王傳慧 宋帥 潘揚

心房顫動是臨床實踐中最常見的心律失常,與死亡、卒中和外周栓塞等風(fēng)險增加密切相關(guān)[1]。心房顫動發(fā)病率隨年齡增長而增加,因此,在全球人口老齡化和慢性病生存率不斷加重形式下,心房顫動的發(fā)病率呈不斷上升趨勢[2]。心房顫動的特征是結(jié)構(gòu)和電重塑,心房纖維化是心房結(jié)構(gòu)重塑的標(biāo)志[3]。心肌纖維化是慢性心肌疾病常見的最終途徑,與心房顫動的復(fù)發(fā)、耐藥和并發(fā)癥相關(guān)[4]。纖維化的發(fā)展是一個高度復(fù)雜,多因素和患者特異性的過程,涉及復(fù)雜的神經(jīng)體液,細胞和分子相互作用[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑家族(TIMPs)主要包括TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4四個成員,廣泛存在于人體所有組織的細胞外基質(zhì)中,參與細胞外基質(zhì)的降解和組成,且參與疾病的病理過程[5]。大量研究表明,MMP/TIMP的平衡與心臟病的發(fā)生、進展和預(yù)后密切相關(guān)[6]。TIMP可以通過抑制MMP依賴性細胞外基質(zhì)蛋白水解來調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的蛋白水解[5]。TIMP4是目前研究最少的TIMPs成員,其在大腦和心臟中呈高表達。既往研究表明,TIMP4影響脂質(zhì)代謝和平滑肌細胞增殖,下調(diào)TIMP4會促進腹主動脈中的動脈粥樣硬化斑塊沉積[7]。而心肌纖維化是心臟內(nèi)細胞外基質(zhì)(ECM)沉積和降解不平衡的過程,導(dǎo)致成纖維細胞過度增殖和心組織間質(zhì)間隙內(nèi)細胞外基質(zhì)蛋白的積聚[8]。故推測TIMP4與心房顫動患者心肌纖維化過程具有一定相關(guān)性,本研究分析TIMP4與心房顫動患者心肌纖維化的相關(guān)性,以為心房顫動患者的臨床診療提供一定依據(jù),報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年6月至2022年12月在院就診治療的82例心房顫動患者為研究對象,根據(jù)患者臨床情況將其分為陣發(fā)性房顫組(n=42)和持續(xù)性房顫組(n=40)。陣發(fā)性房顫組中,男21例,女21例;年齡37～83歲,平均年齡(45.28±4.73)歲。持續(xù)性房顫組中,男22例,女18例;年齡39～84歲,平均年齡(46.13±5.15)歲。另選取同期體檢健康者40例作為對照組,男20例,女20例;年齡37～81歲,平均年齡(44.94±4.29)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標(biāo)準

1.2.1 納入標(biāo)準:①經(jīng)臨床診斷確診為心房顫動患者[9];②患者及家屬知情且同意;③陣發(fā)性房顫患者為房顫發(fā)作7 d內(nèi)可自動終止者,持續(xù)性房顫患者為房顫發(fā)作持續(xù)超過7 d或需電復(fù)律律轉(zhuǎn)者;④臨床資料完整。

1.2.2 排除標(biāo)準:①高血壓、冠心病以及腎功能不全患者;②心力衰竭患者;③具有心臟病手術(shù)史者。

1.3 方法

1.3.1 一般資料收集:收集研究對象性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、左心房內(nèi)徑、左心室內(nèi)徑、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-21(IL-21)相關(guān)臨床資料。

