦牛在冷季時因饑餓造成生長性能降低和生長發(fā)育遲緩,牧民損失大,養(yǎng)殖生產(chǎn)效益低[1-2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),生長遲緩牦牛的瘤胃液和血液中LPS濃度高于正常牦牛,瘤胃上皮補體C3、TNF-α等免疫炎癥相關因子表達高于正常牦牛,其存在炎癥反應,導致瘤胃上皮屏障功能受損、營養(yǎng)物質轉運吸收受阻,生長遲緩牦牛飼料轉化率較正常牦牛組降低38.1%[3-4]。補飼活性酵母、谷氨酰胺緩解瘤胃上皮炎癥反應可增強上皮屏障功能,顯著促進生長遲緩牦牛補償生長[5]。瘤胃是反芻動物營養(yǎng)消化、吸收代謝和免疫的重要器官[6]。瘤胃健康是反芻動物高效養(yǎng)殖的基礎,細胞ATP生成可為瘤胃上皮細胞增殖、屏障功能、營養(yǎng)轉運等提供能量,瘤胃上皮細胞含有高密度線粒體,能量代謝旺盛[7]。Kong等[8]研究表明,肉牛增重速度、飼料轉化率與瘤胃上皮細胞線粒體氧化磷酸化功能基因表達呈顯著正相關。因此,高效的ATP生成是瘤胃上皮發(fā)育和功能健康的基礎,但LPS誘導炎癥反應是否抑制牦牛瘤胃上皮細胞ATP生成尚不清楚。

細胞內補體系統(tǒng)是響應LPS等免疫原啟動免疫炎癥反應和調控細胞能量代謝的重要系統(tǒng)。補體(complement)長期以來被認為是由肝分泌進入血液和淋巴液循環(huán)的一類蛋白。當細菌、病毒、內毒素(LPS)等外源抗原進入血液,首先被宿主抗體識別、結合后誘導血液中補體C3激活,C3蛋白分子被血液中轉化裂解酶(convertase)裂解為過敏毒素(anaphylatoxin, C3a)和調理素(opsonin, C3b)活性肽段,進而激活下游補體成分級聯(lián)反應,發(fā)揮激活免疫細胞、降解抗原蛋白、誘發(fā)炎癥等免疫作用。近年研究發(fā)現(xiàn),免疫細胞(人T細胞、淋巴細胞)和非免疫細胞(人腸上皮細胞[9]、人視網(wǎng)膜上皮細胞[10]、小鼠脂肪細胞[11]等)均可合成補體C3蛋白,其通過細胞內源組織蛋白酶(cathepsin)完成補體C3細胞內激活和自分泌并直接作用于細胞信號通路,除了參與細胞免疫炎癥反應,還可調控細胞脂肪代謝、糖酵解等能量代謝過程[9]。并基于免疫細胞研究提出了細胞內補體-能量代謝調控軸[12]。Wang等[13]和本課題組Hu等[1]通過轉錄組測序發(fā)現(xiàn),奶牛和牦牛瘤胃上皮存在補體C3基因表達,但瘤胃上皮細胞作為非免疫細胞是否存在LPS刺激下依賴組織蛋白酶的細胞內補體C3激活尚不清楚,由LPS誘導的炎癥是否抑制瘤胃上皮細胞ATP生成亦不清楚,因此,本研究利用不同濃度LPS誘導牦牛瘤胃上皮細胞建立炎癥模型,考察LPS對牦牛瘤胃上皮細胞補體C3激活關鍵酶、激活產(chǎn)物C3a和C3b濃度等的影響,以及細胞ATP生成的影響,為牦牛瘤胃上皮健康調控提供數(shù)據(jù)支撐和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

牦牛瘤胃上皮細胞選自本課題組前期分離并構建的永生化牦牛瘤胃上皮細胞系[14];1640培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%的EDTA胰酶購自上海Gibco公司,LPS(大腸桿菌)購自美國Sigma公司,CCK-8試劑盒購自成都Oriscience公司,牛(Bovine)白細胞介素6(IL-6)、牛(Bovine)白細胞介素1β(IL-1β)、牛(Bovine)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、牛(Bovine)補體片段3a(C3a)、牛(Bovine)補體片段3b(C3b)和牛(Bovine)檸檬酸(CA) ELISA檢測試劑盒購自重慶博諾恒生物科技有限公司,SteadyPuer快速RNA提取試劑盒和SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司,Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SurperMix for qPCR試劑盒購自上海Yeasen生物公司,DAPI染色液、Mito-Tracker Red CMXRos和增強型線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購自上海碧云天生物公司。

