陳謝滔，胡賢靜，邱天樂，沈賢，薛向陽(yáng)

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 微生物與免疫學(xué)教研室 分子病毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325027；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015

胃癌（gastric cancer, GC）是世界上第五大常見的癌癥和第四大癌癥相關(guān)死亡原因[1]。近年來，盡管在外科手術(shù)和化療方面取得了一些進(jìn)展，但GC患者的五年生存率仍不足10%，這主要是由于大部分的胃癌患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于進(jìn)展期，導(dǎo)致其對(duì)術(shù)后化療或者新型免疫療法的響應(yīng)率和獲益率并不理想[2-4]。因此，尋找GC診斷的新生物標(biāo)志物或新型治療靶點(diǎn)，并進(jìn)一步探究GC惡性進(jìn)展的分子機(jī)制，對(duì)于改善患者的預(yù)后是非常重要的。

中線蛋白2（midline 2, MID2）也稱為三方基序蛋白1（tripartite motif-containing protein 1, TRIM1），屬于TRIM蛋白家族成員[5]。TRIM家族有超過70個(gè)成員，被報(bào)道參與多種細(xì)胞過程和信號(hào)通路，其大多數(shù)成員都具有E3泛素連接酶活性。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，MID2參與激活NF-κB/AP-1信號(hào)通路，這提示我們?cè)摰鞍卓赡茉谀[瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[6]；MID2在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和致瘤性，可能是乳腺癌的一個(gè)有價(jià)值的治療靶點(diǎn)[7]。但關(guān)于MID2在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及作用研究鮮有報(bào)道。本研究通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的胃癌臨床樣本及公共數(shù)據(jù)庫(kù)綜合評(píng)估了MID2在胃癌中的表達(dá)特點(diǎn)和預(yù)后影響，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)估了MID2在胃癌細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)，旨在對(duì)胃癌潛在治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)做出一定貢獻(xiàn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人胃癌細(xì)胞BGC-823和SGC-7901均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.1.2 試劑：胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Gibco公司；MID2兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；GAPDH兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；兔二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；Western blot配置試劑盒及細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；CCK-8試劑購(gòu)自日本同仁公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司；基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD生物科技有限公司；MID2質(zhì)粒構(gòu)建序列為前向引物：CCCAAGCTTGCCACCATGGGTGA AAGCCCAGCC；后向引物：CCGGAATTCCTATTAAGCGTAG TCTGGGACGTCGTATGGGTAATGACAGGTTTTCATCCCA，引物購(gòu)于北京六合華大基因科技有限公司；質(zhì)粒構(gòu)建所需切膠回收、純化、大提試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-tek公司。靶向MID2的小干擾RNA（siRNA）序列為GCGCAACAGCGAACTAGAA（5’-3’），委托廣州銳博生物科技有限公司進(jìn)行合成。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集：用于組織芯片分析的胃癌標(biāo)本收集自2014年1月至2016年12月于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行胃癌根治性切除手術(shù)的患者，包括420例胃癌組織和41例對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織（距腫瘤切緣至少10 cm）。剔除脫片的組織后，對(duì)組織染色情況進(jìn)行分析，計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域光密度值/腫瘤總面積光密度值，得到MID2-Score評(píng)分。本研究獲溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)（批號(hào)：2019046）。

1.2.2 生物信息學(xué)分析：使用R的TCGAbiolinks包下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃腺癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。根據(jù)ROC曲線最大約登指數(shù)確定MID2表達(dá)量預(yù)測(cè)生存的最佳分組截?cái)嘀?。R的survival（3.3.1），survminer，ggplot2（3.3.6）包被用于進(jìn)行生存分析。

