胡穎婷 鄒毅剛 周外平（武漢市第四醫(yī)院疼痛科，武漢 430030）

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的全身性和自身免疫性疾病，滑膜成纖維細胞（culture synovial fibroblasts，F(xiàn)LSs）的異樣增生是導(dǎo)致其發(fā)生發(fā)展的重要原因，在RA 病程中，滑膜轉(zhuǎn)變?yōu)樵錾那忠u性組織，導(dǎo)致軟骨和骨骼的破壞；因此研究其具體分子機制，可為確定未來治療靶點提供依據(jù)和參考［1-3］。非編碼RNA（ncRNA）主要包括microRNA（miRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）等，可作為診斷和治療RA 的生物標志物［4］。研究報道骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中CircSERPINE2 表達降低與細胞外基質(zhì)的過度凋亡及合成代謝、分解代謝因子之間的失衡直接相關(guān)，CircSERPINE2 過表達可通過miR-1271-ERG 途徑減輕軟骨凋亡并促進細胞外基質(zhì)的合成代謝［5］。CircSERPINE2 上調(diào)表達可促進膠質(zhì)母細胞瘤增殖［6］。而CircSERPINE2 對RA 滑膜成纖維細胞的增殖、遷移和侵襲的影響及機制尚不清楚。研究報道m(xù)iR-23a-3p 通過直接靶向軟骨細胞中的SMAD3 促進骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展［7］。白藜蘆醇可通過調(diào)控SIRT1/NF-κB/miR-23a-3p/cul3激活SIRT1-Nrf2 信號通路，從而改善RA［8］。因此，本實驗旨在研究CircSERPINE2 對RA 滑膜成纖維細胞的增殖、遷移和侵襲的影響及機制是否與miR-23a-3p有關(guān)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取于武漢市第四醫(yī)院就診的44例RA患者，RA的診斷根據(jù)1987年美國風濕病學(xué)會修訂標準；于清晨空腹抽取其外周血20 ml，同時取44 例同期健康體檢者外周血作為對照。倫理審批號：KY2022-077-01。

1.1.2 細胞與主要試劑 人原代滑膜成纖維細胞（SFs）和人原代RA 滑膜成纖維細胞（RA-FLSs）購自美國ATCC；RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco；血漿RNA 提取試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司；Trizol 試劑、熒光定量試劑盒購自大連寶生物；RIPA蛋白裂解液、CCK-8 購自北京百奧萊博科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海貝博生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理與分組 采用RPMI1640 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)FLSs和RA-FLSs，將CircSERPINE2過表達載體及陰性對照、miR-23a-3p 抑制劑及陰性對照轉(zhuǎn)染 至RA-FLSs 中，記 為pcDNA-CircSERPINE2 組、pcDNA 組、anti-miR-23a-3p 組、anti-miR-NC 組，常規(guī)培養(yǎng)的RA-FLSs 作 為NC 組；將miR-23a-3p 過表達載體及陰性對照分別與CircSERPINE2 過表達載體轉(zhuǎn)染至RA-FLSs 中，記為miR-23a-3p+pcDNA-Circ-SERPINE2組、miR-NC+pcDNA-CircSERPINE2組。

1.2.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測Circ-SERPINE2 和miR-23a-3p 表達水平 提取血漿RNA、FLSs及各組RA-FLSs的總RNA，合成cDNA 后進行PCR，用2-ΔΔCt法計算相對表達量。以GAPDH和U6 為內(nèi)參。引物序列（5′-3′）CircSERPINE2 F：

GTGCTCACCAGACTGGT，R：TTCACAATCTGATTGAAAAC；GADPH F：AGCCACATCGCTCAGACAC，R：GCCCAATACGACCAAATCC；miR-23a-3p F：CCTTTAGGGACCGTTACACTA，R：TAGTGTAACGGTCCCTAAAGG；U6 F：CTCGCTTCGGCAGCACATA，R：CAGTGCAGGGTCCGAGGTA。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入1∶1 000稀釋的MMP2、MMP9和β-actin一抗4 ℃孵育過夜，再用1∶2 000稀釋的二抗室溫孵育2 h，發(fā)光液顯影，分析蛋白條帶的相對灰度值。

1.2.4 細胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）檢測細胞活性

各組細胞培養(yǎng)48 h，更換為含10%CCK-8 培養(yǎng)液，酶標儀檢測孵育2 h后450 nm吸光度值（A）。

1.2.5 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲數(shù) 用無血清培養(yǎng)液重懸各組細胞，取200 μl 細胞懸液接種于未包被（遷移）或包被基質(zhì)膠（侵襲）Transwell 上室，下室加入含趨化因子培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h 后將穿膜細胞用4%多聚甲醛固定，再加入結(jié)晶紫染色，漂洗干燥，用顯微鏡拍照并計數(shù)，即為細胞遷移或侵襲數(shù)。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗 構(gòu)建含有miR-23a-3p 結(jié)合位點的CircSERPINE2 野生型及突變型報告基因載體，將其分別與miR-23a-3p、miR-NC 轉(zhuǎn)染至RA-FLSs中，按試劑盒說明檢測細胞熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNA-CircSERPINE2、si-NC、si-Circ-SERPINE2 分別轉(zhuǎn)染至RA-FLSs 中，采用RT-qPCR檢測CircSERPINE2和miR-23a-3p的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用表示，兩組間比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA患者外周血中CircSERPINE2和miR-23a-3p的表達情況 RA 患者外周血中CircSERPINE2表達水平低于健康體檢者，而miR-23a-3p 表達水平高于健康體檢者（P<0.05，表1）。