1.2 牦牛瘤胃上皮細胞復蘇與培養(yǎng)

選取凍存牦牛瘤胃上皮細胞在37 ℃水浴鍋中快速融化,1 000 r·min-1離心3 min,棄上清。加入1 mL完全培養(yǎng)基(89% 1640培養(yǎng)基+1%三抗+10%胎牛血清)重懸后接種于25 cm2細胞瓶,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至細胞密度為90%以上時,消化后傳代。

1.3 LPS誘導牦牛瘤胃上皮細胞炎癥模型建立

將消化離心后的牦牛瘤胃上皮細胞計數(shù)并調整細胞濃度為104·mL-1按100 μL·孔-1的細胞懸液接種于96孔板,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h,棄上清,用PBS洗2遍。分別加入100 μL·孔-1LPS溶液(89% 1640培養(yǎng)基+1%三抗+10%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋至10、20、40、80、160 μg·mL-1),以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)牦牛瘤胃上皮細胞為對照組,另以只含有完全培養(yǎng)基的孔為空白組,每個處理設置6個重復,處理細胞24 h。采用CCK-8試劑盒檢測細胞存活率,初步篩選誘導牦牛瘤胃上皮細胞炎癥模型LPS的濃度。

1.4 ELISA法測定相關指標

將消化離心后的牦牛瘤胃上皮細胞按照合適密度接種于6孔板中,待細胞融合至80%～90%時,分別加入2 mL·孔-1LPS溶液(89% 1640培養(yǎng)基+1%三抗+10%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋至0、10、20、40、80、160 μg·mL-1),其中0 μg·mL-1為對照組,每個處理設置6個重復,處理細胞24 h。收集各孔細胞上清和細胞,用于后續(xù)ELISA檢測 IL-6、IL-1β、TNF-α、C3a和C3b的含量,具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.5 RNA提取和qPCR

1.5.1 RNA提取和cDNA合成 收集的細胞樣采用SteadyPure快速RNA提取試劑盒提取細胞總RNA,利用紫外分光光度計測定其濃度以及純度(OD260 nm/OD280 nm≥ 1.8),檢驗合格后,取10 μL總RNA,按照逆轉錄試劑盒說明書,逆轉錄得到cDNA。

1.5.2 qPCR引物 參照GenBank上牦牛的IL-6、IL-1β、TNF-α、C3、ME1、LDHA、CTSB、CTSL及β-actin內參基因引物序列,通過上海生工生物工程股份有限公司成都分部設計引物并合成,并用RNase-Free ddH2O稀釋至100 μmol·L-1,引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR擴增的基因引物序列Table 1 Primer sequences for Real-time PCR

1.5.3 qPCR反應 分別以不同濃度的LPS(0、10、20、40、80、160 μg·mL-1)誘導牦牛瘤胃上皮細胞的cDNA為模板,根據(jù)qPCR試劑盒進行相關基因相對表達水平檢測。qPCR反應體系為2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL,上、下游引物各0.2 μL,cDNA模板1 μL,2× SYBR Green Pro Taq HS Premix5 μL,加無菌無酶的ddH2O至10 μL。qPCR反應程序:95 ℃預變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40個循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s。每個檢測進行4次重復。不同的引物mRNA的相對轉錄量用2-ΔΔCt(ΔΔCt=目的基因ΔCt值-內參基因ΔCt值)表示目的基因的相對表達量。

1.6 微量法檢測ATP含量

將消化離心后的牦牛瘤胃上皮細胞按照合適密度接種于6孔板中,待細胞融合至80%～90%時,分別加入2 mL·孔-1LPS溶液(89% 1640培養(yǎng)基+1%三抗+10%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋至0、10、20、40、80、160 μg·mL-1),其中0 μg·mL-1為對照組,每個處理設置6個重復,處理細胞24 h。收集各孔細胞,利用微量法檢測ATP的含量,具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.7 線粒體染色熒光強度

將消化離心后的牦牛瘤胃上皮細胞按照合適密度接種于12孔板中,待細胞融合至60%～70%時,分別加入1 mL·孔-1LPS溶液(89% 1640培養(yǎng)基+1%三抗+10%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋至0、10、20、40、80、160 μg·mL-1),其中0 μg·mL-1為對照組,每個處理設置6個重復,處理細胞24 h。根據(jù)Mito-Tracker Red CMXRox試劑盒說明書對線粒體染色后,用4%的多聚甲醛固定細胞20 min,再利用DAPI染色液對細胞核進行染色,利用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.8 線粒體膜電位檢測(JC-1)