1.3.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定血清TIMP4和PⅠCP、PⅢCP水平:收集心房顫動患者就診當(dāng)日和對照組體檢當(dāng)日靜脈血3 ml,4℃冰箱保存,多功能臺式離心機(德國Eppendorf,型號:5804/5804 R)4 000 r/min離心10 min,取上清液,-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用血?血漿總RNA提取試劑盒(上海信裕生物,貨號:XYB0901)提取樣品總RNA,通過凝膠電泳檢驗所提取RNA質(zhì)量,結(jié)果顯示28S和18S兩條RNA帶,表明所得RNA產(chǎn)物無DNA污染和RNA降解,可進行下一步實驗。使用核酸蛋白分析儀(日本島津,型號:MultiNA)測定RNA產(chǎn)物濃度和吸光度值,D260/D280比值在1.9～2.1表明RNA純度較高、質(zhì)量較好,可進行下一步實驗。采用探針法qRT-PCR試劑盒HiScript Ⅱ One Step qRT-PCR Probe Kit試劑盒(南京諾唯贊公司,貨號:Q222-01)進行qRT-PCR檢測TIMP4 mRNA水平,以GAPDH為內(nèi)參基因,每個樣品設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)體系:2 × One-Step Q Probe Mix 10 μl,One-Step Q Probe Enzyme Mix 1 μl,上游引物0.5 μl,下游引物0.5 μl,TaqMan Probe 0.2 μl,模板RNA 10 ng,50 × ROX Reference Dye 10.4 μl,RNase free ddH2O to 20 μl。qRT-PCR反應(yīng)程序:①50℃ 30 min,②95℃ 5 min,③95℃ 10 s,60℃ 30 s,45 cycs,④確定Real Time PCR的擴增曲線,制作標(biāo)準曲線。使用primer5.0軟件設(shè)計TIMP4和GAPDH的qRT-PCR反應(yīng)引物,由北京擎科生物公司合成。TIMP4上游引物:5’-CTAGAAACCAACAGTCAGAAGC-3’,TIMP4下游引物:5’-GTTCTGGTGGTAGTGATGATTC-3’;GAPDH上游引物:5’-GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG-3’,GAPDH下游引物:5’-ACTGTGAGGAGGGGAGATTCAGT-3’。

1.3.3 血清Ⅰ型前膠原羧基端肽(PⅠCP)、Ⅲ型前膠原羧基端肽(PⅢCP)表達水平測定:根據(jù)人PⅠCPELISA試劑盒(武漢華美生物,貨號:CSB-E08079h)、人PⅢCP ELISA試劑盒(武漢純度生物,貨號:CD-103108-ELA)說明書配制PⅠCP、PⅢCP的標(biāo)準品溶液,解凍血清樣本,多功能酶標(biāo)儀(德國BMG,型號:CLARIOstar Plus)測定PⅠCP、PⅢCP標(biāo)準品溶液及血清樣本在450 nm處的吸光度,繪制PⅠCP、PⅢCP標(biāo)準品回歸曲線。根據(jù)PⅠCP、PⅢCP的標(biāo)準品回歸曲線方程,計算血清PⅠCP、PⅢCP濃度水平。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較 對照組、陣發(fā)性房顫組、持續(xù)性房顫組的TNF-α和IL-21水平呈逐漸升高趨勢(P<0.05);3組間性別比、年齡、體重指數(shù)、左心房內(nèi)徑、左心室內(nèi)徑差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組間一般資料比較

2.2 3組血清TIMP4和心肌纖維化指標(biāo)PⅠCP、PⅢCP水平比較 與對照組和陣發(fā)性房顫組比較,持續(xù)性房顫組血清TIMP4水平顯著降低,血清PⅠCP、PⅢCP水平顯著升高(P<0.05);與對照組比較,陣發(fā)性房顫組血清TIMP4水平顯著降低,血清PⅠCP、PⅢCP水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 3組血清TIMP4、PⅠCP、PⅢCP水平比較

2.3 血清TIMP4水平與心肌纖維化指標(biāo)PⅠCP、PⅢCP相關(guān)性分析 心房顫動患者血清TIMP4水平與心肌纖維化指標(biāo)PⅠCP、PⅢCP均呈負相關(guān)(r=-0.513、-0.576,P<0.05)。見圖1、2。