1.2.3 免疫組化：將組織芯片放入65 ℃烘箱中2 h 脫蠟；梯度乙醇浸泡后附水；抗原修復(fù)后用免疫組化筆圈出組織邊緣，5%的山羊血清封閉30 min；封閉完成后滴加MID2多克隆抗體室溫下孵育2 h；二抗孵育30 min；DAB顯色液（50×）孵育10 min；蘇木素染色，過鹽酸乙醇分化；PBS溶液反藍(lán)后梯度乙醇脫水；二甲苯浸泡5 min后中性樹脂封片保存。使用數(shù)字切片系統(tǒng)對(duì)組織芯片進(jìn)行全視野掃描，使用CaseViewer軟件對(duì)掃描的芯片進(jìn)行觀察；采用Image-ProPlus軟件對(duì)抗體染色強(qiáng)度進(jìn)行量化并分析。

1.2.4 MID2 質(zhì)粒構(gòu)建：從NCBI官網(wǎng)檢索并下載MID2基因的蛋白質(zhì)編碼序列，設(shè)計(jì)帶有特異性內(nèi)切酶位點(diǎn)的前后向引物；使用高保真酶以胃癌細(xì)胞BGC-823的cDNA為模板，擴(kuò)增目的基因片段；核酸膠電泳分離目的條帶后使用切膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物；使用特異性內(nèi)切酶將PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1野生型質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切；酶切產(chǎn)物純化分離后使用T4連接酶進(jìn)行酶連。酶連條件：16 ℃反應(yīng) 16 h；使用DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化并涂板；挑取單克隆菌置于含AMP的LB培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫?fù)u床擴(kuò)增菌液；吸取單克隆菌液送DNA測(cè)序；序列驗(yàn)證成功后將菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，使用大提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，得到pcDNA3.1-MID2-HA重組質(zhì)粒，測(cè)定質(zhì)粒濃度。

1.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)：將胃癌細(xì)胞鋪板于6孔板中，轉(zhuǎn)染質(zhì)?；騭i-RNA，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；使用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白；配置濃度為10%的SDS-PAGE凝膠；電泳分離蛋白樣（電泳條件：80 V 30 min；120 V 60 min）；電泳完成后于冰水浴中將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜（轉(zhuǎn)膜條件80 V 90 min）；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中，室溫下?lián)u床封閉40 min；加入1:1 000稀釋的MID2兔多克隆抗體，于4 ℃搖床上孵育過夜；兔二抗室溫下?lián)u床孵育2 h，最后TBST洗膜并使用ECL發(fā)光試劑進(jìn)行顯色并曝光。