將消化離心后的牦牛瘤胃上皮細胞按照合適密度接種于6孔板中,待細胞融合至80%～90%時,分別加入2 mL·孔-1LPS溶液(89% 1640培養(yǎng)基+1%三抗+10%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋至0、10、20、40、80、160 μg·mL-1),其中0 μg·mL-1為對照組,每個處理設置6個重復,處理細胞24 h。消化后用1.5 mL離心管收集,具體操作按照增強型線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)說明書進行。裝載JC-1后利用流式細胞儀進行分析。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

獲得的數(shù)據(jù)用EXCEL 2019進行初步整理,使用SPSS 27.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)先進行正態(tài)分布檢驗,后使用One-way-ANOVA程序進行單因素方差分析,并以Duncan’s法進行多重比較。線粒體染色熒光強度通過ImageJ軟件進行分析,流式細胞儀測定的線粒體膜電位變化用FlowJo_V10軟件分析,最后結果用Graph PadPrism 8.0.0軟件繪制柱狀圖。結果以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義,P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 不同濃度LPS對牦牛瘤胃上皮細胞活力的影響

如圖1所示,通過LPS不同濃度(0、10、20、40、80、160 μg·mL-1)處理牦牛瘤胃上皮細胞24 h后,細胞活力呈極顯著下降趨勢(P<0.01)。與對照組相比,LPS濃度為10 μg·mL-1時,顯示極顯著差異(P<0.01)。

不同小寫字母表示數(shù)據(jù)間差異極顯著(P<0.01)。下同 Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.01). The same as below圖1 LPS對牦牛瘤胃上皮細胞活力的影響Fig.1 Effects of LPS on cell viability of yak rumen epithelial cells

2.2 不同濃度LPS對牦牛瘤胃上皮細胞促炎因子分泌的影響

圖2A所示,與對照組相比,LPS不同濃度組的細胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子濃度呈極顯著上升(P<0.01)。由圖2B可知,基因表達量同濃度趨勢變化相同,隨著LPS濃度增加,促炎因子基因表達量逐漸升高(P<0.01)。

2.3 不同濃度LPS對牦牛瘤胃上皮細胞補體C3激活的影響

如圖3A所示,與對照相比,不同LPS濃度處理牦牛瘤胃上皮細胞后,補體C3的基因相對表達量極顯著上升(P<0.01)。圖3B得知,補體C3激活產(chǎn)物補體片段C3a和C3b的含量同樣也隨著LPS濃度上升而極顯著增加(P<0.01)。細胞內補體C3激活關鍵酶CTSB和CTSL基因表達量如圖3C,與對照組相比,CTSB的基因相對表達量隨著LPS濃度增加極顯著上調(P<0.01)。與之相反,CTSL的基因相對表達量極顯著下降(P<0.01)。

2.4 不同濃度LPS對牦牛瘤胃上皮細胞ATP生成的影響

2.4.1 LPS對ATP生成代謝物濃度的影響 如圖4所示,與對照組相比,LPS處理導致牦牛瘤胃上皮細胞ATP的含量極顯著下降(P<0.01)。在LPS濃度為20 μg·mL-1時,與對照組相比,ATP的含量極顯著降低(P<0.01)。細胞無氧呼吸產(chǎn)物乳酸(LA)濃度極顯著下調(P<0.01)。三羧酸循環(huán)重要中間代謝產(chǎn)物檸檬酸(CA)的含量隨著LPS濃度增加先上升后又逐漸下降(P<0.01)。

2.4.2 LPS對線粒體數(shù)量的影響 由圖5A可知,通過線粒體紅色熒光探針染色后發(fā)現(xiàn),添加不同濃度的LPS,使線粒體熒光強度極顯著下降(P<0.01)。由圖5B統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn),與對照組相比,LPS濃度在10 μg·mL-1時,線粒體紅色熒光強度極顯著下降(P<0.01)。

2.4.3 LPS對線粒體膜電位的影響 圖6所示為采用流式細胞術檢測不同濃度LPS對牦牛瘤胃上皮細胞攻毒24 h后,線粒體膜電位的變化,發(fā)現(xiàn)隨著LPS濃度的升高,產(chǎn)生紅光的聚合物逐漸減少,也就是線粒體膜電位逐漸降低(P<0.01)。在濃度20 μg·mL-1時,與對照組相比,線粒體膜電位極顯著下降(P<0.01)。