表1 檢測外周血中CircSERPINE2 和miR-23a-3p 的表達情況（，n=44）Tab.1 Expressions of CircSERPINE2 and miR-23a-3p in peripheral blood（，n=44）

表1 檢測外周血中CircSERPINE2 和miR-23a-3p 的表達情況（，n=44）Tab.1 Expressions of CircSERPINE2 and miR-23a-3p in peripheral blood（，n=44）

Note：Compared with healthy control group，1）P<0.05.

2.2 RA-FLSs 中CircSERPINE2 和miR-23a-3p 的表達情況 與FLSs比較，RA-FLSs中CircSERPINE2表達水平降低，而miR-23a-3p 表達水平升高（P<0.05，表2）。

表2 RA-FLSs 中CircSERPINE2 和miR-23a-3p 表達的情況（，n=9）Tab.2 Expressions of CircSERPINE2 and miR-23a-3p in RA-FLSs of RA synovial fibroblasts（，n=9）

表2 RA-FLSs 中CircSERPINE2 和miR-23a-3p 表達的情況（，n=9）Tab.2 Expressions of CircSERPINE2 and miR-23a-3p in RA-FLSs of RA synovial fibroblasts（，n=9）

Note：Compared with FLSs group，1）P<0.05.

2.3 增加CircSERPINE2 表達可抑制RA-FLSs 的增殖、遷移和侵襲 與pcDNA 組比較，pcDNA-Circ-SERPINE2 組細胞MMP2 和MMP9 表達水平降低，CircSERPINE2 表達水平升高，細胞活性降低，遷移數(shù)和侵襲數(shù)減少（P<0.05，圖1、表3）。

圖1 Western blot 檢 測CircSERPINE2 表達后MMP2、MMP9蛋白表達Fig.1 Western blot analysis of MMP2 and MMP9 protein expressions after CircSERPINE2 expression

表3 CircSERPINE2低表達抑制RA滑膜成纖維細胞RA-FLSs的增殖、遷移和侵襲（，n=9）Tab.3 Low expression of CircSERPINE2 inhibits proliferation，migration and invasion of RA-FLSs in RA synovial fibroblasts（，n=9）

表3 CircSERPINE2低表達抑制RA滑膜成纖維細胞RA-FLSs的增殖、遷移和侵襲（，n=9）Tab.3 Low expression of CircSERPINE2 inhibits proliferation，migration and invasion of RA-FLSs in RA synovial fibroblasts（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P<0.05.

2.4 抑制miR-23a-3p表達可抑制RA-FLSs的增殖、遷移和侵襲 與anti-miR-NC 比較，anti-miR-23a-3p組MMP2 和MMP9 表達水平、miR-23a-3p 表達水平降低，細胞活性降低，遷移數(shù)和侵襲數(shù)減少（P<0.05，圖2、表4）。

圖2 Western blot 檢測抑制miR-23a-3p 表達后MMP2、MMP9蛋白表達Fig.2 Western blot detection of MMP2 and MMP9 protein expressions after inhibition of miR-23a-3p expression

表4 抑制miR-23a-3p表達抑制RA滑膜成纖維細胞RA-FLSs的增殖、遷移和侵襲（，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-23a-3p expression inhibits proliferation，migration and invasion of RA-FLSs in RA synovial fibroblasts（，n=9）

表4 抑制miR-23a-3p表達抑制RA滑膜成纖維細胞RA-FLSs的增殖、遷移和侵襲（，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-23a-3p expression inhibits proliferation，migration and invasion of RA-FLSs in RA synovial fibroblasts（，n=9）

Note：Compared with anti-miR-NC group，1）P<0.05.