1.2.6 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將胃癌細(xì)胞以合適密度接種于96孔板（4 000～5 000個(gè)/孔），待細(xì)胞完全貼壁后按照lip2000 轉(zhuǎn)染說明書轉(zhuǎn)染質(zhì)?；騭i-RNA，轉(zhuǎn)染8 h后換液；分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h吸棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL用無血清培養(yǎng)基稀釋的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育3 h；孵育完成后吸取90 μL液體轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，避光條件下酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)：將合適密度的細(xì)胞接種到6 孔板中；待細(xì)胞完全貼壁后按照lip2000 轉(zhuǎn)染說明書轉(zhuǎn)染質(zhì)?；騭i-RNA，轉(zhuǎn)染8 h后換液；轉(zhuǎn)染后 48 h開始進(jìn)行遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)；在實(shí)驗(yàn)前2 h，于 4 ℃冰箱解凍緩慢解凍基質(zhì)膠；用PBS稀釋基質(zhì)膠至終濃度為0.5 mg/mL；取出小室置于24孔板中，每小室加入200 μL基質(zhì)膠，置于培養(yǎng)箱中孵育；轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化細(xì)胞并離心，用不含血清的培養(yǎng)基重懸并稀釋細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL； 于培養(yǎng)箱中取出小室，吸盡PBS，每個(gè)小室加入 200 μL稀釋好的細(xì)胞懸液，下室加入600 μL含10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)基，水平置于培養(yǎng)箱中；根據(jù)不同細(xì)胞特性于特定時(shí)間取出小室，4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色10 min，清水洗凈后晾干；正置顯微鏡下觀察細(xì)胞穿出情況，按上-中-左-右-下順序取5個(gè)視野拍攝，對(duì)視野中的染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Graphpad Prism 8.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)作圖，R 4.0.2進(jìn)行生物信息學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行生存分析，采用Logrank檢驗(yàn)評(píng)估2組患者生存狀態(tài)的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MID2在胃癌組織中高表達(dá)并提示較差的預(yù)后 胃癌組織芯片的免疫組化染色結(jié)果表明，MID2在胃癌組織及癌旁組織中均有表達(dá)，且主要表達(dá)在細(xì)胞漿中，鏡下可見MID2在癌旁組織及胃癌組織中主要表達(dá)于管狀腺，且胃癌組織中呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性而癌旁組織呈現(xiàn)弱陽(yáng)性（見圖1A）。在剔除脫片、非特異性染色等情況后，28對(duì)胃癌組織與癌旁配對(duì)組織中MID2-Score的數(shù)值差異表明，MID2在胃癌中的整體表達(dá)量要高于癌旁組織（P＜0.05，見圖1B）。同時(shí)配對(duì)分析顯示，MID2蛋白表達(dá)水平在胃癌組織中要顯著高于配對(duì)的癌旁組織（P＜0.01，見圖1C）。在剔除65例脫片組織后，根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果將胃癌患者分為MID2高表達(dá)組（101例）和MID2低表達(dá)組（254例）進(jìn)行生存分析，Kaplan-Meier生存曲線顯示高M(jìn)ID2蛋白表達(dá)水平預(yù)示著胃癌患者更差的預(yù)后（P=0.055，見圖1D）。

圖1 MID2在胃癌中的表達(dá)情況

對(duì)TCGA胃癌臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析也得到了相似的結(jié)論，MID2 高表達(dá)患者的總體生存期（overall survival，OS；Log-rankP=0.002）、無病生存期（disease-free survival，DFS；Log-rankP=0.002）、無進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS；Log-rankP=0.003）均顯著低于MID2低表達(dá)患者，見圖2A-C。其中在針對(duì)不同病理分期的亞組生存分析中，MID2表達(dá)量高低對(duì)于III期患者OS的影響最顯著（見圖2D）。這一部分結(jié)果表明MID2在胃癌組織中高表達(dá)且與胃癌患者不良預(yù)后相關(guān)，并提示其可能作為一個(gè)致癌基因在胃癌中發(fā)揮作用。

圖2 TCGA胃癌數(shù)據(jù)庫(kù)中MID2表達(dá)的預(yù)后分析

2.2 上調(diào)MID2表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖能力 為了評(píng)估MID2對(duì)胃癌細(xì)胞惡性表型的影響，首先通過Western blot檢測(cè)了MID2蛋白在各胃癌細(xì)胞系中的基礎(chǔ)表達(dá)水平，結(jié)果表明MID2蛋白在BGC-823、SGC-7901、AGS、HGC-27表達(dá)量相近，均較低，在MGC-803細(xì)胞中表達(dá)較高。因此我們選取MID2基礎(chǔ)表達(dá)較低的BGC-823及SGC-7901細(xì)胞系進(jìn)行過表達(dá)，選取MID2基礎(chǔ)表達(dá)較高的MGC-803細(xì)胞系進(jìn)行敲低（見圖3A）。我們?cè)O(shè)計(jì)構(gòu)建了pcDNA3.1-MID2-HA重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染至BGC-823及SGC-7901細(xì)胞中，通過Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)有效過表達(dá)（見圖3B）。隨后，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)上調(diào)MID2表達(dá)后能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞BGC-823和SGC-7901的增殖能力（P＜0.05，見圖3C）。