2.4.4 LPS對ATP生成相關基因表達的影響 由圖7A得知,參與有氧呼吸催化丙酮酸進入三羧酸循環(huán)產(chǎn)能的ME1基因表達隨著LPS濃度的升高極顯著降低(P<0.01),圖7B可知,丙酮酸進入無氧呼吸后促進產(chǎn)生乳酸的關鍵酶LDHA的基因,在添加LPS后極顯著上調(P<0.01)。如圖7C所示ATP5A和ATP5C1的基因表達量隨著LPS不同濃度的處理極顯著下調(P<0.01),在LPS濃度為20 μg·mL-1時,ME1、LDHA、ATP5A和ATP5C1的基因表達量與對照組相比均具有極顯著差異(P<0.01)。

3 討 論

前期研究表明,生長遲緩牦牛瘤胃液和血液中LPS濃度升高導致瘤胃上皮發(fā)生免疫炎癥反應,損傷瘤胃上皮屏障功能,抑制牦牛飼料轉化率和機體高效生長[1]。炎癥是機體受到病原體、有毒化合物或者輻射等刺激時產(chǎn)生的保護性反應,能促進受損組織愈合并恢復動態(tài)平衡[15]。LPS可以通過上調IL-1β和TNF-α等促炎因子從而建立炎癥模型[16]。奶牛的瘤胃上皮細胞在高劑量的LPS誘導下能升高促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達[17]。目前,對于牦牛瘤胃上皮細胞炎癥模型的建立未見報道,本研究發(fā)現(xiàn),LPS能使牦牛瘤胃上皮細胞的細胞活力顯著下調,并能誘導促炎因子的基因大量表達和含量增加。表明LPS誘導牦牛瘤胃上皮細胞成功建立炎癥模型。

細胞內補體系統(tǒng)激活在炎癥反應中起關鍵性的免疫調節(jié)作用[18]。補體C3是免疫系統(tǒng)中的重要組成,C3基因敲除小鼠能顯著下調腎缺血再灌注損傷誘發(fā)的IL-1和IL-6等促炎因子表達和組織炎癥反應[19]。補體C3激活是指細菌、病毒、LPS與宿主抗體結合后誘導補體C3裂解為C3a和C3b活性肽段的過程[20]。早期研究認為,炎癥狀態(tài)下補體C3激活發(fā)生在血液中,C3轉化裂解酶(convertase)是激活關鍵酶。而Liszewski等[9]首次發(fā)現(xiàn),在人的免疫細胞T細胞內補體C3的激活不同于血液中利用C3轉化裂解酶(convertase)激活,而是被細胞內源組織蛋白酶L所激活。小鼠原代腸上皮細胞和人腸上皮細胞系Caco2胞內補體C3由組織蛋白酶B和組織蛋白酶L激活[21],抑制CTSL和CTSB活性后能緩解補體過度激活導致的腸道炎癥損傷[22]。本試驗中,LPS誘導牦牛瘤胃上皮細胞產(chǎn)生炎癥后,補體C3大量激活,其下游補體片段C3a和C3b含量顯著增加,且補體C3在LPS濃度為20 μg·mL-1時表達量為最大值。說明炎癥能促進牦牛瘤胃上皮細胞補體C3激活并使其裂解成蛋白片段C3a和C3b而發(fā)揮作用。研究表明不同類型的細胞中激活補體C3的組織蛋白酶亞型不同,人T細胞中激活補體C3的組織蛋白酶L卻不能激活人肺上皮細胞內的補體C3[9,23]。本試驗發(fā)現(xiàn),經(jīng)過不同濃度的LPS處理后,牦牛瘤胃上皮細胞中組織蛋白酶L逐漸降低,而組織蛋白酶B則是顯著升高的。說明在牦牛瘤胃上皮細胞中CTSB可能是激活細胞內補體C3的關鍵組織蛋白酶類型。上述結果表明,牦牛瘤胃上皮細胞存在補體C3細胞內激活過程,且組織蛋白酶B可能是激活牦牛瘤胃上皮細胞胞內補體C3的主要蛋白酶。

A. LPS對補體C3基因相對表達量的影響;B. LPS對補體C3激活產(chǎn)物C3a和C3b濃度的影響;C. LPS對組織蛋白酶B和L基因相對表達量的影響A. Effect of LPS on the gene expression of complement C3; B. Effect of LPS on the concentrations of complement C3 activated products C3a and C3b; C. Effect of LPS on the gene expression of cathepsin B and cathepsin L圖3 LPS對牦牛瘤胃上皮細胞補體C3激活的影響Fig.3 Effects of LPS on complement C3 activation in rumen epithelial cells of yak