圖1 TIMP4水平與心肌纖維化指標(biāo)PⅠCP相關(guān)性分析圖

圖2 TIMP4水平與心肌纖維化指標(biāo)PⅢCP相關(guān)性分析圖

2.4 多因素logistic回歸分析發(fā)生持續(xù)性心房顫動的影響因素 以心房顫動患者是否發(fā)生持續(xù)性心房顫動(是=1,否=0)為因變量,以血清TIMP4、PⅠCP、PⅢCP、TNF-α、IL-21水平作為自變量進行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示,高水平TIMP4為患者發(fā)生持續(xù)性心房顫動的獨立保護因素(P<0.05);高水平PⅠCP、PⅢCP、TNF-α均為患者發(fā)生持續(xù)性心房顫動的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 多因素logistic回歸分析發(fā)生持續(xù)性心房顫動的影響因素

3 討論

心房顫動因為許多患者無癥狀或癥狀稍縱即逝,難以記錄心律失常,導(dǎo)致診斷具有一定難度[10]。心肌纖維化是一個復(fù)雜的多因素和患者特異性過程,是心房顫動發(fā)生和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素,涉及心房顫動的發(fā)生和維持,分為間質(zhì)纖維化和替代纖維化[3, 4, 11]。最新報告表明,心臟纖維化存在性別差異,膠原蛋白Ⅲ在女性心臟中占主導(dǎo)地位,但在男性心臟中以膠原蛋白Ⅰ為主[8, 12]。研究顯示,IL-21是調(diào)節(jié)壓力負荷誘導(dǎo)的心肌重塑的關(guān)鍵物質(zhì),抑制IL-21的表達可以通過調(diào)節(jié)TIMP-4/MMP-9信號通路和心臟修復(fù)來提高壓力負荷后的炎癥消退,進而改善應(yīng)激超負荷誘導(dǎo)的小鼠心臟肥大和纖維化[13]。TNF-α水平升高與持續(xù)性心房顫動發(fā)病及術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)[14]。代菁等[15]研究顯示,炎性反應(yīng)可導(dǎo)致心房顫動和心肌纖維化。韓霜等[16]研究顯示,心力衰竭與心房顫動間相互作用與促進,因此炎性因子水平可間接反應(yīng)心房顫動嚴重程度。本研究發(fā)現(xiàn),心房顫動患者血清TNF-α、IL-21水平均顯著上調(diào),且高水平TNF-α為發(fā)生持續(xù)性心房顫動的獨立危險因素,提示炎性因子TNF-α和IL-21會加重心房顫動患者心肌纖維化,導(dǎo)致其病情加重。

大量研究顯示,TIMPs在心房顫動患者心肌纖維化過程中的作用至關(guān)重要。過往研究表明,TIMP-1水平在心房顫動患者中顯著增加,血清TIMP-1水平與心房顫動的進展有關(guān)[17]。TIMP2可能介導(dǎo)其抗纖維化作用,含有TIMP2的外泌體可以抑制心臟成纖維細胞的增殖和活化[18]。缺乏TIMP3在不同的動物模型中對心臟纖維化有不同的作用[11]。最新研究顯示,在心房顫動小鼠模型中TIMP4顯著下調(diào),通過抑制TIMP4可促進心房顫動中的心肌纖維化[19, 20]。本研究發(fā)現(xiàn),心房顫動患者血清TIMP4水平顯著下調(diào),且TIMP4與心肌纖維化指標(biāo)PⅠCP、PⅢCP水平呈負相關(guān),提示TIMP4水平下調(diào)會導(dǎo)致心房顫動患者心肌纖維化程度加重,與Li[19]和Ye等[20]研究結(jié)果一致。進一步研究發(fā)現(xiàn),高水平TIMP4為發(fā)生持續(xù)性心房顫動的獨立保護因素,高水平PⅠCP、PⅢCP均為患者發(fā)生持續(xù)性心房顫動的獨立危險因素,提示TIMP4在心房顫動疾病的進展中起著至關(guān)重要的作用,可能是未來治療心臟病的良好靶標(biāo)。

綜上所述,心房顫動患者血清TIMP4表達水平顯著降低,與患者心肌纖維化程度呈負相關(guān),高水平TIMP4為發(fā)生持續(xù)性心房顫動獨立保護因素。本研究未明確TIMP4參與心房顫動患者心肌纖維化的具體調(diào)控途徑,下一步可進行動物模型實驗對此進行深入研究。