圖3 上調(diào)MID2促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖能力

2.3 上調(diào)MID2表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力 Transwell小室遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在過表達(dá)MID2后，BGC-823及SGC-7901細(xì)胞遷移與侵襲能力顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。以上結(jié)果證實(shí)了上調(diào)MID2表達(dá)能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力。

圖4 上調(diào)MID2促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲能力

2.4 下調(diào)MID2表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力 為了進(jìn)一步評(píng)估MID2對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，我們?cè)O(shè)計(jì)了靶向MID2的小干擾RNA（siRNA），選擇在MID2蛋白基礎(chǔ)表達(dá)量較高的MGC-803細(xì)胞中驗(yàn)證其敲低效率。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示在MGC-803細(xì)胞中，siRNA能夠顯著敲低MID2蛋白的表達(dá)水平（見圖5A）。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示敲低MID2能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力（P＜0.001），見圖5B。Transwell實(shí)驗(yàn)表明敲低MID2的表達(dá)能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力（P＜0.001），見圖5C。

圖5 敲低MID2抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力

3 討論

細(xì)胞蛋白的泛素化在真核細(xì)胞的關(guān)鍵信號(hào)通路和蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。在協(xié)調(diào)泛素化方面非常重要的是E3泛素連接酶，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)識(shí)別及底物修飾需要發(fā)生在正確的時(shí)間和地點(diǎn)。TRIM是E3泛素連接酶的主要亞類。TRIMs蛋白在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生物學(xué)行為方面具有重要作用[6]，如細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、固有免疫、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、自噬和癌變[8-10]。在腫瘤治療過程中，TRIMs蛋白可以通過調(diào)節(jié)腫瘤的各個(gè)方面發(fā)揮作用，如腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和耐藥的發(fā)展等[11-12]。TRIM8、TRIM24、TRIM28和TRIM32在惡性腫瘤組織中高表達(dá)并參與惡性生物學(xué)行為[13]，并且絕大多數(shù)高表達(dá)的TRIMs蛋白提示胃腸道腫瘤患者預(yù)后不良，如胃癌組織中高表達(dá)的TRIM32[14]、TRIM54[15]等。MID2又稱作TRIM1，做為TRIM家族中的一員，關(guān)于其在胃癌中的生物學(xué)效應(yīng)尚缺乏足夠的報(bào)道。

在本研究中，通過本中心的胃癌標(biāo)本聯(lián)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，MID2 在胃癌組織中高表達(dá)并提示較差的預(yù)后。與本結(jié)果相似，AGUILAR等[16]報(bào)道MID2的表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后有關(guān)，MID2 mRNA和蛋白水平在乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌組織中表達(dá)上 調(diào)[7]，然而除此之外，MID2 在其他腫瘤中的生物學(xué)表型及作用仍未得到足夠研究。之后我們探究了MID2在胃癌細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)，通過CCK-8及Transwell實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)上調(diào)MID2表達(dá)能顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，下調(diào)MID2表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。之前的研究也同樣證實(shí)MID2的上調(diào)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，敲低MID2的表達(dá)顯著降低乳腺癌細(xì)胞的增殖速率[6]。

關(guān)于MID2在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮效應(yīng)的機(jī)制，有研究報(bào)道MID2通過激活NF-κB/AP-1來影響NF-κB信號(hào)通路。NF-κB是參與癌細(xì)胞過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，包括細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17-18]。除此之外，在細(xì)胞分裂期間MID2可以直接于Astrin的N-末端結(jié)合，并在以MID2依賴的方式使Astrin-K409處泛素化，最終導(dǎo)致Astrin降解從而促進(jìn)細(xì)胞的分裂[19]。 這將可能是MID2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖機(jī)制探索的切入點(diǎn)。而關(guān)于MID2通過何種機(jī)制進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞表型，仍是我們需要思考并進(jìn)行后續(xù)研究的重點(diǎn)。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)MID2在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，且與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。上調(diào)MID2能顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力，但其發(fā)揮生物學(xué)功能的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。