2.5 CircSERPINE2 靶向調(diào)控miR-23a-3p 的表達

Starbase 預(yù)測顯示CircSERPINE2 和miR-23a-3p存在結(jié)合位點（圖3）。miR-23a-3p與CircSERPINE2野生型報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細胞熒光素酶活性降低（P<0.05，表5）。與pcDNA 組比較，pcDNA-CircSERPINE2 組CircSERPINE2 表達水平升高，miR-23a-3p表達水平降低（P<0.05）；與si-NC 組比較，si-Circ-SERPINE2 組CircSERPINE2 表達水平降低，miR-23a-3p表達水平升高（P<0.05，表6）。

圖3 Starbase 對CircSERPINE2 和miR-23a-3p 結(jié)合進行預(yù)測示意圖Fig.3 Schematic diagram of Starbase′s prediction of binding of CircSERPINE2 to miR-23a-3p

表5 miR-NC 或miR-23a-3p 與CircSERPINE2 報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染RA-FLSs 細胞后雙熒光素酶活性檢測（，n=9）Tab.5 Detection of dual-luciferase activity after co-transfection of miR-NC or miR-23a-3p and CircSERPINE2 reporter plasmid into RA-FLSs cells（，n=9）

表5 miR-NC 或miR-23a-3p 與CircSERPINE2 報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染RA-FLSs 細胞后雙熒光素酶活性檢測（，n=9）Tab.5 Detection of dual-luciferase activity after co-transfection of miR-NC or miR-23a-3p and CircSERPINE2 reporter plasmid into RA-FLSs cells（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

表6 RT-qPCR檢測miR-23a-3p的表達（，n=9）Tab.6 Expression of miR-23a-3p detected by RT-qPCR（，n=9）

表6 RT-qPCR檢測miR-23a-3p的表達（，n=9）Tab.6 Expression of miR-23a-3p detected by RT-qPCR（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P<0.05；compared with si-NC group，2）P<0.05.

2.6 miR-23a-3p 可逆轉(zhuǎn)CircSERPINE2 過表達對RA-FLSs 增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC+pcDNA-CircSERPINE2 組比較，miR-23a-3p+pcDNACircSERPINE2 組MMP2 和MMP9 表達水平、miR-23a-3p 表達水平升高，細胞活性提高，遷移數(shù)、侵襲數(shù)增加（P<0.05，圖4、表7）。

圖4 Western blot檢測MMP2和MMP9蛋白表達Fig.4 Western blot detection of MMP2 and MMP9 protein expressions

表7 miR-23a-3p可逆轉(zhuǎn)CircSERPINE2過表達對RA-FLSs增殖、遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.7 miR-23a-3p can reverse effects of CircSERPINE2 overexpression on proliferation，migration and invasion of RAFLSs（，n=9）

表7 miR-23a-3p可逆轉(zhuǎn)CircSERPINE2過表達對RA-FLSs增殖、遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.7 miR-23a-3p can reverse effects of CircSERPINE2 overexpression on proliferation，migration and invasion of RAFLSs（，n=9）

Note：Compared with miR-NC+pcDNA-CircSERPINE2 group，1）P<0.05.

3 討論

滑膜成纖維細胞的大量異常增殖是滑膜組織增生的主要原因，其異常增殖可侵蝕軟骨，最終破壞骨關(guān)節(jié)，加重RA 進展［9-10］。因此，深入了解RAFLSs 異常增殖的分子機制，通過調(diào)控相關(guān)基因抑制RA-FLSs 異常增殖是有效防治RA 的重要途徑和方法。研究報道circSERPINE2 通過調(diào)節(jié)miR-495/TGFBR2 軸減弱IL-1β 引起的軟骨細胞凋亡和細胞外基質(zhì)降解，是骨關(guān)節(jié)炎治療的新靶點［11］。Circ-SERPINE2 通過吸附miR-375 和調(diào) 節(jié)YWHAZ 表 達促進胃癌細胞增殖［12］。本實驗結(jié)果顯示，RA 患者外周血中CircSERPINE2表達水平低于健康體檢者，且RA-FLSs 中CircSERPINE2 表達水平低于正常FLSs，表明CircSERPINE2 可能參與RA 的發(fā)病。本實驗進一步過表達CircSERPINE2 后，MMP2、MMP9表達水平降低，細胞活性降低，遷移和侵襲細胞數(shù)減少，表明過表達CircSERPINE2 可抑制RA-FLSs 的增殖、遷移和侵襲。

研究報道m(xù)iR-23a-3p 在RA 中失調(diào)表達，可能在甲氨蝶呤治療的RA 患者血液來源的CD19+B 細胞中具有重要的調(diào)節(jié)功能［13］。新風膠囊可通過下調(diào)miR-23a-3p 表達降低骨關(guān)節(jié)炎患者的炎癥反應(yīng)［14］。本實驗結(jié)果顯示，RA 患者外周血及RA-FLSs中miR-23a-3p 表達水平升高，與在骨關(guān)節(jié)炎中表達趨勢一致。抑制miR-23a-3p 表達后，MMP2、MMP9表達水平降低，細胞活性下降，遷移數(shù)和侵襲數(shù)減少；表明抑制miR-23a-3p 表達可抑制RA-FLSs 的增殖、遷移和侵襲。此外，本實驗還證實CircSERPINE2 靶向調(diào)控miR-23a-3p，而miR-23a-3p 過表達可逆轉(zhuǎn)CircSERPINE2過表達對RA-FLSs的影響。

綜上所述，CircSERPINE2 過表達可通過靶向調(diào)控miR-23a-3p 抑制RA 滑膜成纖維細胞的增殖、遷移和侵襲。