A. LPS對牦牛瘤胃上皮細胞ATP生成濃度的影響;B. LPS對牦牛瘤胃上皮細胞乳酸生成濃度的影響;C. LPS對牦牛瘤胃上皮細胞檸檬酸生成濃度的影響A. Effects of LPS on concentration of ATP produced by yak rumen epithelial cells; B. Effects of LPS on concentration of LA produced by yak rumen epithelial cells; C. Effects of LPS on concentration of CA produced by yak rumen epithelial cells圖4 LPS對牦牛瘤胃上皮細胞ATP生成的影響Fig.4 Effects of LPS on ATP production in rumen epithelial cells of yak

藍色熒光表示細胞核;紅色熒光表示線粒體 Blue fluorescence represents the nucleus;Red fluorescence indicates the mitochondria圖5 LPS對牦牛瘤胃上皮細胞的線粒體數(shù)量的影響Fig.5 Effect of LPS on mitochondrial number of yak rumen epithelial cells

A. LPS對參與有氧呼吸促進細胞產(chǎn)能的關鍵因子ME1基因表達的影響;B. LPS對丙酮酸進入無氧呼吸促進其產(chǎn)生乳酸的關鍵因子LDHA基因表達的影響;C. LPS對牦牛瘤胃上皮細胞ATP合成酶亞基基因表達的影響A. Effects of LPS on the expression of ME1 gene involved in aerobic respiration and promoting cell productivity; B. Effects of LPS on the expression of LDHA gene, a key factor of pyruvate entering anaerobic respiration to promote lactic acid production; C. Effects of LPS on ATP synthase subunit gene expression in yak rumen epithelial cells圖7 LPS對ATP生成相關基因表達的影響Fig.7 Effects of LPS on gene expression related to ATP production

近年來研究發(fā)現(xiàn),細胞內補體C3激活可調控細胞ATP生成。人免疫細胞內補體C3激活參與細胞能量代謝調控,誘導氨基酸轉運載體(GLUT1)和葡萄糖轉運載體(LAT1)表達增強[24]。在非免疫細胞中,補體C3激活可促進小鼠脂肪細胞中甘油三酯的合成[10],反復刺激誘導滑膜成纖維細胞產(chǎn)生炎癥后發(fā)現(xiàn),C3a與線粒體上的C3aR受體結合后抑制線粒體呼吸產(chǎn)生ATP,使能量生成受阻[25]。本試驗發(fā)現(xiàn),補體C3激活后,促進丙酮酸轉化為乳酸的關鍵酶LDHA的基因表達量顯著增加,而參與有氧呼吸促進三羧酸循環(huán)的關鍵酶ME1表達量顯著降低。這與Hu等[1]前期的研究中,生長遲緩牦牛瘤胃上皮的LDHA和ME1表達趨勢一致。并且補體C3被激活后,牦牛瘤胃上皮細胞ATP5A和ATP5C1表達隨之降低,且ATP含量也同樣顯著下調。線粒體是細胞呼吸代謝和產(chǎn)生能量的重要場所,線粒體膜電位是反映ATP生成的重要指標[26]。本研究中,通過對線粒體熒光強度及線粒體膜電位檢測發(fā)現(xiàn),線粒體數(shù)量及線粒體膜電位均顯著下調。上述結果提示,LPS刺激在抑制牦牛瘤胃上皮細胞有氧呼吸作用和抑制線粒體ATP生成過程中發(fā)揮重要作用。瘤胃上皮通過跨膜轉運功能將營養(yǎng)小分子轉運入血液供機體利用,瘤胃上皮細胞內揮發(fā)性脂肪酸,氮和Na+、Mg+、K+及Ca2+等的轉運都離不開線粒體ATP生成后被NA+/K+-ATP酶利用,形成電勢差將鈉離子泵出細胞外進行轉運[7,27],說明瘤胃上皮的營養(yǎng)物質轉運功能與ATP的生成密切相關。因此LPS誘導C3激活和炎癥反應,可能通過抑制ATP生成導致瘤胃上皮功能健康問題,限制飼料轉化率和機體生長效率,本研究為通過營養(yǎng)調控炎癥下瘤胃上皮ATP生成,促進瘤胃健康和機體生長提供了理論依據(jù)。

4 結 論

本研究利用LPS誘導建立了牦牛瘤胃上皮細胞炎癥模型。炎癥狀態(tài)下,牦牛瘤胃上皮細胞內補體C3主要被細胞內組織蛋白酶CTSB激活,裂解產(chǎn)物C3a和C3b濃度增加,并抑制線粒體ATP合成酶亞基ATP5A和ATP5C1基因表達,下調有氧呼吸關鍵酶ME1基因表達量,降低線粒體膜電位,抑制ATP生成代謝。因此LPS誘導炎癥可抑制瘤胃上皮細胞ATP生成,從而導致瘤胃健康問題。